靶向NF-κB的圈套ODNs拮抗pMφTNFα表达的实验研究

目的 本实验设计合成靶向NF κB的哑铃形圈套ODNs,并验证其抗TNFα生成效应。方法 以阳离子脂质体为载体 ,将圈套ODNs转染大鼠pM细胞 6小时后用LPS(脂多糖 ) 10 μg ml刺激 ,用ELISA法及RT PCR法测圈套ODNs对TNFα蛋白及mRNA水平的影响。结果 哑铃形圈套ODNs可明显降低TNFα在mRNA及蛋白水平的表达。结论 靶向NF κB的哑铃形圈套ODNs具有下调炎性介质TNFα的表达。

圈套ODNs影响IL-10表达的实验研究

目的本实验设计合成靶向核因子κB(NF-κB)的哑铃形圈套寡核苷酸(ODNs),并验证其对白介素10(IL-10)的作用。方法以阳离子脂质体为载体,将圈套ODNs转染大鼠pMф细胞6h后用LPS(10μg/m l)刺激,用ELISA法及RT-PCR法测圈套ODNs对IL-10在蛋白及mRNA水平的影响。结果哑铃形圈套ODNs可降低在IL-10mRNA及蛋白水平的表达。结论靶向NF-κB的哑铃形圈套ODNs具有抗IL-10的作用。

NF-κB靶向性哑铃形圈套寡核苷酸抑制肾小球系膜细胞TGF-β_1的表达

目的 :设计合成靶向NF κB的哑铃形圈套ODNs,并检测其对NF κB转录活性和肾小球系膜细胞TGF β1 表达的抑制效应 .方法 :采用电泳迁移率改变实验 (EMSA)体外检测哑铃形圈套ODNs对NF κB转录活性的抑制效应 .提取大鼠肾小球系膜细胞 ,随机分为正常对照组、LPS刺激组、哑铃形圈套ODNs处理组、无关圈套ODNs处理组和脂质体处理组 .采用阳离子脂质体将 2 ,4 ,8mg/L不同剂量哑铃形圈套ODNs转染大鼠肾小球系膜细胞 ,6h后用LPS刺激 ,收集转染后 8,1 2 ,1 8h上清和细胞 .用酶联免疫吸附试验 (ELISA)法检测上清TGF β1 蛋白表达 ,逆转录PCR(RT PCR)法检测TGF β1 mR NA转录 .结果 :哑铃形圈套ODNs在体外能有效地抑制NF κB与其顺式元件的结合 ;4 ,8mg/L剂量哑铃形圈套ODNs可明显抑制LPS诱导的大鼠肾小球系膜细胞TGF β1 转录和表达 .结论 :靶向NF κB的哑铃形圈套ODNs在体外可抑制NF κB的转录活性 ,从而对体外培养的肾小球系膜细胞炎性因子TGF β1

NF-κB靶向性哑铃形“圈套”寡核苷酸对海马神经元及神经元样细胞中COX-2表达的影响

目的设计合成靶向性NF-κB的哑铃形圈套ODNs,并检测其对神经元样细胞及海马神经元中NF-κB及环氧化酶-2(COX-2)的抑制作用。方法采用NF-κB靶向性哑铃形圈套ODNs转染培养的PC12细胞,用Western blot方法对PC12细胞内NF-κB和COX-2的蛋白表达进行分析;转染培养的海马神经元再经LPS刺激后,用RT-PCR法检测COX-2mRNA。结果经靶向性NF-κB哑铃形圈套ODNs处理的PC12细胞中NF-κB的表达明显降低(P<0.01),同时伴有COX-2表达明显减少(P<0.01);海马神经元中COX-2mR-NA的表达明显降低(P<0.01)。结论靶向性NF-κB的哑铃形圈套ODNs可抑制神经元样细胞及神经细胞中NF-κB和COX-2的表达,且NF-κB对COX-2具有调控作用。

NF-κB靶向性哑铃形“圈套”寡核苷酸体外抑制细胞因子表达效应的研究

目的设计合成靶向NF-κB的哑铃形“圈套”ODNs,并检测其对NF-κB转录活性和肾小球系膜细胞细胞因子(TNF-α和IL-6)表达的抑制效应。方法采用电泳迁移率改变实验(EMSA)体外检测哑铃形圈套ODNs对NF-κB转录活性的抑制效应。提取大鼠肾小球系膜细胞,随机分为正常对照组、LPS刺激组、哑铃形圈套ODNs处理组、无关圈套ODNs处理组和脂质体处理组。采用阳离子脂质体将2、4和8mg/L不同剂量哑铃形圈套ODNs转染大鼠肾小球系膜细胞,6h后用LPS刺激,收集转染后8、12和18上清和细胞。用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测上清细胞因子蛋白表达,逆转录PCR(RT-PCR)法检测细胞因子mRNA转录。结果哑铃形圈套ODNs在体外能有效地抑制NF-κB与其顺式元件的结合;4、8mg/L剂量哑铃形圈套ODNs可明显抑制LPS诱导的大鼠肾小球系膜细胞TNF-α和IL-6转录与表达。结论靶向NF-κB的哑铃形圈套ODNs在体外可抑制NF-κB的转录活性,从而对体外培养的肾小球系膜细胞细胞因子的表达具有抑制效应。

NF-κB靶向性哑铃形“圈套”寡核苷酸抑制肾小球系膜细胞IL-6的表达

目的 设计合成靶向NF κB的哑铃形“圈套”ODNs ,并检测其对NF κB转录活性和肾小球系膜细胞IL 6表达的抑制效应。方法 采用电泳迁移率改变实验 (EMSA)体外检测哑铃形圈套ODNs对NF κB转录活性的抑制效应。提取大鼠肾小球系膜细胞 ,随机分为正常对照组、LPS刺激组、哑铃形圈套ODNs处理组、无关圈套ODNs处理组和脂质体处理组。采用阳离子脂质体将 2、4、8mg L不同剂量哑铃形圈套ODNs转染大鼠肾小球系膜细胞 ,6h后用LPS刺激 ,收集转染后 8、12、18h上清和细胞。用酶联免疫吸附试验 (ELISA)法检测上清IL 6蛋白表达 ,逆转录PCR(RT PCR)法检测IL 6mR NA转录。结果 哑铃形圈套ODNs在体外能有效地抑制NF κB与其顺式元件的结合 ;4、8mg L剂量哑铃形圈套ODNs可明显抑制LPS诱导的大鼠肾小球系膜细胞IL 6转录和表达。结论 靶向NF κB的哑铃形圈套ODNs在体外可抑制NF κB的转录活性 ,从而对体外培养的肾小球系膜细胞炎性因子IL

NF-κB靶向性哑铃形“圈套”寡核苷酸对体外肾小球系膜细胞细胞因子表达的影响

目的:设计合成靶向NF-κB的哑铃形“圈套”ODNs,并检测其对NF-κB转录活性和肾小球系膜细胞细胞因子(TNF-α和IL-6)表达的抑制效应。方法:以NF-κB顺式作用元件κB序列为模板,设计包含两个拷贝的κB序列,长度为58个碱基的环状ODNS,合成后部分序列做FAM标记,行转集效率鉴定实验。采用电泳迁移率改变实验(EMSA)体外检测哑铃形圈套ODNs对NF-κB转录活性的抑制效应。提取大鼠肾小球系膜细胞,随机分为正常对照组、LPS刺激组、哑铃形圈套ODNs处理组、无关圈套ODNs处理组和脂质体处理组。采用阳离子脂质体将2、4、8mg/L不同剂量哑铃形圈套ODNs转染大鼠肾小球系膜细胞,6h后用LPS刺激,收集转染后8、12、18上清和细胞。用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测上清细胞因子蛋白表达,逆转录PCR(RT-PCR)法检测细胞因子mRNA转录。结果:阳离子脂质体可将哑铃形圈套ODNs高效转集入肾小球系膜细胞,哑铃形圈套ODNs在体外能有效地抑制NF-κB与其顺式元件的结合;4、8mg/L剂量哑铃形圈套ODNs可明显抑制LPS诱导的大鼠肾小球系膜细胞TNF-α和IL-6转录与表达。结论:靶向NF-κB的哑铃形圈套ODNs在体外可抑制NF-κB的转录活性,从而对体外培养的肾小球系膜细胞细胞因子的表达具有抑制效应。

NF-κB靶向性哑铃形“圈套”寡核苷酸对肾小球系膜细胞细胞因子表达的影响

目的 设计合成靶向 NF-κB的哑铃形圈套 ODNs,并检测其对 NF-κB转录活性和肾小球系膜细胞细胞因子 (IL - 6和 TGF-β1)表达的抑制效应。方法 采用电泳迁移率改变实验 (EMSA)体外检测哑铃形圈套 ODNs对 NF-κB转录活性的抑制效应。提取大鼠肾小球系膜细胞 ,随机分为正常对照组、L PS刺激组、哑铃形圈套 ODNs处理组、无关圈套 ODNs处理组和脂质体处理组。采用阳离子脂质体将 2、4、8mg/ L 不同剂量哑铃形圈套 ODNs转染大鼠肾小球系膜细胞 ,6 h后用 L PS刺激 ,收集转染后 8、12、18上清和细胞。用酶联免疫吸附试验 (EL ISA)法检测上清细胞因子蛋白表达 ,逆转录 PCR(RT- PCR)法检测细胞因子 m RNA转录。结果 哑铃形圈套 ODNs在体外能有效地抑制 NF-κB与其顺式元件的结合 ;4、8mg/ L剂量哑铃形圈套 ODNs可明显抑制 L PS诱导的大鼠肾小球系膜细胞 IL - 6和 TGF-β1 转录与表达。结论 靶向 NF- κB的哑铃形圈套 ODNs在体外可抑制 NF- κB的转录活性 。

针对SP1的圈套寡脱氧核苷酸抑制NIH_3T_3细胞活力和Ⅲα_1胶原基因表达的研究

目的:研究针对转录因子SP1的圈套寡脱氧核苷酸(Decoy-Oligodeoxynucleotide,Decoy-ODN)对小鼠胚胎成纤维细胞(NIH3T3)的活力和Ⅲα1胶原基因表达的影响,探讨圈套寡脱氧核苷酸用于病理性瘢痕基因治疗的可能性及机理。方法:设计合成针对SP1的特异性哑铃形Decoy-ODN。用阳离子脂质体转染NIH3T3细胞。分别用流式细胞仪检测ODN转染效率,激光共聚焦显微镜观察ODN在细胞中的分布,电泳迁移率变动分析(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)验证ODN与SP1的特异性结合。用WST-8检测ODN对细胞活力的影响。用RT-PCR检测ODN对细胞胶原基因表达的抑制作用。结果:分别转染25nM、50nM、100nM、150nM SP1 Decoy-ODN,48h后,细胞活力依次为0.9331±0.0203、0.7479±0.0868、0.577±0.0347、0.4703±0.0147;转染100nMSP1Decoy-ODN可明显抑制Ⅲα1胶原mRNA的表达(P<0.01),抑制效果达60%。结论:Decoy-ODN可以通过拮抗核转录因子SP1的活性而抑制NIH3T3细胞的活力和Ⅲα1胶原基因的表达。