ELISA检测土拨鼠肝炎病毒核心抗体方法的建立

目的建立检测土拨鼠肝炎病毒(WHV)核心抗体的ELISA方法,应用于WHV感染的中国旱獭动物模型的研究。方法原核表达重组WHcAg,氯化铯密度梯度离心获得非变性的纯化蛋白;用该纯化蛋白免疫Balb/c小鼠制备多克隆抗体;建立竞争抑制ELISA方法用于检测旱獭血清中的抗-WHc。结果纯化后的蛋白浓度达0.86mg/mL,纯度达89.48%;免疫小鼠后获得抗血清,ELISA间接法显示其多克隆抗体效价达1∶640000,Western blot分析显示该抗体能特异识别WHcAg;建立的竞争抑制ELISA方法对旱獭血清中可能存在的抗-WHc进行检测,诊断特异性及敏感性均较好,重复测定的批内变异系数和批间变异系数均小于10%。结论成功地建立检测旱獭血清中抗-WHc的竞争抑制ELISA方法。该方法具有稳定、简便、特异、敏感的特点,适用于大量旱獭血清抗-WHc的筛查工作,为进一步研究中国旱獭这一新型乙型肝炎病毒动物模型奠定了基础。

土拨鼠肝炎病毒核心蛋白质粒的构建、原核表达及多克隆抗体的制备与鉴定

目的构建土拨鼠肝炎病毒核心蛋白质粒并进行原核表达、抗体制备。方法应用基因工程技术将编码截短型土拨鼠肝炎病毒核心蛋白(WHcAg1～149aa)的基因片段装入原核表达载体pQE60上,在JM109菌内进行诱导表达,使用切胶回收及Ni-NTA柱两种方法纯化目的蛋白。将纯化蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,并采用酶联免疫吸附实验、免疫组织化学及Western blot检测抗体的灵敏度和特异性。结果成功地构建了含截短型土拨鼠肝炎病毒核心区基因的质粒并获得表达,经纯化得到了分子量约为16.5kD的重组核心蛋白,免疫家兔获得了高效价的特异性多克隆抗体,而且与HBcAg有交叉反应。结论获得的重组截短型土拨鼠肝炎病毒核心抗原(1～149aa)纯度高,免疫原性强。获得的兔抗-WHc效价高,特异性好,与HBcAg有交叉反应。

乙型肝炎病毒核心抗体水平与慢性乙型肝炎患者肝脏炎症、纤维化程度及抗病毒疗效关系的Meta分析

目的系统评估乙型肝炎病毒核心抗体(hepatitis B virus core antibody,HBcAb)水平与慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)患者肝脏炎症及纤维化程度的相关性,以及HBcAb能否作为CHB患者抗病毒疗效的预测指标。方法检索PubMed、Embase、Web of Science、The Cochrane Library、中国知网、万方、维普数据库建库至2022年10月发表的有关HBcAb的文献。使用R4.2.1软件进行Meta分析,横断面研究文献质量评价参照美国卫生保健质量和研究机构(the Agency for Healthcare Research and Quality,AHRQ)提出的文献质量评价标准,队列研究质量评价参照纽卡斯尔-渥太华量表(Newcastle-Ottawa Scale,NOS)。采用剔除异质性最大或权重最大的文献进行敏感性分析。采用漏斗图和Egger检验进行发表偏倚评估。结果纳入30篇文献进行系统评价,其中21篇文献纳入Meta分析。结果表明HBcAb水平越高,CHB患者肝脏炎症程度(Summary r=0.39,95%CI:0.30~0.48,P<0.05)和肝脏纤维化程度(Summary r=0.33,95%CI:0.22~0.43,P<0.05)均越高。ALT基本正常的CHB患者中HBcAb较低的患者发生肝脏炎症(G2~G4)的风险较高(OR=2.02,95%CI:0.64~6.38,P<0.05)。干扰素(interferon,IFN)治疗的CHB患者基线HBcAb水平越高,HBsAg阴转率越高(MD=0.34,95%CI:-0.12~0.80,P<0.05)。核苷(酸)类似物[nucleos(t)ide analogues,NAs]和IFN治疗的CHB患者基线HBcAb水平越高,HBeAg血清学转换率(MD=0.37,95%CI:0.26~0.49,P<0.05)和HBV DNA病毒学应答率(MD=0.30,95%CI:0.16~0.44,P<0.05)均越高。IFN治疗的CHB患者停药时HBcAb水平越高,临床治愈后复发率越低(MD=-0.74,95%CI:-1.00~-0.48,P<0.05)。结论HBcAb水平越高,CHB患者肝脏炎症程度及纤维化程度越高。较高的HBcAb水平可作为预测NAs或IFN抗病毒疗效的指标之一。

抗土拨鼠肝炎病毒核心蛋白单克隆抗体的制备、性质鉴定及初步应用

目的研制出能特异与土拨鼠肝炎病毒核心蛋白（WHc）结合的单克隆抗体,使之能特异性地对土拨鼠肝炎病毒（WHV）进行检测,并可能应用于相关肝炎病毒的筛查。方法以原核表达的土拨鼠肝炎病毒重组核心蛋白（WHc 1～149氨基酸）免疫BALB/c小鼠,常规杂交瘤技术进行细胞融合,有限稀释法克隆化,间接酶联免疫吸附试验（ELISA）和免疫组织化学（IHC）筛选、鉴定。结果筛选出5株（4B1E、6C5D、6C5C、6D1D、6D1G）能稳定分泌抗土拨鼠肝炎病毒核心蛋白抗体的杂交瘤细胞株。此5株单抗适用于ELISA、IHC、Western blot等方面的研究,与HBcAg有交叉反应,并且在部分中国旱獭的肝脏组织进行IHC检测呈现阳性反应。结论制备的5株单抗可用于土拨鼠肝炎病毒等嗜肝脱氧核糖核酸病毒的研究,可能在寻找新的相关肝炎病毒中起重要作用。

丙型肝炎病毒核心蛋白可溶性单链可变区抗体在大肠杆菌中的表达

利用分子生物学技术 ,构建表达丙型肝炎病毒 (HCV)核心蛋白的人源单链可变区抗体 (ScFv)的原核表达载体 ,并在大肠杆菌JM 10 9中表达可溶性的HCV core ScFv。以重组的HCV核心蛋白为包被抗原 ,利用噬菌体抗体库的表面展示技术 ,筛选到含有HCV core ScFv基因的噬菌体克隆。从噬菌体抗体阳性克隆中提取质粒 ,经NcoI/NotI酶切鉴定 ,该ScFv基因由 75 0bp组成。将其亚克隆到 pCANTAB5E表达载体中 ,转化大肠杆菌JM10 9,提取质粒进行DNA序列测定 ,符合ScFv的重链可变区和轻链可变区基因结构特点。IPTG诱导转化的大肠杆菌JM10 9,在其培养上清中获得了可溶性HCV core ScFv的表达。酶联免疫吸附法 (ELISA)证实表达的HCV core ScFv具有重组HCV核心蛋白的反应活性和特异性。对转化的JM10 9大肠杆菌上清中表达的HCV core ScFv进行聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE) ,证实表达的HCV core ScFv的分子量为 2 8kDa。为应用HCV core ScFv进行肝组织免疫组织化学和细胞内免疫基因治疗研究奠定了基础。

丙肝病毒核心抗原与丙肝抗体联合检测在丙型肝炎诊断中的应用

目的:通过检测丙型肝炎病毒RNA(HCV-RNA)、丙型肝炎病毒核心抗原(HCV-c Ag)、丙型肝炎抗体(HCV-Ab),探讨联合检测在丙肝诊断中的价值。方法:用ELISA方法对3 000例门诊及住院患者进行HCV-c Ag与HCV-Ab的联合检测,对单项阳性或两项均阳性者同时进行PCR法HCV-RNA检测。结果:3 000例患者中,进行HCV-c Ag与HCV-Ab联合检测,单项阳性或两项均阳性共45例,以HCV-RNA阳性作为分组标准,经HCV-RNA确证阳性39例,阴性6例,HCV-c Ag检测的阳性预测值为94.1%,HCV-Ab检测的阳性检出率为94.9%,两种方法联合检测可大大提高HCV临床检出率。结论 :HCV-c Ag检测与HCV-Ab检测能相互补充,两者联合检测更理想,能有效减少丙肝窗口期的漏检,有助于实现丙肝的早期防治,值得临床推广应用。

丙型肝炎病毒核心蛋白抗独特型人源单链可变区抗体的筛选与鉴定

为制备抗丙型肝炎病毒核心蛋白的抗独特型单链可变区抗体 (抗 IdscFv) ,采用噬菌体表面展示技术 ,将抗 HCV核心蛋白的单克隆抗体固相包被于Nunc板 ,从噬菌体单链可变区抗体库中经过 5轮“吸附 洗脱 扩增”筛选过程 ,获得可与HCV核心蛋白单克隆抗体结合的抗独特型人源单链可变区抗体的噬菌体集落。随机挑选 6 0个克隆 ,利用酶联免疫吸附法 (ELISA)、交叉反应和竞争抑制实验 ,对其进行免疫学检测和鉴定。获得与HCV核心蛋白单克隆抗体结合活性较强的抗 IdscFv阳性克隆 ,并对HCV核心蛋白特异性抗 IdscFv的编码序列进行测定分析。结果经过 5轮“吸附 洗脱 扩增”筛选 ,在随机挑选的 6 0个克隆中 ,有 2 0株克隆ELISA的吸光度(A4 5 0nm)值较高 ,这些噬菌体上清与牛血清白蛋白 (BSA)进行交叉反应后 ,确定了其中有 6株交叉反应较弱 ,结合 2次ELISA重复实验的A值及竞争抑制实验结果 ,最后确定 1株阳性克隆 ,提取质粒 ,进行DNA序列测定 ,DNA大小为 76 8bp。本实验结果提示用噬菌体抗体库技术能够成功地获得抗 HCV核心蛋白的抗 IdscFv ,为开展用抗

合成肽抗原ELISA检测丙型肝炎病毒核心抗体实验条件的初步探讨

自1989年获得丙型肝炎病毒(HCV)克隆并测出HCV RNA的大部分核苷酸序列以来,相继建立了HCV抗体测定和聚合酶链反应(PCR)检测HCV RNA的方法,使丙型肝炎的病原诊断取得突破性进展。目前所采用的重组抗原建立的酶联免疫吸附试验(ELISA)和重组免疫印迹法(RIBA)检测抗HCV存在着感染早期检出率低。

乙型肝炎病毒核心抗体临床意义再研究

目的分析化学发光微粒子免疫分析法检测乙型肝炎病毒核心抗体（HBcAb）在临床上的应用。方法收集2012年1月至2014年11月乙型肝炎两对半检测HBcAb阳性标本16 830份,根据HBcAb的cut off指数（COI值）将其分为3组：1.0~〈9.0组、9.0~〈11.0组、≥11.0组进行统计分析。对乙型肝炎表面抗原（HBsAg）与乙型肝炎表面抗体（HBsAb）均阴性且HBcAb的COI值大于或等于11.0的标本进行乙型肝炎病毒（HBV）DNA检测。结果 COI≥11.0组标本HBsAg（＋）HBsAb（-）检出率（13.84%）明显高于其他表现形式（P〈0.05）;COI值为9.0~〈11.0组各HBsAg、HBsAb表现形式检出率比较差异无统计学意义（P〉0.05）;COI值为1.0~〈9.0组标本HBsAg（＋）HBsAb（-）检出率（0.5%）明显低于其他2组（P〈0.05）。HBsAg（-）HBsAb（-）且COI≥11.0的标本304份,其中HBV DNA阳性64份,阳性率为21.0%。结论 HBcAb检测中,COI≥11和1.0~〈9.0可分别作为判断HBV现症感染和既往感染的参考指标,临床应用时应联合HBV的其他实验室标志物并结合临床综合分析。

截短型鸭乙型肝炎病毒核心蛋白原核表达、多克隆抗体的制备和鉴定

目的：构建截短型鸭乙型肝炎病毒（DHBV）核心蛋白的原核表达质粒并在大肠杆菌中表达，制备多克隆抗体。方法：应用基因工程技术将编码截短型DHBV核心蛋白（DH-BcAg 1～214aa）的基因片段装入原核表达载体pRSET-B内，在宿主菌Rosetta（DE3）pLacI内进行诱导表达，运用Ni-NTA方法纯化目的蛋白。用纯化的重组蛋白免疫BALB／c小鼠制备多克隆抗体，并采用酶联免疫吸附实验（ELISA），Western blot及免疫组化检测抗体的灵敏度和特异性。结果：成功地构建了含截短型DHBV核心区基因的质粒，并纯化得到了相对分子质量（Mr）约为28000的目的蛋白，用之免疫BALB／c小鼠获得了高效价的特异性多克隆抗体。结论：获得的重组截短型DHBV核心抗原纯度高，免疫反应性强；获得的多克隆抗体有较高的效价和较好的特异性，为DHBV的检测和研究奠定了实验基础。

乙型肝炎病毒核心IgM抗体检测在乙型肝炎患者中的意义

目的探讨乙型肝炎病毒核心IgM抗体(抗-HBc-IgM)检测在乙型肝炎(乙肝)患者中的意义。方法采用酶联免疫吸附试验,检测234例乙肝患者血清中的抗-HBc-IgM。结果乙肝病毒表面抗原(HBsAg)、乙肝病毒e抗原(HBeAg)和乙肝病毒核心抗体(抗-HBc)阳性患者组抗-HBc-IgM阳性率为31.0%(31/100),HBsAg、乙肝病毒e抗体(抗-HBe)和抗-HBc阳性患者组抗-HBc-IgM阳性率为17.0%(17/100),其他乙肝病毒标志物阳性患者组抗-HBc-IgM阳性率为5.9%(2/34)。结论抗-HBc-IgM检测对于明确乙肝患者的感染病程以及患者的病情、预后评估具有重要的意义。

抗丙型肝炎病毒核心蛋白单链抗体的制备及免疫组织化学研究

目的 制备丙型肝炎病毒核心蛋白单链抗体并进行免疫组织化学研究。方法 以大肠杆菌表达的重组丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白为固相抗原 ,利用抗原 抗体亲和性结合的原理 ,从半合成的人源可变区噬菌体抗体库中经过 3轮“吸附 洗脱 扩增”的筛选过程及酶联免疫吸附试验 (ELISA)和DNA序列分析 ,获得HCV核心蛋白的人源单链抗体 ;用该抗体对 772 1转染全长HCVcDNA后筛选的阳性克隆细胞中的HCV核心蛋白抗原进行免疫组化鉴定。结果 ELISA结果表明 ,制备的HCV核心蛋白人源单链抗体能与HCV核心蛋白抗原特异性结合 ;免疫组化结果表明 ,该抗体能够特异性识别HCV核心蛋白抗原 ,与正常肝细胞无交叉反应。结论 此法制备单链抗体方法简便 ,周期短 ,可为HCV核心蛋白病原的检测提供新的检测手段。

酶免疫竞争一步法检测乙型肝炎病毒核心抗体的影响因素探讨

探讨乙型肝炎病毒核心抗体检测的影响因素,排除假阳性结果。实验表明:1.改进二步法可以作为一种消除一步法中假阳性结果的有效办法。2.时差操作是假阳性增高的重要原因。

丙型肝炎病毒核心蛋白人源抗独特型单链抗体在大肠杆菌中的表达

目的 在大肠杆菌中表达丙型肝炎病毒核心蛋白人源抗独特型单链抗体。方法 采用噬菌体表面展示技术 ,将丙型肝炎病毒 (HCV)核心蛋白单克隆抗体固相包被于Nunc板。从人源噬菌体单链可变区抗体库中经过 3轮“吸附 洗脱 扩增”的筛选 ,获得结合活性较强的人源HCV核心蛋白抗独特型 (抗 Id)scFv阳性克隆。从阳性克隆中提取质粒 ,经SfiⅠ/NotⅠ酶切鉴定后 ,亚克隆到pCANTAB5E载体 ,转化大肠杆菌XL1 Blue ,应用异丙基硫代 β D 半乳糖苷 (IPTG)诱导表达可溶性的HCV核心蛋白抗独特型单链可变区抗体。酶联免疫吸附法 (ELISA)证实表达的HCV核心蛋白抗 IdscFv具有与HCV核心蛋白单克隆抗体反应的特异性。对转化的大肠杆菌XL1 Blue上清中表达的HCV核心蛋白抗 IdscFv进行硫酸铵沉淀 ,并进行SDS PAGE电泳。结果 筛选得到的HCV核心蛋白抗 IdscFv片段基因由 774bp组成。SDS PAGE电泳表明 ,大肠杆菌XL1 Blue中表达的可溶性HCV核心蛋白抗 IdscFv分子量约 2 8kD。结论 HCV核心蛋白抗 IdscFv与HCV核心蛋白抗 IdscFv单克隆抗体具有较强的结合活性和特异性。HCV核心蛋白抗 IdscFv的筛选和表达成功 ,为今后HCV核心蛋白抗 IdscFv的研究和应用奠定了基础。

乙型肝炎病毒核心抗体变色稀释液的配制及应用

目的探讨一种适合临床应用的乙型肝炎病毒核心抗体(抗-HBc)变色稀释液的配制。方法从近中性的指示剂中选择一种酸碱指示剂配成应用浓度的变色稀释液,用无色和变色稀释液同时检测抗-HBc。结果无色和变色稀释液检测抗-HBc时阴性和阳性结果完全一致,两者的直线相关性好(r=0.995,P>0.05)。结论变色稀释液应用于临床,增加了实验的可靠性,提高了实验效率,避免误诊和漏诊。

重组丙型肝炎病毒核心蛋白的原核表达、纯化和抗体制备

本文旨在获得纯化丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白(HCV-C)及抗HCV-C多克隆抗体,为深入研究HCV-C与肝细胞相互作用的分子机制奠定基础。首先以HCV1b亚型HC-J4-91全基因组质粒为模板,聚合酶链反应(PCR)扩增HCV-C基因,构建重组质粒pQE31-HCV-C。融合蛋白经原核表达、纯化后,免疫BALB/c小鼠,制备抗HCV-C多克隆抗体。利用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测抗体效价,蛋白免疫印迹(Westernblot)和间接免疫荧光染色鉴定抗体特异性。结果显示,表达HCV-C的原核表达质粒pQE31-HCV-C构建正确,获得相对分子质量约22000的纯化融合蛋白。ELISA检测重组蛋白免疫小鼠的抗血清效价达1:12800。结果显示,自制的抗HCV-C多克隆抗体能特异性识别HCV-C。本研究获得了纯度较好、原核表达的HCV-C,并成功制备了抗HCV-C多克隆抗体,为深入研究HCV-C的致病机制提供了有实用价值的研究工具。

单项乙型肝炎病毒核心抗体阳性的原因及其临床意义

目的分析血清单项乙型肝炎病毒核心抗体阳性的可能原因并探讨其临床意义。方法收集酶联免疫吸附竞争一步法检测的500例单项乙型肝炎病毒核心抗体阳性血清,用微粒子酶免疫法进行验证。分析单项乙型肝炎病毒核心抗体阳性血清的丙型肝炎病毒抗体、人类免疫缺陷病毒抗体及乙型肝炎病毒DNA。结果在酶联免疫吸附竞争一步法检测的单项乙型肝炎病毒核心抗体阳性血清中,用微粒子酶免疫法进行检测显示乙型肝炎病毒核心抗体阳性率仅为67.2%。单项乙型肝炎病毒核心抗体阳性标本中丙型肝炎病毒抗体阳性率为5.36%;可检测到乙型肝炎病毒DNA为3.87%,DNA拷贝数为(159±64)copies/ml;未发现人类免疫缺陷病毒抗体阳性。结论酶联免疫吸附竞争一步法检测乙型肝炎病毒核心抗体存在一些假阳性结果。隐性乙型肝炎病毒感染、丙型肝炎病毒感染是血清单项乙型肝炎病毒核心抗体阳性的原因。

三种方法检测乙型肝炎病毒核心抗体结果的比较

目的比较酶联免疫吸附试验(ELISA)、微粒子酶免分析(MEIA)、电化学发光免疫分析(ECLIA)三种方法检测乙型肝炎病毒核心抗体(抗HBc)的结果,探讨ELISA检测抗HBc结果的正确性。方法用ELISA筛选出100例抗HBc阳性标本和60例抗HBc阴性标本,分别用MEIA和ECLIA检测。将ELISA筛选出的100例抗HBc阳性标本1∶30稀释,再分别用ELISA、MEIA和ECLIA检测。结果(1)100例ELISA检测抗HBc阳性标本,MEIA、ECLIA检测阳性率100%;60例ELISA检测抗HBc阴性的标本,MEIA、ECLIA检测阳性率分别为60%、(36/60)、53%(32/60);MEIA和ECLIA检测抗HBc的结果与ELISA有显著性差异,P值均<0.05。(2)100例ELISA检测抗HBc阳性标本1∶30稀释后,ELISA、MEIA和ECLIA检测阳性率分别为38%、74%和68%。结论MEIA、ECLIA检测抗HBc的阳性率明显高于ELISA。100例ELISA检测抗HBc阳性标本1∶30稀释后用ELISA、MEIA和ECLIA检测,三者阳性率均下降。