4种终末宿主土耳其斯坦东毕吸虫cox1和nad1基因的序列分析

收集黑龙江省大庆地区牛源、绵羊源、绒山羊源和山羊源土耳其斯坦东毕吸虫，以SDS-蛋白酶K法抽提其基因组DNA，用特异性引物通过PCR扩增土耳其斯坦东毕吸虫成虫细胞色素C氧化酶亚基1基因（coxl）和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶亚基1基因（nad1）并进行测序，应用Chromas和DNAStar软件分析扩增产物的变异情况。结果表明，大庆地区4种终末宿主土耳其斯坦东毕吸虫cox1基因均为1125bp，nad1基因均为518bp；且其线粒体基因存在差异，coxl的同源性为99．0％～99．7％，nad1的同源性为98．3％～99．4％。

牛羊源土耳其斯坦东毕吸虫ITS和28S rDNA-LSU序列分析

目的探讨牛羊源土耳其斯坦东毕吸虫(Orientobilharzia turkestanicum)核糖体内转录间隔区(ITS)和28S核糖体大亚基序列(rDNA-LSU)的差异。方法粪便检查、剖杀自然感染东毕吸虫的绒山羊、山羊、绵羊和黄牛,收集虫体,形态学鉴定为土耳其斯坦东毕吸虫。抽提成虫基因组DNA,扩增其ITS(包括ITS-1、5.8S rDNA和ITS-2)和28S rDNA-LSU序列,测序并分析以上序列,以及28S rDNA-LSU序列RNA二级结构。结果牛、羊源土耳其斯坦东毕吸虫的ITS-1、5.8S rDNA、ITS-2和28S rDNA-LSU序列分别长384、159、331和1304bp。牛源和羊源的ITS-1和5.8S rDNA序列完全相同;黄牛源、绵羊源和绒山羊源的ITS-2序列完全相同,与山羊源存在1个碱基的差异;绵羊源和绒山羊源的28S rDNA-LSU序列完全相同,与牛源和山羊源分别有2个碱基的差异。绵羊源和绒山羊源的28S rDNA-LSU序列RNA二级结构相同,与山羊源存在微小差异,但牛源与羊源存在较大差异。结论不同终末宿主源土耳其斯坦东毕吸虫的核糖体序列存在不同程度的差异,羊源28S rDNA-LSU序列的RNA二级结构相同或相似,但与牛源存在较大差异。

土耳其斯坦东毕吸虫原肌球蛋白基因的原核表达

将pGEM-TM质粒上的土耳其斯坦东毕吸虫原肌球蛋白(TM)基因片段亚克隆至原核表达载体pET28a(+),重组的pET28-TM在大肠埃希氏菌BL21(DE3)中经1 mmol/L IPTG诱导表达出一37.5 ku的融合蛋白。该蛋白经Ni-NTA亲和层析柱纯化,SDS-PAGE检测,出现与目的蛋白大小一致的单一条带。Western-blotting检测结果表明,纯化的蛋白可被自然感染东毕吸虫的山羊血清识别,这为进一步研究东毕吸虫基因工程疫苗奠定了基础。

土耳其斯坦东毕吸虫成虫cDNA文库的构建

按照SMARTcDNA文库构建试剂盒说明 ,以TRIZOL试剂提取的土耳其斯坦东毕吸虫成虫总RNA为模板 ,以含SfiⅠB酶切位点的oligo(dT)为引物反转录合成第一链cDNA ,利用含SfiⅠA酶切位点的SMART核苷酸作为cDNA第一链在mRNA 5’端延伸出去的模板 ,采用LD -PCR技术以改良的oligo(dT)引物合成双链cDNA ,经蛋白酶K和SfiⅠ消化后 ,过CHROMASPIN - 4 0 0柱进行分级分离。双链cDNA与载体λTripEx2两臂连接 ,体外包装后构建成土耳其斯坦东毕吸虫成虫的cDNA噬菌体表达文库。经测定文库容量为 6 38× 10 6,文库扩增后的滴度为 3 4 8× 10 10 (Pfu/ml) ,PCR测定的重组率为 92 %。各项指标表明 ,我们成功的构建了高质量的cDNA文库 ,为进一步筛选、克隆保护性抗原基因奠定了基础。

土耳其斯坦东毕吸虫结节变种尾蚴皮层的超微结构观察

本文对土耳其斯坦东毕吸虫结节变种尾蚴皮层的超微结构进行了描述。尾蚴皮层从外向内由糖蛋白膜、外质膜、皮层基质、基质膜、基底膜组成。皮层基质为一较厚的致密层,无细胞界线及其它亚细胞结构,充满致密的细颗粒性物质。此层厚度变化较大,而致虫体表面凸凹不平。有两型致密体分布于皮层基质中。

中华血吸虫和土耳其斯坦东毕吸虫结节变种扫描电镜观察及与其它血吸虫的比较

中华血吸虫和土耳其斯坦东毕吸虫结节变种分别收集于四川和黑龙江省 ,按常规电镜方法处理后 ,以日立 JSM- 80 0扫描电镜观察并摄片。观察显示中华血吸虫体表无结节 ,其雄性成虫体表结构近似于日本血吸虫等亚洲血吸虫 ,与文献描述的采集于泰国的中华血吸虫也无明显差异。观察同时表明土耳其斯坦东毕吸虫结节变种与程氏东毕吸虫基本无差别 ,二者的感觉球种类与土耳其斯坦东毕吸虫一致 ,但数目较后者为多。同时结合已发表的有关裂体属血吸虫 SEM研究结果 ,对裂体属血吸虫 SEM超微结构特点列表进行了比较。按照 Rollinson的分组方法 ,中华血吸虫属于无结节组 ,而东毕吸虫属于不带棘的有结节组。

基于线粒体nad4基因探讨土耳其斯坦东毕吸虫的系统发生位置

为探讨土耳其斯坦东毕吸虫在血吸虫中的系统发生位置,本研究设计一对特异性引物,通过PCR方法对土耳其斯坦东毕吸虫(绵羊源)线粒体烟酰胺脱氢酶亚基Ⅳ基因(nad4)进行扩增和测序分析,并与GenBank中相关血吸虫nad4基因进行比对。结果显示,本研究克隆的该吸虫线粒体nad4基因序列大小约为1030bp,与已发表的其它血吸虫线粒体nad4基因的同源性为51.6%～66.7%,其系统发生位置属于非洲血吸虫种群。

土耳其斯坦东毕吸虫磷酸丙糖异构酶基因的克隆及在毕赤酵母中的表达

利用RT-PCR技术从土耳其斯坦东毕吸虫(Orientobilharzia turkestanicum)成虫总RNA中扩增磷酸丙糖异构酶基因(TPI),鉴定后将目的片段与毕赤酵母表达载体pPIC9k连接,构建重组表达质粒pPIC9k-TPI,并将其电击转化到毕赤酵母GS115中,重组菌株经甲醇诱导后表达的TPI蛋白,经SDS-PAGE、western-blotting检测,并利用葡聚糖凝胶层析柱纯化。结果显示,成功地克隆了土耳其斯坦东毕吸虫TPI；重组毕赤酵母表达了分子质量为43 ku的TPI蛋白；葡聚糖凝胶层析过滤得到单一的TPI蛋白。

土耳其斯坦东毕吸虫肌动蛋白基因的克隆及其序列分析

目的利用RTPCR和RACE技术克隆土耳其斯坦东毕吸虫肌动蛋白基因全长序列并进行序列分析。方法根据日本血吸虫和曼氏血吸虫肌动蛋白基因的保守区设计引物,利用RTPCR扩增出土耳其斯坦东毕吸虫的肌动蛋白基因的大片段,再结合RACE技术分别得到肌动蛋白的3’端和5’端,将三部分序列拼接后获得肌动蛋白基因的全长cDNA序列并进行序列分析。结果成功克隆了土耳其斯坦东毕吸虫肌动蛋白的全长cDNA并提交GenBank,登录号为DQ017265,核酸序列比对表明东毕吸虫肌动蛋白基因的核苷酸序列和日本血吸虫、曼氏血吸虫的同源性分别为90%和91%。结论土耳其斯坦东毕吸虫肌动蛋白的全长cDNA的克隆为进一步表达及其生物学性能的分析提供了理论基础。

土耳其斯坦东毕吸虫磷酸丙糖异构酶基因的克隆及其序列分析

目的克隆土耳其斯坦东毕吸虫磷酸丙糖异构酶的全长基因。方法根据日本血吸虫和曼氏血吸虫磷酸丙糖异构酶基因的保守区设计引物,利用RT-PCR扩增出土耳其斯坦东毕吸虫磷酸丙糖异构酶基因的大片段,再结合RACE技术分别得到磷酸丙糖异构酶基因的3′端和5′端,将3部分序列拼接后获得磷酸丙糖异构酶基因全长cDNA序列,并提交GenBank。结果成功克隆了土耳其斯坦东毕吸虫磷酸丙糖异构酶基因全长cDNA序列并提交GenBank,登录号为DQ092331。结论土耳其斯坦东毕吸虫磷酸丙糖异构酶基因全长cDNA的克隆为进一步表达及其生物学性能的分析提供了理论基础。

土耳其东毕吸虫原肌球蛋白基因的克隆

根据日本血吸虫原肌球蛋白cDNA序列和曼氏血吸虫的原肌球蛋白cDNA序列M27512的保守区设计引物,采用RT-PCR方法,成功克隆了土耳其东毕吸虫的原肌球蛋白全长cDNA序列。测序结果表明,TM序列全长1125bp,5'非翻译区为1bp～124bp,3'非翻译区为980bp～1125bp,开放阅读框为125bp～979bp,编码284个氨基酸。将该序列与其他血吸虫的序列进行同源性比较,结果与埃及血吸虫的TM同源性为90%,与曼氏血吸虫、日本血吸虫的TM同源性均为88%,该基因已经提交GenBank,序列号为AY560898。

血吸虫病原和宿主关系的研究 Ⅱ.萝卜螺感染东毕血吸虫等幼虫期的组织学和组织化学研究

在内蒙古呼伦贝尔草原牧场检获感染有斜睾总科吸虫幼虫期及其和土耳其斯坦东毕吸虫两种吸虫幼虫期双重感染的萝卜螺,对它们分别进行了组织学和组织化学观察。斜睾总科剑尾型尾蚴体壁皮层下及腹吸盘前各含有分泌酸性粘液及含糖类物质的单细胞腺体,在尾蚴成熟过程中,腹吸盘前标准阿新蓝阳性腺体分泌物逐渐排向体表最外层,体周皮层下分泌PAS反应阳性物质在其下形成不连续的一层。对保护尾蚴免受损伤,适应外界不良环境可能具有重要作用。在两种吸虫幼虫期双重感染的萝卜螺中,剑尾型尾蚴处于成熟前期,东毕吸虫则完全发育成熟,双重感染时寄生部位和各自单独感染一致,两种吸虫幼虫期在消化腺中各自成簇,呈镶嵌型分布,也存在迭加,但在不同的小区域内分布密度有所不同。双重感染的螺,其消化腺受到严重破坏,生殖腺几近消失,表明两种吸虫双重感染主要表现为对螺宿主提供有限空间和营养的竞争。