圣草素促进成骨细胞自噬减轻糖皮质激素诱导的细胞凋亡

背景:糖皮质激素诱导的骨质疏松症是系统性糖皮质激素治疗的常见并发症,主要表现为对成骨细胞的抑制作用。圣草素可抑制破骨细胞分化和卵巢切除术引起的骨质疏松,然而,圣草素是否调节糖皮质激素诱导的成骨细胞凋亡尚不清楚。目的:探究圣草素是否在地塞米松诱导的成骨细胞凋亡中发挥作用,及其潜在的作用机制。方法:采用不同浓度(0,0.5,1,2.5,5,10μmol/L)的圣草素或自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(5μmol/L)处理地塞米松预处理的成骨细胞MC3T3‐E1,然后用血红素加氧酶1的过表达载体(pcDNA-HMOX1)和空载体(pcDNA vector)转染MC3T3‐E1细胞。分别采用CCK-8和流式细胞术检测细胞活力和凋亡;采用ELISA检测半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3活性;采用Western blotting检测自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、p62、Atg5和Atg12表达,凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2的表达,以及AMP蛋白激活激酶(AMPK)和p-AMPK蛋白表达。结果与结论:①低浓度的圣草素对MC3T3-E1细胞无毒性,且促进细胞增殖,并以剂量依赖性的方式促进自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、p62、Atg5和Atg12表达,降低半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3活性,抑制Bax蛋白表达,促进Bcl-2蛋白表达,减少地塞米松诱导的MC3T3-E1细胞凋亡;②此外圣草素可显著促进成骨细胞中血红素加氧酶1的表达;过表达血红素加氧酶1促进AMPK磷酸化,激活自噬,抑制地塞米松诱导的成骨细胞凋亡;③而3-甲基腺嘌呤处理抵消了血红素加氧酶1过表达对MC3T3-E1细胞的影响;④提示低浓度圣草素对成骨细胞无毒性,可以通过上调血红素加氧酶1的表达激活AMPK信号通路,从而促进自噬,抑制地塞米松诱导的成骨细胞凋亡;圣草素具有治疗糖皮质激素诱导骨质疏松症的巨大潜力。

圣草酚对角质形成细胞和黑色素瘤细胞共培养体系中黑色素合成的促进作用

为了研究圣草酚对角质形成细胞(HaCaT)与黑色素瘤细胞(B16)共培养体系中细胞增殖、酪氨酸酶活性、黑色素含量以及酪氨酸酶(TYR)、酪氨酸相关蛋白1(TRP-1)、酪氨酸相关蛋白2(TRP-2)mRNA表达的影响,建立了HaCaT细胞与B16细胞体外共培养体系模拟“表皮黑色素形成单位”,分别采用MTT法测定细胞增殖率、多巴氧化速率法测定细胞酪氨酸酶激活率、氢氧化钠裂解法测定细胞黑色素合成率、实时荧光定量PCR法测定TYR、TRP-1、TRP-2的基因相对表达量。结果表明,圣草酚在低浓度下对共培养体系中的细胞无毒性作用,而且有明显的促增殖作用;12.5~50μmol·L^(-1)圣草酚对共培养体系中细胞酪氨酸酶活性有激活作用(P<0.001),并呈剂量依赖性;12.5~50μmol·L^(-1)圣草酚能显著提高共培养体系中细胞黑色素合成率(P<0.01或P<0.0001);12.5~50μmol·L^(-1)圣草酚能显著提高共培养体系中TYR的基因相对表达量(P<0.01或P<0.001),25~50μmol·L^(-1)圣草酚能显著提高共培养体系中TRP-1、TRP-2的基因相对表达量(P<0.01)。圣草酚可能通过促进TYR、TRP-1、TRP-2的mRNA表达来促进共培养体系中细胞酪氨酸酶活性提升和黑色素合成。

圣草酚对DOCA/Salt高血压肾脏损害的保护作用

目的探讨圣草酚(eriodictyol,ERD)对高血压小鼠肾脏损害的保护作用及可能机制。方法将30只C57BL/6J小鼠随机分为5组,每组6只。分别为对照组(Ctrl)、高血压模型组(DOCA/Salt)、圣草酚低剂量(DOCA/Salt+ERD-L)、高剂量(DOCA/Salt+ERD-H)及阳性药培哚普利组(DOCA/Salt+Perindopril)。通过DOCA/Salt诱导经典的高血压模型,ERD持续给药4周,检测血压、血清尿素氮、肌酐等指标;苏木精-伊红染色(HE)、Masson染色观察肾脏病理学变化;Western blot检测肾脏上皮间充质转化EMT标志蛋白α-SMA、Vimentin、E-cadherin和FN的表达;Real-Time PCR检测肾脏炎症因子Nlrp3、TNF-α、IL-1β、IL-18、MCP-1和NADPH氧化酶(NOXs)的表达。通过Western blot检测小鼠TGF-β1、磷酸化(p)-Smad2、TLR4、NF-κB p65蛋白的表达水平。结果ERD干预能延缓高血压的发生,改善肾脏组织病理损伤,减轻肾脏胶原沉积,降低肾脏炎症和氧化应激水平,改善EMT蛋白水平,明显降低TGF-β1、p-Smad2、TLR4、NF-κB p65蛋白表达。结论ERD对DOCA/Salt高血压肾脏损害有明显保护作用,其机制可能与调控TGF-β1/Smad2、TLR4/NF-κB p65等信号通路有关。

圣草酚咀嚼片的制备及质量评价

目的制备圣草酚咀嚼片,并对其进行质量评价。方法选择微晶纤维素(MCC)和甘露醇为填充剂,聚乙烯吡咯烷酮(PVP)为黏合剂,柠檬酸和三氯蔗糖为矫味剂,硬脂酸镁为润滑剂,以湿法制粒法制备咀嚼片;以各辅料的用量为因素,以外观、口感、风味、质地为指标对圣草酚咀嚼片进行综合评分,利用正交实验方法优选圣草酚咀嚼片的辅料配比,并对采用优选处方制得的圣草酚咀嚼片的外观性状、重量差异、硬度、脆碎度、圣草酚含量、溶出度、含量均匀度进行评价。结果最佳处方为圣草酚26.4%(每片含50 mg)、甘露醇45%、MCC 25%、柠檬酸0.3%、三氯蔗糖0.3%、硬脂酸镁1%、PVP 2%(以纯化水配制成5%的溶液)。处方验证实验中3批圣草酚咀嚼片的综合评分分别为8.76、8.75、8.80(RSD=0.30%,n=3)。制得的圣草酚咀嚼片外观完整,表面光洁;平均片重为192.57 mg,平均硬度为57.36 N,脆碎度为0.09%,平均每片圣草酚含量为50.74 mg,30 min累积溶出度超过80%,含量均匀度为5.51。结论本研究优化处方所制圣草酚咀嚼片符合2020年版《中国药典》的相关要求。

圣草次苷调节Nrf2/NQO-1/HO-1/NF-κB信号通路对颈动脉粥样硬化的影响

目的探究圣草次苷对颈动脉粥样硬化(CAS)大鼠氧化应激和炎症反应的影响,并探讨其作用机制。方法将大鼠随机分为对照组、模型组、圣草次苷低剂量组、圣草次苷中剂量组、圣草次苷高剂量组、圣草次苷高剂量+Brusatol组,每组10只。构建CAS大鼠模型,检测各组大鼠血脂指标三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C),苏木精-伊红(HE)染色观察颈动脉组织病理变化,油红O染色观察颈动脉组织脂质堆积情况,试剂盒检测氧化应激指标丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT),酶联免疫吸附试验检测活性氧(ROS)及炎性细胞因子白细胞介素(IL)-1β、IL-10、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平,蛋白质免疫印迹法检测核因子E2相关因子2(Nrf2)/醌氧化还原酶1(NQO1)/血红素加氧酶1(HO-1)/核转录因子κB(NF-κB)信号通路蛋白表达。结果与对照组相比,模型组大鼠颈动脉组织内膜增厚,动脉粥样硬化斑块和脂质沉积增加,TG、TC、LDL-C、脂质堆积比例、IL-1β、TNF-α、MDA、ROS、p-NF-κB、p65/NF-κB p65水平上升,HDL-C、IL-10、SOD、CAT、p-Nrf2/Nrf2、NQO-1、HO-1下降(P<0.05);与模型组相比,圣草次苷低、中、高剂量组颈动脉组织内膜相对完整,动脉粥样硬化斑块和脂质沉积减少,TG、TC、LDL-C、脂质堆积比例、IL-1β、TNF-α、MDA、ROS、p-NF-κB p65/NF-κB p65水平下降,HDL-C、IL-10、SOD、CAT、p-Nrf2/Nrf2、NQO-1、HO-1上升(P<0.05);Brusatol逆转圣草次苷对CAS大鼠氧化应激和炎症反应的改善(P<0.05)。结论圣草次苷能调节CAS大鼠的血脂水平,抑制炎症反应和氧化应激,其作用机制可能与调节Nrf2/NQO-1/HO-1/NF-κB信号通路有关。

圣草酚对脓毒症致大鼠急性肾损伤的保护作用及机制研究

目的:探讨圣草酚对脓毒症急性肾损伤(SAKI)大鼠的影响,并阐明其作用机制。方法:采用盲肠结扎穿孔术建立脓毒症大鼠模型,将造模成功的大鼠随机分成模型组、圣草酚低剂量组、圣草酚高剂量组和圣草酚高剂量+核因子E2相关因子2(Nrf2)抑制剂组,另设置假手术组,每组10只。于造模前2 d开始给予圣草酚和Nrf2抑制剂预处理,持续干预3 d。术后24 h,生化法检测血清肌酐(Scr)、血尿素氮(BUN)水平;ELISA检测血清中IL-1β、IL-6浓度及肾组织中丙二醛(MDA)含量及超氧化物歧化酶(SOD)活性水平;HE染色观察肾组织病理学变化;荧光探针染色法检测大鼠肾组织活性氧(ROS)水平;Western blot检测大鼠肾脏组织中Nrf2和血红素加氧酶1(HO-1)蛋白表达水平。结果:与假手术组比较,模型组大鼠血清中Scr、BUN、IL-1β和IL-6水平显著升高(P<0.05),肾组织损伤严重,肾小管损伤评分显著升高(P<0.05),肾组织中ROS水平升高,SOD活性及Nrf2和HO-1蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。与模型组比较,圣草酚高剂量组血清中Scr、BUN、IL-1β和IL-6水平显著降低(P<0.05),肾组织损伤减轻,肾小管损伤评分显著降低(P<0.05),肾组织中ROS水平降低,SOD活性及Nrf2和HO-1蛋白表达水平显著升高(P<0.05),而圣草酚低剂量组各指标差异无统计学意义(P>0.05)。Nrf2抑制剂逆转了高剂量圣草酚对SAKI大鼠氧化应激和炎症反应的抑制作用(P<0.05)。结论:圣草酚预处理可抑制SAKI大鼠氧化应激和炎症水平,减轻肾脏损伤,其作用机制与激活Nrf2/HO-1信号通路有关。

圣草酚通过miR-128-3p/MAPK轴对乳腺癌细胞增殖、凋亡的影响

目的圣草酚是一种重要的类黄酮,普遍存在于植物界,但少有对圣草酚的抗癌活性的报道。该研究旨在探究其对人乳腺癌(breast cancer,BC)的抗癌潜力及可能的机制。方法体外培养人乳腺癌细胞MCF-7和人乳腺上皮细胞FR2,通过MTT法检测圣草酚诱导的初始细胞毒性。再次培养MCF-7细胞,MTT法和集落形成实验评估圣草酚对MCF-7细胞增殖的影响;流式细胞术评估圣草酚对MCF-7细胞凋亡和线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,MMP)的作用;RT-qPCR和Western Blot法检测miR-128-3p和MAPK相关基因(p38 MAPK和HSP27)在圣草酚发挥抗癌功能中的作用。裸鼠体内异种移植模型中分析圣草酚对肿瘤生长的作用,TUNEL法检测圣草酚对细胞凋亡的影响。结果当圣草酚浓度超过12.5μmol·L^(-1)时,MCF-7细胞活力随着圣草酚浓度的增高而逐渐降低(P<0.05);圣草酚干预后,MCF-7细胞活力、集落形成数量和MMP均下调,细胞凋亡率增高(P<0.05);细胞中miR-128-3p水平增高,p38 MAPK和HSP27磷酸化水平均降低(P<0.05)。转染miR-128-3p抑制物在一定程度上可以逆转圣草酚对MCF-7细胞的影响(P<0.05);在转染miR-128-3p抑制物的基础上添加MAPK通路抑制剂可以削弱这种逆转作用(P<0.05)。此外,裸鼠体内异种移植模型实验证明了圣草酚可呈剂量依赖性降低裸鼠肿瘤组织生长,促进细胞凋亡(P<0.05)。结论圣草酚可有效抑制人乳腺癌细胞增殖并诱导细胞凋亡,这可能与其调控miR-128-3p/MAPK轴有关。

Wnt/β-catenin通路在新北美圣草苷促进BMSCs成骨分化中的介导作用

目的:探究新北美圣草苷激活Wnt/β-catenin通路促进骨髓间充质干细胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells,BMSCs)成骨分化的具体机制,为其应用于临床治疗提供理论基础。方法:选取SPF级3月龄大鼠30只,随机分为对照组、低剂量组、高剂量组,每组10只,分别给予生理盐水、0.81g/kg及4.05g/kg骨碎补水煎液灌胃并制备含药血清。培养并鉴定BMSCs。以不同浓度含药血清干预BMSCs并比较各组的细胞增殖能力,矿化能力,β-catenin、Lrp-5、Osterix、RUNX-2、GSK-3βmRNA表达水平及β-catenin蛋白、Lrp-5蛋白水平。结果:与对照组相比,给药两组各时间点的细胞增殖能力更强,且高剂量组优于低剂量组;与对照组相比,给药两组的矿化结节数量明显升高,且高剂量组矿化结节数量多于低剂量组;给药两组的GSK-3βmRNA表达明显低于对照组,且高剂量组低于低剂量组,β-catenin、Lrp-5、Osterix、RUNX-2 mRNA表达明显高于对照组,且高剂量组高于低剂量组;同时给药两组的β-catenin蛋白、Lrp-5蛋白水平明显高于对照组,且高剂量组高于低剂量组,差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论:新北美圣草苷可能通过激活Wnt/β-catenin通路,上调β-catenin、Lrp-5、Osterix、RUNX-2 mRNA表达并下调GSK-3βmRNA表达,同时上调β-catenin蛋白、Lrp-5蛋白水平,进而促进BMSCs增殖和成骨分化。

圣草酚通过抑制小胶质细胞NLRP3炎性体信号通路改善5×FAD阿尔兹海默病小鼠认知功能

目的探讨圣草酚对携带5个家族性基因突变的转基因AD模型小鼠(5×FAD)的治疗效果以及对小胶质细胞含pyrin结构域核苷酸结合寡聚结构域样受体家族蛋白3(NLRP3)炎性体的调节作用。方法将8月龄5×FAD小鼠随机分为AD模型组和圣草酚治疗AD组。同龄野生型C57BL/6J小鼠随机分为野生型(WT)对照组和圣草酚治疗WT组。Morris水迷宫和Y迷宫实验评估各组小鼠认知功能,免疫荧光组织化学染色检测小鼠脑组织小胶质细胞NLRP3、胱天蛋白酶1(caspase-1)和白细胞介素18(IL-18)的表达,Western blot法检测小鼠脑组织NLRP3、含胱天蛋白酶活化和募集结构域凋亡相关斑点样蛋白(ASC)、caspase-1、IL-18、IL-1β以及离子钙结合衔接分子1(Iba-1)的蛋白水平。结果与WT组和圣草酚治疗WT组相比,AD组小鼠的认知功能明显障碍,小鼠脑组织小胶质细胞内NLRP3、caspase-1、IL-18、ASC、IL-1β和Iba1的表达均增加。经过圣草酚治疗后,与AD组小鼠相比,圣草酚治疗AD组小鼠学习记忆与认知功能得到改善,NLRP3、ASC、caspase-1、IL-1β、IL-18和Iba1的表达均下调。结论圣草酚可能通过抑制小胶质细胞NLRP3信号通路的激活改善AD动物模型的认知功能。

圣草次苷通过上皮间充质转化途径抑制肺腺癌细胞的增殖及迁移

目的:探究圣草次苷(Eriocitrin)对肺腺癌(Lung adenocarcinoma, LUAD)细胞系A549和H1299增殖和迁移能力的影响,以及对上皮间充质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT)的作用机制。方法:采用CCK8方法检测不同浓度圣草次苷对LUAD细胞系A549和H1299增殖能力的影响;采用划痕实验评价A549和H1299细胞的迁移能力;用Western Blot法和qRT-PCR法分别检测EMT相关上皮钙黏蛋白(E-cadherin和N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、铁死亡相关蛋白SLC7A11、GPX4、FTH和EMT标志分子E-cadherin、N-cadherin、Snail的mRNA水平,及细胞活性氧(reactive oxygen species,ROS)的水平,观察圣草次苷对LUAD细胞系铁死亡的影响。结果:圣草次苷可以明显抑制LUAD细胞系A549和H1299的增殖能力,并呈现出一定的剂量和时间依赖性。与对照组相比,不同浓度的圣草次苷作用24和48 h后均明显降低划痕愈合率,差异具有统计学意义(P<0.01)。与对照组相比,圣草次苷增加了LUAD细胞系A549和H1299的ROS的表达水平,增加了EMT相关蛋白E-cadherin的蛋白表达水平,降低了N-cadherin和Vimentin蛋白表达水平。此外,qRT-PCR结果也显示:圣草次苷上调了E-cadherin mRNA的表达,下调了N-cadherin、Snail mRNA表达,铁死亡相关基因SLC7A11、GPX4、FTH蛋白水平均下调,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:圣草次苷通过EMT途径抑制LUAD细胞的增殖和迁移,并促进铁死亡过程的发生,在LUAD预防和辅助化疗中具有一定的应用潜力。

圣草酚改善5×FAD小鼠认知功能并调控Nogo-A/NgR/ROCK2信号通路

背景:大量研究表明,神经生长抑制因子A(nerve growth inhibitory factor A,Nogo-A)可以通过与其下游分子结合激活Rho相关卷曲螺旋激酶(Rho-associated kinase,ROCK),从而对神经轴突的生长发挥抑制作用,与阿尔茨海默病中β-淀粉样蛋白的累积密切相关。实验室前期已经证明圣草酚能够改善5×FAD小鼠的认知功能障碍,但其对Nogo-A/NgR/ROCK2信号通路的调控尚未明确。目的:基于Nogo-A/NgR/ROCK2信号通路,探讨圣草酚对5×FAD小鼠认知功能的影响。方法:选取8月龄雄性C57BL/6小鼠分为野生组、野生给药组,8月龄雄性5×FAD小鼠分为模型组、圣草酚治疗组,每组8只,从小鼠33周龄开始,野生给药组和圣草酚治疗组每日腹腔注射圣草酚10μL/g,野生组和模型组注射同等体积的生理盐水,连续给药2个月,进行水迷宫、Y迷宫等行为学检测,检测结束后采用Western blot和免疫组织化学方法检测小鼠脑内β-淀粉样蛋白1-42,Nogo-A,NgR,p75NTR,Lingo1,ROCK2,p-ROCK2等相关靶蛋白的表达。结果与结论:①行为学检测结果显示,与野生组和野生给药组相比,模型组小鼠空间记忆能力与新事物探索能力均下降;与模型组相比,圣草酚治疗组空间记忆能力与新事物探索能力得到改善;②免疫组织化学与Western blot结果显示,与野生组和野生给药组相比,模型组β-淀粉样蛋白1-42、神经生长抑制因子Nogo-A及其神经生长抑制因子受体NgR,p75NTR,Lingo1的表达均升高;与模型组相比,圣草酚治疗组相关蛋白表达均有所下调;③与野生组和野生给药组相比,模型组Rho激酶相关蛋白ROCK2及p-ROCK2表达均升高;与模型组相比,圣草酚治疗组相关蛋白表达下调;④结果表明,圣草酚改善5×FAD小鼠的认知功能障碍与抑制Nogo-A/NgR/ROCK2信号通路相关。

圣草次苷抑制肝细胞癌SMMC-7721细胞的增殖和迁移:基于激活ROS/MAPKs信号轴

目的探讨圣草次苷通过ROS/MAPKs信号轴调控肝癌SMMC-7721细胞增殖和迁移的作用机制。方法分别用0、25、50、100、150、200、250、300μg/mL圣草次苷处理肝癌SMMC-7721细胞系24 h后,CCK-8法检测细胞活性;不同浓度的圣草次苷(100、200、300μg/mL)处理细胞后,运用划痕实验分别在24、48、72 h检测划痕愈合率,Transwell实验检测细胞迁移率,克隆形成实验检测细胞增殖能力,DAPI染色观察细胞核形态变化,Western blot检测侵袭蛋白E-cadherin、N-cadherin、MMP-2、MMP-9、凋亡因子PARP和Pro-caspase 3以及MAPKs通路p-JNK、p-P38、p-ERK信号分子;用(分别为2、5、10μmol/L)ERK抑制剂U0126、JNK抑制剂SB203580和P38抑制剂SP600125预先处理细胞2 h,再用200μg/mL圣草次苷处理细胞24 h,Western blot检测凋亡蛋白PARP的切割情况;分别用N-乙酰-半胱氨酸(NAC)(30μmol/L)或圣草次苷(100、200、300μg/mL)单独或共处理细胞后,通过DCFH-DA荧光探针法分别在15、30、60 min检测内源性活性氧(ROS)水平。结果圣草次苷在50μg/mL范围内,对细胞活力基本无影响(P>0.05);圣草次苷能够显著抑制SMMC-7721细胞的划痕愈合(P<0.01),细胞迁移(P<0.01)和克隆形成(P<0.01),在300μg/mL浓度时作用最显著;圣草次苷明显减少侵袭蛋白N-cadherin、MMP-2、MMP-9的蛋白表达量(P<0.01),上调E-cadherin的蛋白表达量(P<0.05);圣草次苷诱导SMMC-7721细胞发生显著的凋亡形态学变化,Pro-caspase 3表达降低,PARP切割增多(P<0.01);圣草次苷在300μg/mL刺激30 min时ROS表达水平较高,NAC(30μmol/L)处理后,细胞内ROS表达水平下降明显;圣草次苷能够显著诱导MAPKs信号途径JNK、P38和ERK的磷酸化(P<0.01),U0126和SB203580能够增强圣草次苷诱导的PAPR切割,而SP600125逆转圣草次苷诱导的PARP切割。结论圣草次苷通过促进细胞内ROS的合成,诱导MAPKs信号通路的活化,调控肝癌细胞系SMMC-7721的增殖、迁移和凋亡。

圣草酚调控Akt/mTOR通路对胶质瘤细胞自噬的影响

为研究圣草酚对胶质瘤细胞自噬的影响,探讨其通过调控Akt/mTOR通路在胶质瘤自噬过程中的作用。本研究采用CCK8和细胞克隆形成实验检测圣草酚对胶质瘤细胞增殖的影响。构建GFP-mRFP-LC3B稳定表达的细胞株,圣草酚(100μmol/L)处理48 h,观察自噬小体的形成情况;然后分别用圣草酚(100μmol/L)、雷帕霉素(200 nmol/L)以及圣草酚(100μmol/L)+雷帕霉素(200 nmol/L)处理48 h后观察自噬流的情况。利用蛋白免疫印迹法检测圣草酚对自噬及Akt/mTOR通路相关蛋白表达水平的影响。建立裸鼠皮下移植瘤模型,观察圣草酚在体内对胶质瘤自噬过程的影响。实验结果显示,圣草酚能够显著抑制胶质瘤细胞的增殖,且呈时间—剂量依赖性(P<0.05)。圣草酚使胶质瘤细胞中绿色自噬小体明显增多,LC3Ⅱ、Beclin 1、ATG5蛋白表达上调。圣草酚处理GFP-mRFP-LC3B稳转细胞株48 h后呈亮黄色,且减弱了雷帕霉素对自噬流的促进作用,并上调P62蛋白的表达。此外,圣草酚可抑制p-Akt、p-mTOR的表达,但该作用被Akt激动剂740 Y-P逆转。体内实验结果同体外一致。说明圣草酚能够抑制胶质瘤细胞的增殖和自噬流,其影响自噬过程的作用机制可能与下调Akt/mTOR通路有关。

圣草酚通过抑制TGF-β1/Smad3信号通路改善糖尿病肾病大鼠肾纤维化

目的:探讨圣草酚对糖尿病肾病(DN)肾纤维化的影响及其作用机制。方法:采用多次小剂量注射链脲佐菌素建立DN大鼠模型,将建模成功的大鼠随机分为模型组、阳性药物组(二甲双胍,0.5 g/kg)及圣草酚低、中、高剂量组(5、10、20 mg/kg),另设置对照组,每组12只。各给药组给予相应药物灌胃干预,对照组和模型组灌胃等体积生理盐水,1次/d,连续12周。收集24 h尿液,检测24 h尿蛋白含量;腹主动脉取血,测定空腹血糖(FBG)、血肌酐(Scr)和血尿素氮(BUN)含量;HE染色观察肾脏组织病理学变化;Masson染色观察肾脏组织纤维化程度;qRT-PCR检测肾组织中TGF-β1、CollagenⅠ和CollagenⅢmRNA表达水平;Western blot检测肾脏组织中TGF-β1、p-Smad3、Smad3、α-SMA蛋白表达水平。结果:与对照组相比,模型组大鼠肾脏出现明显损伤及纤维化,FBG、BUN、Scr和24 h尿蛋白含量均显著升高(P<0.05),肾脏组织中TGF-β1、CollagenⅠ、CollagenⅢ等mRNA表达水平及TGF-β1、p-Smad3和α-SMA等蛋白表达水平均显著提高(P<0.05);与模型组相比,圣草酚中、高剂量组和阳性药物组大鼠肾损伤明显改善,肾纤维化程度明显降低,FBG、BUN、Scr和24 h尿蛋白含量均显著降低(P<0.05),肾脏组织中TGF-β1、CollagenⅠ、CollagenⅢmRNA表达水平及TGF-β1、p-Smad3和α-SMA蛋白表达水平均显著降低(P<0.05),而圣草酚低剂量组大鼠以上各指标变化差异无统计学意义(P>0.05)。结论:圣草酚可显著改善DN大鼠肾纤维化,其机制可能与抑制TGF-β1/Smad3信号通路有关。

圣草酚调控MAPK和Nrf2/HO-1信号通路缓解非酒精性脂肪肝的作用及机制

目的研究圣草酚缓解非酒精性脂肪肝(NAFLD)的作用及可能机制。方法将16只C57BL/6J小鼠按体重随机分为对照组、NAFLD模型组和圣草酚低、高剂量组(50、100 mg/kg),每组4只。除对照组外,其余各组均使用高脂饲料诱导NAFLD模型。在预处理4周后,采取腹腔注射方式(0.01 mL/g)进行给药,每日1次,连续6周。测定小鼠体重、肝脏质量,观察小鼠肝组织病理损伤情况,测定小鼠血清中天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)和甘油三酯(TG)水平及肝组织中核转录因子红系2相关因子2(Nrf2)、血红素加氧酶1(HO-1)蛋白表达。使用0.5 mmol/L油酸诱导HepG2细胞建立体外NAFLD模型,实验设置正常对照组、NAFLD模型组和圣草酚低、中、高浓度组(50、100、150μmol/L);给药组在诱导模型的同时加入圣草酚,培养24 h。观察细胞中脂质沉积情况,检测细胞中TG、丙二醛(MDA)、活性氧(ROS)水平以及丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路相关蛋白[细胞外信号调节激酶(ERK)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)]磷酸化水平和Nrf2、HO-1蛋白表达水平。结果体内实验中,与NAFLD模型组比较,圣草酚低、高剂量组小鼠体重、肝脏质量和血清中AST、ALT和TG的水平(圣草酚低剂量组小鼠血清AST水平除外)均显著降低(P<0.01),脂滴沉积形成的空泡数量显著减少,Nrf2、HO-1蛋白表达水平进一步升高(P<0.01)。体外实验中,与NAFLD模型组比较,圣草酚低、中、高浓度组细胞中脂质沉积减少(P<0.01),ROS、MDA、TG水平显著降低(P<0.05或P<0.01),ERK、JNK磷酸化水平均显著下调(P<0.01),Nrf2、HO-1蛋白表达水平显著上调(P<0.01)。结论圣草酚可能通过抑制MAPK信号通路,进而激活Nrf2/HO-1信号通路来缓解NAFLD。

HPLC双波长法同时测定骨碎补中原儿茶酸、新北美圣草苷和柚皮苷的含量

目的:建立采用高效液相色谱(HPLC)双波长法同时测定骨碎补中原儿茶酸、新北美圣草苷和柚皮苷含量的方法。方法:用Agilent Eclipse XDB-C18(250 mm×4.6 m,5 m)色谱柱,以乙腈-0.4%磷酸水溶液进行梯度洗脱,流速1 ml/min,柱温30℃,检测波长260 nm(原儿茶酸)、283 nm(新北美圣草苷和柚皮苷),进样量20μl。结果:3个待测成分与相邻色谱峰分离度大于1.5,原儿茶酸、新北美圣草苷、柚皮苷分别在2.472~17.303μg/ml、12.226~85.579μg/ml和12.143~85.003μg/ml范围内线性关系良好(均为r=1.0000);精密度(n=6)、重复性(n=6)、稳定性(48 h内)试验的RSD均低于1.0%;平均回收率在95.87%~99.09%,RSD%(n=6)均低于1.0%。结论:该方法操作简便、专属性强、准确度高,可为骨碎补药材的质量控制提供参考。

HPLC同时测定骨碎补药材中新北美圣草苷和柚皮苷的含量

目的:建立同时测定骨碎补类药材中新北美圣草苷和柚皮苷含量的反相高效液相色谱法。方法:采用 Hypersil ODS2色谱柱(5μm,250mm×4.6mm),以乙腈-0.4%醋酸水溶液(20:80)为流动相,流速为1.0mL·min^(-1),柱温为室温,检测波长为283nm。结果:样品中新北美圣草苷和柚皮苷平均回收率分别为100.1%和99.4%;新北美圣草苷和柚皮苷的线性范围分别为12～480μg·mL^(-1)(r=0.9997)和10～400μg·mL^(-1)(r=0.9999)。结论:该方法可用于骨碎补药材的质量控制,方法简便,准确,重现性好。

圣草酚抑制自由基诱导的生物大分子损伤及对肝癌细胞HepG2毒性的作用

研究圣草酚体外清除自由基的活性；采用2,2-偶氮二（2-甲基丙基咪）二盐酸盐（AAPH）诱导牛血清白蛋白（BSA）、大鼠肝组织及质粒DNA构建过氧化反应模型，以蛋白羰基化、丙二醛（MDA）生成量和DNA断裂为指标，研究圣草酚对自由基损伤蛋白质、脂质、DNA 3种生物大分子的作用；通过MTT法检测圣草酚对肝癌细胞HepG2的毒性。结果表明：25～200μmol/L的圣草酚具有较强的DPPH自由基清除作用，IC50值为95.7μmol/L，但清除羟自由基能力较弱。圣草酚呈浓度依赖性抑制脂质、蛋白质、DNA的氧化损伤。400μmol/L的圣草酚作用48h能显著地降低肝癌细胞HepG2细胞活力。结论：圣草酚能有效地清除DPPH自由基，抑制自由基损伤生物大分子及肝癌细胞HepG2的活力。

圣草次苷调控MPTP诱导的慢性小鼠帕金森疾病和机制研究

目的:探究圣草次苷减轻1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)诱导的慢性小鼠帕金森疾病和机制。方法:选取75只小鼠采用随机分组法分为:健康对照组、模型组、圣草次苷低剂量组(8 mg/kg)、圣草次苷中剂量组(16 mg/kg)、圣草次苷高剂量组(32 mg/kg),每组各15只;腹腔注射20 mg/(kg·d)的MPTP溶液,持续一周制成帕金森小鼠模型;给药组小鼠分别使用对应剂量的圣草次苷干预2周。使用旷场实验、悬挂实验、游泳实验检测小鼠行为;使用HE染色和TUNEL染色检测小鼠神经元细胞的凋亡情况;使用蛋白质印迹法检测小鼠脑组织Bax、Bcl-2和Caspase-3、Caspase-9的表达情况;使用试剂盒检测小鼠黑质中SOD、MDA、LDH、GSH的含量;使用ELISA检测小鼠外周血中IL-6、TNF-α、iNOS和IL-10的含量;使用蛋白质印迹检测信号通路Nrf2、HO-1、NQO1的表达情况。结果:HE染色和TUNEL染色结果显示相比空白对照组,模型组小鼠神经细胞凋亡率显著升高(P<0.05),相比模型组,使用圣草次苷处理各组小鼠神经细胞凋亡率显著降低(P<0.05);相比空白对照组,模型组小鼠旷场移动路程、旷场中心区域活动时间、游泳时间和悬挂时间、SOD水平、Bcl-2、Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表达水平显著降低(P<0.05),Bax、Caspase-3和Caspase-9蛋白表达水平、MDA、LDH、GSH、TNF-α、IL-6、iNOS水平显著升高(P<0.05),IL-10无显著变化(P>0.05);相比模型组圣草次苷低剂量组Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表达水平显著升高,Bax/Bcl-2显著降低(P<0.05),其余各指标均无显著变化(P>0.05);相比模型组,圣草次苷中剂量组和圣草次苷高剂量组旷场移动路程、旷场中心区域活动时间、游泳时间、SOD、IL-10、Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表达水平显著升高(P<0.05),Bax/Bcl-2、Caspase-3和Caspase-9蛋白表达水平、MDA、LDH、GSH、TNF-α、IL-6、iNOS显降低(P<0.05)。结论:圣草次苷可以通过抑制氧化应激、炎症反应,神经细胞的凋亡并激活Nrf2/HO-1信号通路缓解MPTP诱导的慢性PD。

圣草酚-7-O-β-D-葡萄糖苷改善血管内皮细胞损伤作用机制研究

目的:探讨河南道地药材怀菊花中圣草酚-7-O-β-D-葡萄糖苷对血管内皮细胞损伤的干预作用及作用机制。方法:血管内皮细胞饥饿处理12 h后,以2.5μg/mL LPS诱导24 h,建立血管内皮细胞损伤模型。采用ELISA法检测细胞培养上清液中TNF-α、IL-6、IL-1β、VCAM-1、ET-1水平,TBA法检测MDA水平,羟胺法检测SOD水平,一步法检测NO水平,Western blot法检测细胞内MAPK信号通路p-MEK1/2、MEK1/2、p-ERK1/2、ERK1/2、p-JNK、JNK、p-P38、P38蛋白表达。结果:怀菊花中圣草酚-7-O-β-D-葡萄糖苷对该模型有明显的干预作用,可显著升高SOD、NO水平,降低TNF-α、IL-6、IL-1β、VCAM-1、ET-1、MDA水平,并显著下调p-MEK1/2、p-ERK1/2的表达。结论:圣草酚-7-O-β-D-葡萄糖苷可能通过调节ERK/MAPK信号通路,降低炎症因子、细胞因子及氧化应激水平,从而抵抗LPS诱导的血管内皮细胞损伤。