基于在线二维色谱的不同生长时期鹿茸的比较蛋白质组分析

建立了基于在线二维弱阴离子交换色谱-反相液相色谱(2D-WAX-RPLC)的蛋白质分离系统,并用于不同生长时期鹿茸的比较蛋白质组分析。以5种标准蛋白质的混合物为样品,考察了系统的重现性。通过改变标准蛋白质之间的浓度比,研究了该系统进行蛋白质相对定量的能力。在此基础上,针对4个不同生长时期的鹿茸样品,分别采用5种不同的方法进行蛋白质提取,经2D-WAX-RPLC分离后,收集各生长时期对应蛋白质的峰高最大比超过2的组分。酶解后,采用微柱反相液相色谱-串联质谱(μRPLC-MS/MS)进行肽段的分离鉴定;共从9个差异蛋白质峰中鉴定到了22个差异蛋白质。研究结果表明,利用基于蛋白质水平的在线二维液相色谱分离技术找寻差异蛋白质,具有重现性好、自动化程度高等优点,可用于开展比较蛋白质组学的研究。

在线二维高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱法分析两性霉素B的杂质谱

建立了基于在线二维高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱(2D HPLC-Q TOF/MS)的两性霉素B杂质谱分析方法。第一维液相色谱(^(1)D-LC)以XBridge Shield C18为色谱柱、甲醇-乙腈-4.2 g/L柠檬酸水溶液为流动相。第二维液相色谱(^(2)D-LC)以Xtimate C8为捕集柱,以含0.1%甲酸的10 mmol/L甲酸铵水溶液-乙腈(95∶5, v/v)为流动相进行捕集和脱盐;以Xtimate C8为色谱柱,以含0.1%甲酸的10 mmol/L甲酸铵水溶液-乙腈为流动相进行洗脱。该方法结合了在线稀释和多针捕集装置,实现了10个组分/杂质的高效分离,并通过四极杆飞行时间质谱实现了对不稳定组分/杂质的结构推断,解决了2D HPLC溶剂兼容性的难题,增加了分析通量,提高了2D HPLC的自动化能力,避免了两性霉素B与部分杂质在色谱分离过程中相互转化的问题,提高了检测灵敏度。利用该方法可以灵敏地对两性霉素B的杂质谱进行分析,所得到的研究结果对两性霉素B的生产工艺改进具有指导意义。

在线二维液相色谱技术及其在中药质量控制中的应用与展望

由于复杂体系样品分离需要更强的分离能力,二维色谱能使样品组分在两个不同的分离条件下进行分离,显著提高分离能力,降低色谱峰重叠,同时改善色谱峰鉴定的可靠性,在中药质量控制中发挥重要作用。不同的二维色谱技术中,在线全二维液相色谱技术由于其在较短时间内可以获得高峰容量、样品损失低、重现性好及自动化程度高,成为对于复杂体系分离时最受关注,发展最迅速的技术。本文讨论了二维液相色谱技术,尤其是在线全二维色谱技术的概念、特点和分离优势,及其在中药复杂体系质量控制分析中的应用,为该技术在中药质量控制中提供一定参考。

在线二维液相色谱法同时测定银翘解毒丸中5种成分

目的:使用双梯度液相色谱系统和二极管阵列检测器,建立在线二维液相色谱法同时测定银翘解毒丸中绿原酸、木犀草苷、连翘苷、连翘酯苷A、牛蒡苷的含量。方法:利用双梯度液相色谱的其中一个泵为一维分析泵,采用C_(18)色谱柱(100 mm×4.6 mm,2.4μm),以乙腈-0.1%磷酸溶液为流动相梯度洗脱,流速1.0 mL/min;利用双梯度液相色谱的另一个泵为二维分析泵,使用C_8(150 mm×3.0 mm,2.7μm)色谱柱,以乙腈-0.1%磷酸溶液为流动相(27∶73),流速0.5 mL/min,二极管阵列检测器,检测波长277 nm。结果:绿原酸、木犀草苷、连翘苷A、牛蒡苷5个成分线性范围分别为8.45~127.75μg/mL、2.05~30.75μg/mL、6.85~102.75μg/mL、23.16~347.40μg/mL、28.35~425.25μg/mL,平均加样回收率在96.6%~99.8%,RSD为0.2%~1.7%。结论:该方法快速、准确、重现性好,可用于银翘解毒丸的质量评价。

在线液相-气相二维色谱测定卷烟主流烟气中的苯并[a]芘

建立了在线液相-气相二维色谱测定卷烟主流烟气中的苯并[a]芘方法。采用剑桥滤片捕集烟气粒相物,环己烷萃取,以D12-苯并[a]芘为内标,然后用在线液相-气相二维色谱测定：样品直接进样进入液相色谱,经微型硅胶柱分离,含苯并[a]芘的部位切割进入气相色谱,排干溶剂后启动气相色谱升温,经毛细管柱进行分离,用质谱检测。本方法将烟气苯并[a]芘测定中的硅胶柱层析和气相色谱-质谱分析在线连接起来,可不经样品前处理净化直接进样分析;而且每次进样可达40#L,与常规气相色谱-质谱分析最大进样2.0#L相比,分析灵敏度提高了20倍。方法线性范围达0.08~50 ng/L,相关系数为r2=0.999,回收率为94.2%~105.5%;检出限和定量限分别为0.09和0.30 ng/支,应用本方法对14个不同类型市售卷烟和2R4F标准烟进行了测定,结果与GB/T21130-2007测定结果相符合。

在线二维集束毛细管柱-高气压光电离-飞行时间质谱用于单萜类化合物的快速测量

单萜类化合物是大气中生物源挥发性有机物(BVOCs)的一个主要组分,具有同分异构体种类多、寿命短、浓度低、时空变化快等特点。将集束毛细管柱(MCC)和高气压光电离-飞行时间质谱仪(HPPI-TOF MS)相结合,搭建MCC-HPPI-TOF MS联用装置,并开发一种二维GC-MS快速在线检测方法,用于单萜同分异构体的快速定性和定量分析。实验结果表明,在无任何样品预富集的前提下,该方法可在180 s内实现α-蒎烯、β-蒎烯、α-萜烯、γ-萜烯、3-蒈烯及柠檬烯等6种单萜同分异构体的在线检测,检出限(LODs)低至μg/m^3量级。该方法已经用于松树和柏树枝叶释放出的单萜化合物的快速在线分析,展示了其在环境监测、过程分析等领域复杂混合物样品在线检测的能力和应用前景。

在线液相-气相二维色谱-质谱联用法测定烟用香精和料液中苯并[a]芘的含量

样品10.0g,加水10mL稀释,加0.100g·L-1 D12-苯并[a]芘内标溶液200μL,加环己烷10mL,以20 000r·min-1速率漩涡振荡萃取5min。提取液直接进入液相色谱,经微型硅胶柱分离净化,含苯并[a]芘的部位切割进入气相色谱,经毛细管柱分离后进入质谱分析,采用选择离子监测模式(SIM)进行测定。苯并[a]芘的质量浓度在0.08~50ng·L-1范围内与峰面积呈线性关系,方法的检出限(3s)为0.12ng·g-1,在3个不同浓度水平上进行了回收试验,回收率在92.7%~98.1%之间,测定值的相对标准偏差(n=7)在3.2%~3.7%之间。

在线液相-气相二维色谱高灵敏测定卷烟主流烟气中的4-(N-甲基亚硝胺基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮

建立了在线液相-气相二维色谱测定卷烟主流烟气中4-（N-甲基亚硝胺基）-1-（3-吡啶基）-1-丁酮（NNK）的方法。NNK的分析在在线凝胶气质联用仪上进行,采用自行装填的微型碱性氧化铝柱,并把仪器上的凝胶柱换成氧化铝柱,用于NNK的分析。捕集有主流烟气总粒相物的剑桥滤片用二氯甲烷提取,以D4-NNK为内标,提取液经微型氧化铝柱分离,含NNK的部位切割进入气相色谱,排干溶剂后启动气相色谱升温经毛细管柱进行分离,用质谱检测。本方法将烟气国标方法 NNK测定中的氧化铝柱色谱净化和气相色谱-质谱分析在线连接起来,可不经样品前处理净化直接进样分析;每次进样可达40μL,是常规气相色谱-质谱分析最大进样量（2.0μL）的20倍,显著提高了分析灵敏度。方法线性范围达1.2~120 ng/m L,相关系数为r=0.9998,回收率为93.9%~96.0%;检出限和定量限分别为0.25 ng/m L和0.9 ng/m L,样品分析结果与中国烟草总公司企业标准方法进行对比,结果相符合。

二维液相色谱在药物和毒物分析中的应用进展

生物样品中药物、毒物及内源性物质的定性与定量分析在生命科学和药物研发中发挥重要作用。生物样品的基质复杂,干扰物多,待测物浓度与内源性物质相比明显偏低,且样品取样量少,因此要求生物分析方法的特异性强、灵敏度高、重现性好。二维液相色谱技术具有峰容量大、显著降低复杂样品的基质效应和残留现象,及可以实现样品分析的自动化等特点,已成为生物样品分离分析的有力工具,在环境、食品和药物分析中得到广泛应用。本文在简要介绍了二维液相色谱原理装置基础上,对其在生物样品中药物、毒物和内源性物质分析中的应用进展进行了综述。

固相萃取-在线二维快速同时测定食品中维生素A、D和4种维生素E异构体的含量

本文建立了固相萃取-在线二维液相色谱方法,分析维生素A、D和α、β、γ、δ-维生素E。样品皂化液经过Bond ElutPlexa固相萃取柱富集、净化,采用FoodKit2 ADE和FoodKit1&2 ADE分别作为第一、二维色谱柱进行分析,结合乙腈、甲醇和水为流动相梯度洗脱。第一维色谱完成维生素A和4种维生素E的分离和定量及维生素D净化,利用中心切割在第二维色谱实现维生素D的分离和定量。结果表明,各目标物线性良好R^2>0.999,平均回收率在85.62~92.06%之间,可实现快速、准确完成定量分析。

在线二维液相色谱-四极杆飞行时间质谱法检测二丁酰环磷腺苷钙的杂质谱

建立了在线二维液相色谱-四极杆飞行时间质谱法(2D-LC-Q-TOF MS)分析二丁酰环磷腺苷钙的杂质谱。第一维色谱采用C18色谱柱,流动相为0.1 mol/L磷酸二氢钾溶液∶甲醇(60∶40),检测波长273 nm;第二维色谱采用Poroshell 120 EC-C18色谱柱,以0.1%甲酸水溶液和0.1%甲酸乙腈溶液为流动相,线性梯度洗脱。当第一维HPLC目标组分洗脱时,通过阀切换将目标组分准确切割并捕获在40μl定量环中,之后第二维HPLC泵将捕获的组分洗脱并进行质谱检测。采用正离子模式采集数据。对第一维谱图中的7个杂质进行了结构推测,并分析其来源和稳定性。本试验建立的2D-LC-Q-TOF MS法能用于二丁酰环磷腺苷钙杂质谱的分析,可为其生产工艺和质量控制提供参考。

在线二维多中心切割液相色谱法测定三七、人参及其相关产品中8种人参皂苷

目的基于一法多用策略,建立了在线二维多中心切割液相色谱同时测定三七、人参及其相关产品中人参皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd的方法。方法按照产品的不同类别和制备工艺,分别采用相应的样品制备方法,对于原药材及其复方中药固体制剂,采用加压溶剂萃取法,分别采用三氯甲烷和水饱和正丁醇的2步溶剂提取;优化了一维和二维色谱分离条件,包括色谱柱选择、梯度洗脱等,分别采用Phenyl-x和C18柱作为一维和二维色谱柱,根据各目标物在一维色谱柱上的出峰时间,设置切割时间窗口,将各组分分别转移至6个定量环中,交替储存目标物馏分。第二维分离采用2.6μm颗粒的核-壳柱实现了8次的快速循环分离,完成8个目标物的测定。结果 8种目标待测物在药材、提取物和中药复方等基质均可获得较好的分离和定量,线性相关系数r>0.999,连续进样的精密度RSD在0.52%~1.53%,方法回收率在94.57%~103.47%,检出限在0.041~0.18μg/m L。结论本方法可准确对不同样品基质中的8种人参皂苷进行定量测定,结合8种人参皂苷的相对比例变化,可对人参、三七及其相关产品进行质量评价。

在线单柱二维液相色谱法对蛋清中三种活性蛋白的快速分离纯化

基于一种新型的强阳离子交换/疏水色谱(SCX/HIC)双功能色谱柱构建了在线单柱二维液相色谱(2DLC-1C),分离系统实现了自动控制,可在线进行样品收集、二维进样和二维色谱分离.采用SCX-HIC 2DLC-1C,在120 min内可将8种标准蛋白完全分离,并成功应用于鸡蛋清中三种活性蛋白质的分离纯化.结果表明利用在线2DLC-1C技术可在70 min内完成对鸡蛋清中溶菌酶、卵清蛋白和卵转铁蛋白三种活性蛋白的快速分离纯化,其纯度分别为95%、93%和97%.该方法减少了样品的处理步骤,对样品的污染小,纯化速度快,操作简单,易于实现自动化和放大,对活性蛋白的快速分离制备和工业化生产具有广阔的应用前景.

高效液相色谱法测定维生素D_(3)的三个标准方法比较

目的比较三个标准方法中用高效液相色谱法测定碳酸钙D_(3)片中维生素D_(3)含量的优劣.方法分别按照三个标准的前处理方法处理碳酸钙D_(3)片,分离维生素D_(3),采用三种高效液相色谱方法测定维生素D_(3)的含量,评价这三种方法的优劣.结果三种方法测定的碳酸钙D_(3)片中维生素D_(3)的含量分别为108.6%、102.3%、103.5%.结论三种方法的测定结果均满足对碳酸钙D_(3)片中维生素D_(3)测定的前处理要求,其中皂化法的前处理步骤最方便快捷,使用的有机试剂量最少,配合使用在线固相萃取-二维液相色谱方法测定含量更稳定高效,此方法更适用于碳酸钙D_(3)片中维生素D_(3)含量的测定.

2D-UPLC-Q/TOF-MS法对替考拉宁未知杂质结构鉴定

目的建立一种在线二维超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱(2D-UPLC-Q/TOF-MS)分析方法对替考拉宁未知杂质进行结构分析。方法采用在线二维超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱法,一维液相进行分离,二维液相脱盐后进行质谱分析,根据杂质精确分子量及其二级质谱碎片离子与已知主成分结构碎片离子对比,推导其结构。结果该方法采用2D-UPLC-Q/TOF-MS法对替考拉宁未知杂质进行鉴定,鉴定杂质1为A_(3-1)脱N-乙酰基葡萄糖降解物,杂质2为A_(2-2)脱甘露糖降解物。结论该方法可以快速地对替考拉宁未知杂质进行结构鉴定,很好地解决了杂质难以制备进行结构解析的难题。

阿莫西林胶囊热降解聚合物杂质的2D-HPLC分析及质谱裂解机理探讨

目的:建立阿莫西林胶囊中热降解聚合物杂质的分析方法。方法:采用高效凝胶排阻色谱法(HPSEC法),使用Shimpack Bio Diol-60(4.6 mm×300 mm,3μm)二醇基高纯硅胶色谱柱,进样量为20μL并以254 nm为检测波长,进行阿莫西林和聚合物杂质的分离。通过优化HPSEC中流动相pH、缓冲盐浓度、有机相比例等色谱条件,结合阿莫西林13个杂质对照品,考察不同杂质的出峰规律。采用高效二维液相色谱法(2D-HPLC法),使用500μL样品环将HPSEC分离所得聚合物杂质通过中心切割转移到二维反相色谱中脱盐,二维采用质谱兼容流动相,高分辨质谱分析确认结构。结果:HPSEC法中流动相pH是影响阿莫西林与聚合物峰分离的关键因素。杂质对照品在HPSEC的保留时间研究表明色谱分离未严格按照相对分子质量大小的顺序进行。通过对聚合物杂质K和J的质谱裂解行为研究揭示了β-内酰胺类抗生素的一般裂解规律。2D-HPLC法对阿莫西林热降解溶液深入分析,主峰前聚合物峰在二维进一步分离出14个化合物,为阿莫西林二聚体、三聚体、四聚体及其异构体。结论:HPSEC与RP-HPLC结合组成的二维色谱高分辨质谱系统可作为更精准的聚合物发现的手段。