北五味子对糖尿病脑病大鼠脑中神经活性物质含量影响的在线微透析-高效液相色谱-串联质谱联用分析

采用在线微透析-高效液相色谱-串联质谱联用方法,测定了糖尿病脑病大鼠大脑海马区的8种脑递质的含量,从脑中神经活性物质的角度研究五味子改善学习记忆能力的作用机制.实验结果表明,经五味子治疗后,痴呆大鼠脑透析液中的谷氨酸(Glu)、丝氨酸(Ser)、多巴胺(DA)及5-羟色胺(5-HT)的含量显著降低(P<0.05),牛磺酸(Tau)及乙酰胆碱(Ach)的含量显著升高(P<0.01),天冬氨酸(Asp)和γ-氨基丁酸(GABA)的含量有降低趋势(P>0.05),8种神经活性物质的水平均向正常水平发生了调节.此结果说明五味子可能通过调节糖尿病大鼠大脑中神经活性物质的含量发挥保护中枢神经系统的作用,从而改善糖尿病脑病大鼠的学习记忆能力.Morris水迷宫实验结果表明,五味子水提物可以明显缩短糖尿病脑病大鼠的逃避潜伏期,增加穿越目标区域次数及中心区域(%)(P<0.05).

在线微透析-液相色谱-串联质谱法测定人参水提物对糖尿病脑病大鼠脑内神经活性物质的影响

评价人参水提物对糖尿病脑病大鼠学习记忆能力及脑内神经活性物质的影响。建立糖尿病模型,采用Morris水迷宫实验以逃避潜伏期(ELT)、穿越目标区域次数及中心区域(%)为指标评价大鼠的学习记忆能力。利用在线微透析-液相色谱-串联质谱法,Venusil C18柱梯度洗脱,MRM方式检测各组大鼠海马区8种神经活性物质水平并进行比较。结果表明:糖尿病大鼠人参治疗后认知能力明显改善(p<0.05);在线检测方法线性良好(R2>0.99),准确度和精密度满足分析要求;相比模型组,人参组大鼠脑内牛磺酸、乙酰胆碱水平显著升高(p<0.01),谷氨酸、丝氨酸、天门冬氨酸、γ-氨基丁酸、多巴胺和五羟色胺水平均显著降低,8种神经活性物质水平均向正常水平调节。

微透析-液相色谱-质谱联用技术在中药研究中的应用

微透析-液相色谱-质谱联用技术不仅可以实现活体、实时、连续地微创取样,还具有高灵敏度、分析速度快、检测范围宽等特点,是中药研究的利器,已广泛应用于中药体内过程及作用机制研究等方面。本文对微透析技术进行了简要介绍,并结合相关研究实例,着重介绍了微透析-液相色谱-质谱联用技术在中药活性成分筛选、体内外代谢、药代动力学、代谢组学等研究中的策略及应用。

建立液相色谱-质谱串联法测定大鼠微透析样品中美罗培南的浓度

目的建立高效液相色谱-质谱串联法（HPLC-MS/MS）用于监测微美罗培南在透析液中实时变化的浓度,为应用微透析技术对感染靶部位美罗培南的药动/药效学研究奠定基础。方法采用COSMOSIL 5C18-PAQ（150 mm×4.6 mm,5μm）色谱柱进行分离,流动相为乙腈-0.1%甲酸水,梯度洗脱,流速1.0 ml/min,分析时间为8 min;美罗培南和内标（安替比林）均在ESI正离子模式扫描,以多反应监测（MRM）模式进行扫描,检测离子对美罗培南m/z 384.2→141.2,内标m/z 189.2→104.0。结果美罗培南在0.01～40μg/ml线性范围内线性关系良好（r=0.9979）;日内及日间精密度在9.76%以内,准确度-7.87～0.28%。结论本法灵敏度高、专属性强、精密度好、准确度高,适用于微透析样品的快速有效分析。

基于微透析-UPLC技术的异嗪皮啶大鼠脑纹状体细胞外液药动学研究

目的:考察大鼠口服给药异嗪皮啶(Isofraxidin)之后的脑纹状体细胞外液药动学特性。方法:大鼠单次灌胃给予异嗪皮啶10 mg.kg-1和20 mg.kg-1后,采用脑微透析活体取样技术和超高效液相色谱质谱联用技术(UPLC-MS),测定给药后60 min内各时间点大鼠脑纹状体细胞外液中透析液异嗪皮啶的浓度,经回收率校正后,采用WINONLIN 6.1程序以非房室模型法拟合药动学参数。结果:大鼠单次灌胃给予异嗪皮啶10 mg.kg-1和20 mg.kg-1后,其主要药动学参数分别为AUC0-∞(13973.88±1582.984)、(28059.76±4207.66)ng.min.mL-1;t1/2(16.68±0.49)、(17.41±2.88)min;Cmax(498.87±64.36)、(899.81±133.22)ng.mL-1;tmax均为15 min,其中Cmax和tmax均为实测值。结论:异嗪皮啶经大鼠口服给药后能够迅速透过血脑屏障,到达纹状体部位,15 min浓度达到最大值,之后药物以较快速率消除,纹状体细胞外液异嗪皮啶浓度具有明显的剂量依赖性。

HPLC-MS/MS法同时检测大鼠微透析液中哌拉西林/三唑巴坦的浓度

目的建立高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS／MS）法同时检测大鼠微透析液中哌拉西林／三唑巴坦的药物浓度。方法利用微透析技术对大鼠肝脏局部给药，并进行采样。微透析样品通过HPLC-MS／MS检测，采用Agilent TC-C18柱，（150mm×4．6mm，5μm），流动相为乙腈-0．5％甲酸，等度洗脱，以负离子扫描多反应监测（MRM）扫描方式进行检测，检测离子对哌拉西林m／z 516.2→233．0，三唑巴坦m／z299．0→138．0，内标替米沙坦m／z513．2→287．0。结果哌拉西林／三唑巴坦的线性范围均为0．0625-43．75μg／mL；日间和日内精密度相对偏差均小于15％；准确度和稳定性均符合生物样品的测定要求。结论本方法灵敏度高，操作简便快捷，适用于微透析样品中哌拉西林／三唑巴坦的浓度测定。

膜透析/高效液相色谱-串联质谱法测定畜产品中9种β-受体激动剂残留

建立了膜透析/高效液相色谱-串联质谱法(MD/HPLC-MS/MS)检测畜产品中克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇等9种β-受体激动剂的新方法。样品经乙酸铵缓冲液提取和β-葡萄糖苷醛甙酶/芳基硫酸酯酶酶解,采用标准再生纤维素膜(RC,截留分子量MWCO:1000D)透析净化,β-受体激动剂通过膜渗入透析液中,透析液用环已烷-乙酸乙酯(4:1)萃取,经Waters Xbridge C18色谱柱进行分离,以0.1%甲酸水和乙腈作为流动相进行梯度洗脱,电喷雾正离子(ESI+)模式电离,多反应监测(MRM)模式进行检测,外标法定量。结果表明,9种β-受体激动剂在0.5~10μg/kg浓度范围内线性关系良好。方法的定量限为0.5μg/kg,在0.5、1.0、2.5μg/kg 3个添加水平的回收率为72.5%~92.6%,相对标准偏差(n=6)在4.1%~12.7%之间。该方法采用膜透析技术进行净化,无需使用昂贵的固相萃取柱,适用于畜产品中9种β-受体激动剂的经济、高灵敏度的分析检测。

脂质体平衡透析-液质联用色谱法筛选四物汤药效物质的研究

目的:探讨四物汤有效成分与脂质体模拟生物膜的相互作用,以了解其有效成分体内吸收的情况。方法:采用平衡透析与高效液相色谱-质谱联用技术,对四物汤有效成分与脂质体模拟生物膜相互作用进行分析;同时考察了透析时间、脂质体溶液的浓度和缓冲溶液p H对四物汤有效成分与模拟生物膜相互作用的影响。结果:四物汤中有9个成分与脂质体相互作用明显,通过对照品对照及LC-MS方法鉴定了其中6个成分,分别是香草酸、芍药内酯苷、毛蕊花糖苷、芍药苷、洋川芎内酯Ⅰ、肉桂酸;模拟生物膜的浓度对四物汤有效成分与模拟生物膜相互作用影响较大,随着浓度增加,色谱峰面积明显减小,符合被动吸收规律;p H对其中4个成分有明显影响。结论:脂质体平衡透析液质联用色谱法可作为快速筛选中药潜在的活性成分的有效方法,为药效物质基础的进一步研究提供参考。

乌头碱皮肤微透析体外回收率的测定及其影响因素研究

目的考察乌头碱皮肤微透析体外回收率的影响因素。方法分别采用增量法、减量法考察灌流液流速、乌头碱浓度及环境温度对微透析体外回收率的影响。结果灌流液流速越高,微透析体外回收率越低;乌头碱浓度对微透析体外回收率的影响较小;环境温度越高,微透析体外回收率也越高。结论乌头碱皮肤微透析体外回收率受灌流液流速及环境温度影响,与乌头碱浓度无关。

微透析联合UPLC-MS/MS研究丹参酮ⅡA在大鼠脑脊液中的药动学

目的应用在体脑微透析联合UPLC-MS/MS探究丹参酮ⅡA(tanshinone IIA,TSA)在正常大鼠及脑缺血/再灌注(cerebral ischemia reperfusion injury,CIRI)损伤模型大鼠脑脊液中的药动学特征。方法采用增量法和减量法考察灌流液流速和TSA的质量浓度对回收率和相对释放率的影响;减量法测定探针在大鼠体内相对释放率,考察其8 h内的稳定性。应用UPLC-MS/MS技术分析大鼠在体脑透析液样品中TSA浓度,绘制脑透析液药物浓度-时间曲线,计算药动学参数。结果探针体外回收率和相对释放率基本一致,且随灌流速度的增大而减小,与TSA的浓度无关;体内相对释放率在1.5~8.0 h内基本保持不变。UPLC-MS/MS方法学考察结果均符合生物样品要求。正常大鼠和大脑中动脉阻塞/再灌注损伤模型大鼠分别腹腔注射TSA后,脑脊液中药物浓度分别在60 min和80 min达到最高值,半衰期均为69.32 min。不同剂量给药后,脑透析液中TSA浓度差异显著(P<0.05),达峰浓度、药时曲线下面积随剂量而升高,平均驻留时间为102.90~170.48 min。结论本研究建立稳定可行的TSA在体脑微透析取样体系和UPLC-MS/MS定量方法,并用于治疗时间窗内TSA脑透析液药动学研究。TSA溶液在正常和模型大鼠脑脊液中分布迅速,病理状态使TSA脑内分布浓度增加。本研究为TSA早期预防和治疗CIRI用药合理性提供依据。

一种新的基于微透析技术研究靶器官药代动力学方法

目的:采用微透析技术结合液相色谱-质谱联用法(LC-MS/MS)研究金刚烷胺在大鼠纹状体细胞外液中的药代动力学(药动学)过程,探讨靶器官药动学研究方法。方法:SD大鼠(雄性,8~10周龄)行乌拉坦麻醉(1.0 g/kg)后,手术植入微透析探针于大鼠纹状体,以人工脑脊液恒速(2μL/min)灌注探针。灌注1 h后,腹腔注射盐酸金刚烷胺(1.0 mg/kg),注射后立即收集透析液样本,样本收集间隔时间为12 min,连续6 h。用LC-MS/MS法检测透析样本中金刚烷胺浓度,药物浓度-时间曲线及计算药动学参数用DAS软件拟合。结果:金刚烷胺在大鼠纹状体细胞外液中浓度-时间变化呈一室开放模型,其主要药动学参数T_(max)、C_(max)、t_(1/2)和AUC_(0-∞)为(1.78±0.59)h、(38.56±9.10)μg/L、(2.07±0.35)h和(591.84±278.39)μg/(L·h)。结论:本实验建立了一种基于微透析采样结合LC-MS/MS法研究金刚烷胺在大鼠纹状体细胞外液中药代动力学过程的实验方法,该方法操作简单、灵敏度高,为研究药物在靶器官中的药动学过程提供了方法学基础。

液-质联用测定家兔血液及关节微透析液中青藤碱

目的:建立家兔血液及关节微透析液中青藤碱的高效液相色谱-质谱联用测定方法,并应用于青藤碱在家兔体内的整体药动学及局部药动学的研究。方法:采用Hypersil GOLD C18柱(150mm×2.1mm,3μm),流动相为甲醇-0.1%甲酸(30∶70),流速0.2mL·min-1,质谱为电喷雾离子源,选择反应离子监测,质荷比为239和181,采用外标法,微透析样品直接进样分析。结果:在0.336～172μg·L-1范围内呈线性关系良好,r=0.9972,定量下限为0.336μg·L-1,低、中、高浓度质控样品的日内及日间精密度符合要求。结论:本方法灵敏度高,操作简便,能满足体内微透析样品中低浓度的测定。

微透析技术联用UPLC-Q/TOF-MS的大脑中动脉栓塞大鼠代谢组学研究

目的研究大脑中动脉栓塞(MCAO)大鼠的脑纹状体代谢组学特征。方法采用线栓栓塞大脑中动脉以复制MCAO大鼠模型,脑纹状体植入微透析探针,清醒、自由活动状态下采集脑微透析样品,正、负离子模式下超高效液相色谱-飞行时间质谱(UPLC-Q/TOF-MS)测定脑微透析样品,多元统计建立代谢组学模型。结果成功进行了微透析技术的脑靶向性代谢组学研究,代谢组学模型可明显区分对照组和模型组,发现并鉴定了7个差异代谢物。结论MCAO大鼠脑代谢特征发生了明显改变,基于微透析技术的代谢组学研究丰富了代谢组学的研究方法。

人参皂苷Rg_1脑、血微透析探针体内外回收率研究

目的以人参皂苷Rg_1为检测药物,研究脑、血微透析探针的体内外回收率。方法采用正透析法和反透析法进行人参皂苷Rg_1脑、血微透析探针体内、体外回收率的研究,采用LC-MS/MS测定微透析液中人参皂苷Rg_1的浓度,计算探针回收率。结果在流速为1.5μL·min^(-1)时,脑、血探针体内回收率在10 h内保持稳定,平均回收率分别为17.0%和34.4%;恒定流速下,质量浓度(50,200,500,1 000 ng·mL^(-1))对脑、血探针回收率均无影响;恒定浓度下,探针体内外回收率均随着流速(0.5,1.0,1.5,2.0,3.0μL·min^(-1))的增加而减小,脑、血探针的体外正透析法测的回收率分别为(40.6±4.3)%,(23.5±2.3)%,(17.7±0.8)%,(12.2±1.1)%,(8.8±0.6)%和(70.6±3.6)%,(46.0±2.1)%,(32.9±1.6)%,(25.6±0.7)%,(18.2±1.3)%,正、反透析法所测得的探针体外回收率一致,且体内和体外回收率结果也一致;使用不超过3次的探针,经过恢复处理后,仍然能够保持较高的回收率。结论反透析法能够作为人参皂苷Rg_1脑、血微透析探针体内回收率的测定方法,微透析技术能够用于人参皂苷Rg_1脑细胞间液、血液药动学的同步研究。

应用微透析技术测定天麻素对大鼠脑内乙酰胆碱释放量的影响

目的:考察天麻素对大鼠脑内乙酰胆碱释放的影响。方法:大鼠皮下给药后利用脑内微透析技术进行连续动态取样,建立高效液相色谱-串联四极杆质谱定量分析方法测定脑透析液中的乙酰胆碱含量,考察不同剂量给药前后大鼠脑内不同部位乙酰胆碱释放量的变化。结果:实验发现天麻素皮下给药能剂量相关地增加大鼠脑内不同脑区中乙酰胆碱的释放。结论:天麻素的脑内作用机制可能与其对胆碱能神经递质释放的调节作用有关。

乌头碱皮肤微透析体内回收率研究

目的:建立乌头碱的液相色谱-质谱联用(LC-MS-MS)含量测定方法,测定乌头碱微透析体内回收率并考察其稳定性。方法:采用反透析法测定回收率,考察流速、浓度、时间对回收率的影响。结果:反透析法测定的回收率与浓度、时间无关,稳定性良好,随流速增加回收率降低。结论:微透析取样技术可用于乌头碱的药动学研究,体内研究的反透析法可作为微透析研究中乌头碱回收率的测定方法。

液质联用法测定透析患者体内西那卡塞的血药浓度

目的建立一个灵敏度高,专属性好的高效液相色谱-质谱联用(HPLC-MS/MS)测定透析患者血浆中西那卡塞的浓度。方法利用固相萃取(SPE)对血浆进行前处理,盐酸芬地林为内标(IS),采用内标法对药物进行定量。液相条件中色谱柱:Inertsil SIL-150A(2.1 mm×50 mm,5μm),保护柱:Inertsil SIL-150A(3.0 mm×50 mm,5μm),乙腈-水-甲酸(90∶10∶1=V∶V∶V)等度洗脱,流速0.35 mL·min^(-1),质谱采用电喷雾离子源(ESI),正离子模式下多离子反应监测(MRM)扫描,选用离子对为西那卡塞m/z 358.1→155.1,盐酸芬地林m/z 316.0→212.1,利用所建立的方法对口服25 mg西那卡塞(1片)的透析患者24 h内的血药浓度进行检测。结果西那卡塞在0.1~50 ng·mL^(-1)内呈良好的线性关系,准确度和精密度均在±15%以内,质控样品经长期存储或反复冻融以及样品处理后在进样器中的稳定性均在1.4%~3.9%内。西那卡塞的基质效应分别为(104.5±3.1)%、(105.6±4.3)%和(104.0±3.1)%,所有样品IS的基质效应为(106.4±3.0)%,符合生物样品定量分析方法验证指导原则的基本要求,能够满足对西那卡塞血药浓度的测定。结论本实验建立了一个专属性强,灵敏度高,重现性好的HPLC-MS/MS方法,能够准确,快速的测定透析患者体内西那卡塞的血浆药物浓度。

青藤碱给药后家兔血液及关节液中药物浓度变化的关系

目的利用微透析技术考察青藤碱给药后家兔血液及关节液中药物浓度变化的关系。方法将微透析探针植入家兔血液及膝关节液中,家兔灌胃给药或膝关节处经皮给药或腹部经皮给药50 mg/kg后,收集家兔血液及关节液中的微透析样品,采用HPLC-MS法测定微透析样品中青藤碱的浓度,观察家兔血液及关节液中青藤碱浓度变化的规律。结果不同的给药途径,不同的给药部位,血液和关节液中的青藤碱浓度变化的趋势是相似的,但灌胃给药和腹部经皮给药,血液和关节液中的青藤碱浓度差异有统计学意义(P<0.05),而膝关节处经皮给药后血液和关节液中的青藤碱浓度差异无统计学意义(P>0.05)。结论青藤碱给药后血液和关节液中的药物浓度变化趋势是相似的,但浓度高低与给药途径及给药部位有关。

血液透析联合血液灌流治疗对清除维持性血液透析患者体内蛋白结合类毒素的长期临床研究

目的观察长期血液透析(hemodialysis,HD)联合血液灌流(hemoperfusion,HP)治疗对维持性血液透析(maintenance hemodialysis,MHD)患者体内蛋白结合类毒素(protein-bound uremic toxins,PBUT)水平的影响。方法选取46例MHD患者,分为HD+HP组及HD组。HD+HP组(n=22)采取HD(2次/周)和HD+HP(1次/周)治疗;HD组(n=24)采取HD治疗(3次/周)。随访观察36周,测定试验前、12、24、36周透前PBUT水平。PBUT包括马尿酸(hippuric acid,HA)、硫酸吲哚酚(indoxyl sulphate,IS)、硫酸对甲酚(p-cresyl sulphate,PCS),测定方法为高效液相色谱-串联质谱(high-performance liquid chromatography/tandem mass spectrometry,HPLC-MS/MS)。结果经过36周随访观察,HD+HP组的3种毒素水平在整个研究期间均低于HD组。结束时,HD+HP组HA、IS、PCS分别下降33.5%、12.8%和24.2%,HD组分别上升2.3%、21.8%和2.8%,血清HA、PCS、IS浓度下降HD+HP组大于HD组(P<0.05)。结论长期应用血液透析联合血液灌流能更加有效地清除PBUT,使之维持在较低水平。