地中海拟无枝酸杆菌甲基丙二酰CoA变位酶和消旋酶的纯化及性质

采用原生质体裂解方法确定甲基丙二酰CoA变位酶(MCM)和消旋酶(MCR)均是胞浆内酶。各经过四步纯化得到电泳纯酶。纯化MCM酶的比活力为12.84u/mg,纯化倍数为528,酶活回收为60％,纯化的MCM酶服从典型的米氏底物饱和曲线,对琥珀酰CoA和辅酶B_(12)的K_m值分别为9.723#mol/L和0.1277#mol/L。经SephadexG-150测定MCM分子量约为134.000±2000,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳显示两条分子量分别为67000和65000的蛋白带,说明该酶由两个大小不等亚基组成。吸收光谱测定每摩尔纯化全酶含两摩尔辅酶B_(12)。纯化MCR酶比活力为2.305u/mg,纯化倍数96,酶活回收46.7％。MCR酶由两个分子量均为17500的亚基组成。MCR酶活性能被二价金属离子Cu^(2+)、Co^(2+)、Mg^(2+)、Mn^(2+)和Fe^(2+)所促进。两酶的酶学性质和其他生物来源的MCM、MCR酶明显相似。

地中海拟无枝酸杆菌甲基丙二酰CoA转羧基酶的纯化及酶学特性

经硫酸铵沉淀，ＤＥＡＥ－纤维素吸附，磷酸纤维素吸附和Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ分子筛层析四步从地中海拟无枝酸杆菌纯化得到电泳纯ＭＣＴ酶，酶比活力为３．２１Ｕ／ｍｇ，纯化倍数１７８，酶活回收１４．９％。酶反应的最适ｐＨ和温度分别为７．０和３５℃。纯化ＭＣＴ酶对底物丙酰ＣｏＡ和草酰乙酸的米氏常数分别为０．０２７ｍｍｏｌ／Ｌ０．０３５０９ｍｍｏｌ／Ｌ．经ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－１５０测定酶分子量为２０００００，ＳＤＳ－取丙烯酰胺电泳凝胶显示一条分子量６８０００的亚基蛋白带，说明该酶由三个等大小亚基组成．薄层等电聚焦测定酶等电点为ｐＩ６．０．二价金属离子Ｃｏ￣（２＋）和Ｆｅ￣（３＋）促进酶活力．采用原生质体裂解的方法发现ＭＣＴ酶是可能分布于胞浆和细胞膜上．

地中海拟无枝菌酸菌U32中生物素羧基载体蛋白结构基因的克隆、表达及转录

乙酰辅酶A羧化酶 (AcetylCoACarboxylaseEC 6.4.1 .2 ,ACC)催化依赖于ATP的乙酰辅酶A羧化形成丙二酸单酰辅酶A ,该反应是脂肪酸生物合成途径中的第一步 ,也是受到调控的关键一步。根据结核分枝杆菌 (M .tuberculosis)和天蓝色链霉菌 (S .coelicolor)中ACC -α亚基的氨基酸保守序列和地中海拟无枝菌酸菌U32对氨基酸密码子的使用偏好 ,设计简并引物以U32基因组DNA为模板扩增出一条约 2 5 0bp的片段 ,并以此片段作探针成功地从U32基因组cosmid文库中克隆到相应的ACC -α亚基的编码基因accA。该基因对应的ORF长1 797bp,编码一个 5 98个氨基酸的蛋白 ,推算出的分子量是 63,71 4Da ;基因G +Cmol%含量为70 .1 % ,符合U32基因结构特征 ,距起始密码子GTG上游 6个碱基处有链霉菌典型的RBS序列AGGAGG ,并有生物素羧化酶特征的ATP结合区。利用pET2 8(b)系统构建表达载体 ,在E .coliBL2 1 (DE3)中实现了accA的诱导表达 ,产物大部分以可溶形式存在 ,并通过WesternBlot证明该蛋白上确有共价结合的生物素。NorthernBlot分析了各种氮源对accA基因转录水平的不同影响。

地中海拟无枝酸菌原生质体电融合及其在提高利福霉素SV发酵效价中的应用

对产利福霉素SV的地中海拟无枝酸菌 (Amycolatopsismediterranei)原生质体进行热灭活和紫外灭活标记 ,其热灭活条件为 5 2℃ ,1.5h ,紫外灭活条件为紫外线照射 ( 15W ,2 5cm ,2 70nm) 6 0min。将双灭活标记的原生质体用CRY 3型细胞融合仪进行电融合 ,得出 :成串电流频率 1.5MHz ,电压 5 8V ,成串时间 2 0s ,融合脉冲幅宽 80 μS ,融合电压 5 0 0V ,融合槽间距 0 .5mm时 ,融合率最高为 9.3× 10 -4 。对筛选的融合子产量试验表明 ,5 0 %以上的融合子产量高于出发菌株 ,有明显的正变作用 ,将融合子在利福霉素代谢类似物平板上分离纯化 ,获得了化学效价提高 30 %以上的产量稳定菌株。

地中海拟无枝菌酸菌U32染色体特性的脉冲场电泳分析

地中海拟无枝菌酸菌 (Amycolatopsismediterranei)U32是产力复霉素SV的工业生产菌株。采用脉冲场电泳分析发现 ,地中海拟无枝菌酸菌U32仅有一条约 1 0Mb的线性染色体 ,没有内源性质粒。利用Southern杂交法 ,对 1 1个编码力复霉素生物合成、相关初级、次级代谢关键酶以及调控蛋白的基因 ,在U32染色体DNA的PshBI酶切片段上进行了定位。分析发现在一条长度约 70 0kb的PshBI酶切片段上 ,分别存在着力复霉素合成基因簇 (rif)、氮代谢的亚硝酸还原酶小亚基基因 (nasD)、衔接初级与次级代谢的甲基丙二酰变位酶基因 (mcm)、脂肪酸代谢的乙酰辅酶A羧化酶生物素载体蛋白基因 (accA)以及一套核糖体RNA转录单元。同时还发现U32至少有 5套核糖体RNA转录单元。其余定位的基因均只出现单一杂交信号。

Ca^(2+)和Mn^(2+)对地中海拟无枝菌酸菌(Amycolatopsis mediterranei)U-32次生代谢及激酶活性的影响

采用Ca2 + 、Mn2 + 和地中海拟无枝菌酸菌U 32共培养的方法 ,通过滤纸法检测抗生素含量和离体磷酸化反应检测激酶活性 ,研究Ca2 + 和Mn2 + 对地中海拟无枝菌酸菌U 32次生代谢的影响。低浓度Ca2 + 和Mn2 + 均能促进地中海拟无枝菌酸菌U 32的生长 ;随着离子浓度增高 ,促生长效果下降 ;浓度太高 ,则表现为抑制作用。 5mmol/LCa2 + 对地中海拟无枝菌酸菌U 32的色素绝对产量增加效果最好 ,而对其相对于菌体的色素量则以 5mmol/LMn2 + 的效果最好。 0 5mmol/LCa2 + 对地中海拟无枝菌酸菌U 32的抗生素合成有很好的作用 ,而Mn2 + 有一定的抑制作用。对地中海拟无枝菌酸菌U 32的无细胞提取液进行离体磷酸化反应检测 ,发现Ca2 + 能促进其激酶的活性 ,而Mn2 + 则相对抑制了某些激酶活性。

康乐霉素产生菌─—地中海诺卡氏菌康乐变种的分类鉴定

康乐霉素属于利福霉素族，其Ａ成份是一种新抗生素。康乐霉素产生菌１７４７－６４是从广州康乐县土壤中分离出来的，根据分类研究，菌株应归属于诺卡氏菌，是地中海诺卡氏菌的一新变种，定名为地中海诺卡氏菌康乐变种１７４７－６４（Ｎｏｃａｒｄｉａｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉｖａｒ．ｋａｎｇｌｅｎｓｉｓ１７４７－６４）。

利用同源重组建立地中海拟无枝菌酸菌U32染色体的基因置换/中断系统

地中海拟无枝菌酸菌U32是力复霉素SV的工业产生菌 ,其遗传操作一直是一个难题。在该菌株DNA高效电转化的基础上 ,利用同源重组的原理 ,建立了地中海拟无枝菌酸菌染色体的基因置换 中断系统。通过大肠杆菌重组质粒pDK110构建、转化及两步重组筛选 ,成功地用α 淀粉酶基因 (amy)取代了地中海拟无枝菌酸菌U32染色体上的 3 氨基 5 羟基苯甲酸合成酶基因 (ahbas)。第一步单交换和第二步双交换的频率分别是 0 5 %～ 0 7%和2 %。将质粒pDK110变性后转化可显著提高重组频率 ,在第二步筛选双交换前对单交换重组子进行电击也能够提高其双交换重组的频率。此外 ,通过转化构建的两端带同源区段的线性DNA片段及一步重组筛选 ,我们在地中海拟无枝菌酸菌U32染色体的amrD ,rifO基因中间插入了阿普拉霉素抗性基因 (apr) ,其效率约为 30～ 5 0转化子 μgDNA。

产利福霉素地中海拟无枝酸菌的电转化条件优化

目的 为了获得较高的地中海拟无枝酸菌的转化率，进行了电转化条件的优化。方法 以大肠埃希菌．拟无枝酸菌穿梭质粒pULVKl-Am为载体，地中海拟无枝酸菌为受体菌，考察了收集菌体时期、细胞壁弱化方式、电击缓冲液和电击参数等因素对转化率的影响。结果 以0．1gg／mL氨苄西林处理细胞，A600为0．7～0．8时收集菌体，用溶菌酶．LiAc-DTT溶液于37℃孵育30min，去离子水作电击缓冲液，7．5kV／cm、25gF、750W下进行电击，转化率最高可达到9．23×104CFU／μg质粒DNA。结论只有将不同机制的3种细胞壁弱化剂组合起来对拟无枝酸菌进行处理时，才能得到较高的转化率。

力复霉素产生菌地中海拟无枝菌酸菌U32丙氨酸脱氢酶基因克隆及表达

丙氨酸脱氢酶 (EC 1 4 1 1 )可逆催化丙氨酸脱氨生成丙酮酸和NADH。它是生物体内的氨基酸代谢和氨同化途径的关键酶。在地中海拟无枝菌酸菌 (Amycolatopsismediterranei)U32中 ,丙氨酸脱氢酶的活力与力复霉素的生物合成有负相关现象 ,其活力受KNO3全局效应的调控。根据结核分枝杆菌 (Mycobacteriumtuberculosis)和天蓝链霉菌 (Streptomycescoelicolor)的丙氨酸脱氢酶氨基酸的保守序列和地中海拟无枝菌酸菌U32对氨基酸密码子的使用偏好 ,设计一对简并PCR引物。以此引物从地中海拟无枝菌酸菌U32中扩增到一 5 5 5bp的片段 ,并以此片段为探针从地中海拟无枝菌酸菌U32基因组cosmid文库中成功的克隆到了丙氨酸脱氢酶结构基因 (ald)。它编码了一个 371个氨基酸的蛋白质 ,基因的GC含量为 72 5 % ,符合链霉菌的基因结构特征。在起始密码子的上游 6个碱基处 ,有一典型的链霉菌核糖体结合位点(RBS) :AGGAGG ,第 75位的氨基酸为赖氨酸 ,是丙酮酸结合位点。以pET2 8b为载体 ,在E .coliBL2 1 (DE3)中高效表达了ald基因。用IPTG在 2 2℃时诱导得到的丙氨酸脱氢酶活力最高。用His Tag柱纯化了表达的丙氨酸脱氢酶。酶学性质研究表明该酶专一性以L Ala和NAD(H)

地中海拟无枝菌酸菌U32中amrC/amkC基因的序列分析及在大肠杆菌中的表达

从力复霉素SV产生菌———地中海拟无枝菌酸菌 (Amycolatopsismediterranei)U32的硝酸盐同化基因簇的上游克隆了一个 2 6kb的EcoRI—XhoIDNA片段并测定其序列。序列分析表明 ,该DNA片段编码两个完整的开放阅读框架 (ORF) ,ORF2的起始密码子GTG与ORF1的终止密码子TGA在TG处重叠。ORF1编码一个含2 2 4个氨基酸的多肽 ,它同放线菌中典型的应答调节蛋白包括AfsQ1和MtrA有很高的同源性 ;ORF2编码一个含472个氨基酸的蛋白 ,它同包括AfsQ2和MtrB在内的组氨酸激酶同源。ORF1和ORF2有可能构成典型的双组份信号传导系统 ,分别命名为amrC和amkC。在T7启动子的控制下 ,完整的amrC和去除子N端一个可能的跨膜区的amkC在大肠杆菌中分别得到了高效表达 ,表达蛋白的分子量分别为 30kD和 46kD ,与推测蛋白的分子量一致。

锌离子影响地中海拟无枝酸菌合成有机酸和利福霉素SV

在10L发酵罐培养地中海拟无枝酸菌过程中基料添加Zn2+(终浓度0.75mg/L)对利福霉素SV效价和有机酸合成产生了显著影响。72h^141h胞外丙酮酸、丙氨酸浓度分别比对照提高了19.7%~93.72%和降低了37.69%~59.55%;同时,胞外谷氨酸、赖氨酸和苯丙氨酸的浓度分别比对照提高了7.62%~162.59%、1.99%~43.10%和25.84%~92.89%。胞外酪氨酸浓度(72h^120h)与对照差异不大,之后迅速提高,141h时酪氨酸浓度是对照组的2.56倍。利福霉素SV的效价在96h比对照提高了11.72%,120h时效价提高了9.1%;141h时效价仅比对照提高了3.5%。说明锌离子抑制了丙氨酸脱氢酶活性并引起丙酮酸积累,这使得丙酮酸流入三羧酸循环的碳通量增大,使由草酰乙酸衍生的赖氨酸和由α-酮戊二酸衍生的谷氨酸合成量增大,促进了利福霉素SV的合成。但是,丙酮酸的积累也促进了芳环氨基酸的合成(如酪氨酸、苯丙氨酸),其会协同抑制利福霉素的芳环前体3-氨基-5-羟基-苯甲酸的合成,这可能是效价中后期增长放缓的原因。

S-丙二酰转移酶基因失活对地中海拟无枝酸菌产利福霉素的影响

为提高利福霉素的产量,构建了S-丙二酰转移酶基因失活的地中海拟无枝酸菌。利用融合PCR构建S-丙二酰转移酶基因的同源重组载体,通过电击转化导入到地中海拟无枝酸菌中,使之发生同源重组,以安普霉素为标记,筛选了S-丙二酰转移酶基因失活菌株,并对比了突变菌株与原始菌株的利福霉素SV产量。成功构建了S-丙二酰转移酶基因的同源重组载体,获得了地中海拟无枝酸菌突变株A.mediterranei △fab D,失活菌株的利福霉素SV产量为168.08 mg/L,比原始菌提高了9.94%。S-丙二酰转移酶基因的失活,弱化了突变菌株脂肪酸的合成,强化了利福霉素的合成。

地中海拟无枝酸菌S699电转化方法的优化

地中海拟无枝酸菌S699(Amycolatopsis mediterranei S699)能够产生具有重要经济价值的抗生素———利福霉素B。在该菌株中建立高效的遗传操作系统是研究利福霉素生物合成机制以及构建基因工程高产菌株的基础。研究利用单因素试验探索了供体质粒的构型、甘氨酸溶度、MgCl2浓度及电转化参数对地中海拟无枝酸菌S699电转化效率的影响。结果表明,使用添加了0.05 g/L甘氨酸和2.5 mmol/L MgCl2的34%YEME培养基培养菌丝体,在9 kV/cm、25μF、550Ω的电转化条件下,以双链DNA为供体,转化效率最高可达到3.37×102个转化子/μg DNA。利用优化后的电转化方法,成功地获得了利福霉素生物合成基因簇中细胞色素P450氧化酶基因orf5的同源缺失突变菌株,证实了优化后的电转化方法可以很好地用于后期遗传学及利福霉素生物合成基因的研究。

地中海诺卡氏菌丙氨酸脱氢酶的纯化和性质

采用硫酸铵分部沉淀、DEAE纤维素-52柱层析和亲和蓝柱层析的方法,分离纯化了地中海诺卡氏菌(Nocardia mediterranei)U-32丙氨酸脱氢酶(ADH),用聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定为单一组份。以聚丙烯酰胺凝胶梯度电泳测得丙氨酸脱氢酶的分子量为228000,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测得其亚基分子量为38000,表明地中海诺卡氏菌U-32丙氢脱氢酶由六个相同的亚基组成。ADH加氨反应最适pH为8.5,脱氨反应最适pH为11.5,ADH的pH稳定范围在pH7.5—11.5。脱氨反应的最适温度为50℃。ADH的米氏常数K_m为:丙酮酸4.88×10^(-4)mol/L;NH_4^+ 4.03×10^(-3)mol/L;NADH 6.02×10^(-3)mol/L;L-Ala 7.45×10^(-3)mol/L;NAD^+ 6.67×10^(-3)mol/L。Hill作图法求得ADH的Hill系数n为:ADH对丙酮酸、NADH和NAD^+的Hill系数都为1;对L-Ala和NH_4^+的Hill系数n值分别为0.52和0.51,ADH对L-Ala和NH_4^+有负协同效应,由此初步推测ADH是一个调节酶。

筛选地中海拟无枝酸菌无痕基因敲除菌株的简便方法

将抗生素抗性基因作为标记筛选无痕基因敲除菌株比较费时,因而建立筛选无痕基因敲除菌株的简便方法。通过敲除茄红素生物合成途径中第一个反应的酶编码基因dxs(1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶基因),获得白色地中海拟无枝酸菌突变菌株,以此菌株为受体菌,对S-丙二酰转移酶基因(mtf)进行无痕敲除。针对菌落本身携带颜色的地中海拟无枝酸菌(橘红色),利用茄红素合成酶基因dxs无痕敲除获得了白色菌株,在此基础上进行mtf的无痕敲除。以茄红素生物合成途径中任意一个反应的酶编码基因作为标记,很容易筛选得到无痕基因敲除的突变菌株。

地中海诺卡菌的菌丝形态特征与产生利福霉素B的定量分析

在各种放线菌中,抗生素产生的起动(生理分化)与菌丝形态变化(形态分化)有密切关系。然而,高度分支的菌丝会增加培养基的粘度,影响正常的通气和混合,因而成为优化抗生素生产工艺中的主要问题。 利福霉素B系地中海诺卡菌产生。这种菌株的形态特征明显受培养条件的影响,而利福霉素B的产生又同形态变化密切相关。

巴比妥对地中海拟无枝酸菌的生长毒性及其与利福霉素B超产的关系

发展了一种筛选利福霉素Ｂ超产菌株的新方法。加有甘氨酸和巴比妥的合成培养基用诱变过的菌丝接种，培养 ４８ｈ后用溶菌酶处理。耐溶菌酶的菌丝用稀洗涤剂洗涤后种入含甘氨酸但不含巴比妥的合成培养基。所获得的原生质体再生后从中挑选菌落接种在加和不加巴比妥的Ｂｅｎｎｅｔ琼脂平板上。所挑选出的２株突变株对０．５％巴比妥敏感，其利福霉素产量比亲株高１倍。此外还分离出３０株耐巴比妥的突变株，但其产量均低于亲株。据此认为巴比妥对次级代谢（产生利福霉素）的影响与它对初级代谢的影响有关。

地中海嗜盐菌与大型海藻生物质亚临界水解产物用于生产聚羟基脂肪酸酯(PHA)

1研究亮点*运用嗜盐菌与海藻作为碳源生产可生物降解塑料,有望为解决塑料“白色污染”问题,实现绿色低碳可持续发展,维护全球环境安全提供新途径。2背景据统计,全球每年约消耗3.2×108 t吨塑料制品,其中不少在陆地和海洋等环境中形成积累,严重破坏了当地生态环境,寻找一种可持续的方法破解废物塑料带来的“白色污染”问题十分迫切。聚羟基脂肪酸酯(PHA)因其可通过生物途径合成,能作为有机垃圾回收并实现生物降解,性质安全无毒,相较于基于石油的传统塑料制品具备诸多优点而进入科研人员的视野,有望成为潜在的塑料替代品。

连作地黄根际土壤中固氮耐酚酸细菌的分离鉴定

以连作地黄根际土壤中的微生物为对象,筛选既能够固氮又能够耐受酚酸类物质的细菌,并对其进行鉴定,为克服连作障碍的菌剂开发提供菌种资源。通过阿须贝无氮培养基平板涂布及分离纯化试验,最终获得菌落形态特征鲜明的2株固氮菌:7号菌菌落湿润、边缘光滑、个体较大,橘黄色;12号菌菌落边缘光滑、个体较小,乳白色。耐酚酸试验结果显示,在125、250 mg/L对羟基苯甲酸浓度下,7号菌液的D_(600 nm)分别是对照组的2.78、1.93倍,12号菌液的D_(600 nm)分别是对照组的3.66、4.66倍,因此,2株固氮菌能有效耐受一定浓度的对羟基苯甲酸。生理生化分析结果显示,2株菌均具备水解淀粉、分解丙酮酸和产生吲哚的能力。16S rRNA测序及遗传进化分析结果显示,7号菌、12号菌分别与芽孢杆菌属的短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、假单胞菌属的地中海假单胞菌(Pseudomonas mediterranea)聚到一起,相似度均高于99%。