枯草芽孢杆菌表达系统研究进展

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的研究已有百年历史,但前期工作仅限于分离鉴定、形态观察和功能鉴定。枯草芽胞杆菌是一类属于芽孢杆菌属的革兰氏阳性细菌,其粒径大小为(0.8~1.2)微米×(1.5~4.0)微米,主要存在于土壤和腐败的有机物中,是一类杆状好氧细菌,也是一种常见的蛋白表达宿主,具有易培养、无致病性、发酵工艺完善等优点,可用于多种工业酶的高效表达。然而,枯草芽胞杆菌的高效表达体系还不够理想。本文对枯草杆菌高效表达体系的研究进展进行了综述,以期为该菌株的高效表达奠定基础。

河南省土壤中芽孢杆菌属资源调查

为了解河南省土壤中芽孢杆菌资源状况,获得一批有应用价值的菌株,从河南省不同地区的土壤中分离纯化需氧芽孢杆菌。采用平板分离法从22个土样中获得415株纯培养物,对其进行形态学特征观察与测量、生理生化试验测定,并依据伯杰氏系统细菌学手册进行菌种鉴定,它们分属于14个不同的芽孢杆菌菌种。其中检出率较高的3个菌种依次为枯草芽孢杆菌(22.4%),蜡状芽孢杆菌(16.1%),蕈状芽孢杆菌(12.5%)。出土率大于60%的5个菌种分别是蕈状芽孢杆菌(86.4%),蜡状芽孢杆菌(81.8%),枯草芽孢杆菌(77.3%),坚强芽孢杆菌(68.2%),巨大芽孢杆菌(63.6%)。分析发现,不同农作区的优势菌种种类及其检出率不同,与地理条件和耕作制度有一定关系。从产酶种类、耐盐性、产酸能力、解磷能力等方面进行分析,部分菌株可以作为微生物酶制剂、微生物肥料生产的待选菌株。

短芽孢杆菌属菌株几丁质酶分离纯化及其抗真菌活性的初步测定

以本室筛选的海洋产几丁质酶短芽孢杆菌属（Bacillus brevis sp）菌株Bspl，经往复式摇床振荡培养96h后，发酵液先后采取75％的硫酸铵盐析、透析、几丁质亲和层析和SDS-PAGE等方法对几丁质粗酶液进行分离纯化和鉴定。几丁质亲和层析一步纯化后，经过SDS-PAGE电泳测定该酶的分子量为22．8ku，其比活力为86．65，纯化倍数为1．707，产率为32．1％。纯化的几丁质酶能抑制病原真菌的生长，对病原真菌的拮抗作用具有广谱性，

固态发酵白酒生产中芽孢杆菌属细菌产乳酸特性及降乳研究

本文对白酒生产现场分离纯化的芽孢杆菌属细菌产乳酸的状况及条件进行了研究，确认在白酒生产中，这些菌株是产生乳酸的重要菌类。菌株在以葡萄糖为碳源、蛋白胨为氮源、于３０～４０℃静置培养时可得到多量乳酸。发现有机物Ｃ－Ⅱ以０．０５％的加量添加到酒醅中时，白酒基酒中乳酸乙酯含量平均可降低２１．９％。

类芽孢杆菌属β-葡萄糖苷酶在大肠杆菌中可溶性重组表达的优化

目的:β-葡萄糖苷酶在食品工业领域具有广泛的应用价值,但重组表达时容易形成无活性的包涵体。通过传统诱导条件优化无法完全解决包涵体积累问题,需探索新的策略。方法:从类芽孢杆菌属(Paenibacillus sp)基因组中克隆获得了β-葡萄糖苷酶基因bgl,构建到大肠杆菌表达载体p ET28a获得重组质粒p ET-bgl,转化大肠杆菌宿主细胞BL21(DE3)获得重组菌BL-ETbgl,并进行诱导条件优化。进一步通过复制起始位点替换,构建了新型大肠杆菌表达载体p ACYT-bgl,转化大肠杆菌宿主细胞BL21(DE3)后得到改进型重组菌BL-ATbgl。结果:BL-ETbgl经诱导表达后,所表达重组蛋白具有β-葡萄糖苷酶活性。经诱导条件优化后,仍有40%蛋白以包涵体存在。而BL-ATbgl经诱导表达后,可溶性的重组β-葡萄糖苷酶约占80%。自诱导培养基中β-葡萄糖苷酶产量可达2.31×106U/L。结论:通过降低质粒拷贝数、优化培养条件等手段,可以大幅度提高类芽孢杆菌β-葡萄糖苷酶在大肠杆菌中的可溶性表达水平。

芽孢杆菌属(Bacillus)二分检索表

根据《伯杰氏系统细菌学手册》，提出了芽孢杆菌属（Ｂａｃｉｌｕｓ）的二分检索表，并附芽孢杆菌属的新种以及相关的新属。

芽孢杆菌属一新种的鉴定

从萧县盐碱地土样中分离到一株耐盐耐碱芽孢杆菌,其可在NaCl浓度为5%～10%的培养基中生长良好,耐碱性可达pH值为11.该菌好氧,菌体杆状,具芽孢,芽孢椭圆形,膨大,端生,菌体常连成线丝状,细胞大小为(0.6～0.8)μm×(2.5～4)μm,菌落白色大型,中有一色浅圈,边缘向周围延展成波纹状,菌落中部较厚,不透明,边缘延展部分较薄,无色透明.该菌接触酶阳性,水解淀粉,硝酸盐还原,L—阿拉伯糖和D—木糖不产酸,不利用柠檬酸盐,V·P反应阴性,在V·P肉汤中生长后pH为6.5～7,形成吲哚、溶菌酶(0.001%)不敏感.根据这些特征,该菌应归芽孢杆菌属(Bacillus),同时又不同于该属的其它已知菌株,因此将它定为新种,命名为耐盐耐碱芽孢杆菌(Bacillushaloalkaloresistatsp·nov·).

来源于类芽孢杆菌属碱性甲壳素酶的分离纯化及其性质（英文）

甲壳素,又名几丁质(chitin),是自然界中含量仅次于纤维素的第二大天然多糖,有第六生命要素之美称.其主要存在于甲壳类动物的外壳、真菌细胞的细胞壁以及一些昆虫的外壳中,每年自然界中约有100多亿吨甲壳素生成.甲壳素是由2-乙酰氨基-2-脱氧-D-吡喃葡萄糖和2-氨基-2-脱氧-D-吡喃葡萄糖通过β-1,4糖苷键连接而成的二元线性聚合物,分子链中分布许多羟基、氨基及乙酰氨基,形成大量分子间及分子内氢键,致使其结晶度较高,化学性质十分稳定,直接利用较为困难.甲壳素不溶于稀酸、稀碱以及一般有机溶剂,工业上常用强酸强碱法处理甲壳素,以制备壳寡糖类产品,但该方法具有产品结构不单一,环境污染较为严重等缺点.甲壳素酶可特异性水解甲壳素链中β-1,4糖苷键,得到甲壳寡糖和乙酰氨基葡萄糖.酶解法降解甲壳素工艺简单、反应条件温和、环境友好,有很好的应用前景.我们以Paenibacillus pasadenensis CS0611为出发菌株,以蟹壳粉末为培养基唯一碳源及氮源,在适宜条件下培养48h.发酵液经离心、硫酸铵(80%饱和度)盐析、透析除盐后得到粗酶液.再利用HiTrap DEAE FF离子交换层析和HiLoad 26/600Superdex 200pg凝胶过滤层析对该粗酶液进行分离纯化,以得到电泳纯甲壳素酶.所制备甲壳素酶比活力为10.28U/mg,最终纯化倍数为5.3,酶活得率为15.7%.SDS-PAGE结果表明,该甲壳素酶相对分子质量约为69 kDa.后经MALDI-TOF-MS鉴定,该酶部分肽段和来源于另一株Paenibacillus pasadenenss的甲壳素酶(accession No:gi655151624)具有较高的同源性,进一步证实所纯化蛋白为甲壳素酶.对上述纯化的甲壳素酶的酶学性质进行研究,结果发现:其最适反应温度为50℃,在20-35℃内有较好的稳定性,50℃及以上热稳定性较差;最适pH为5.0,在pH4.0-11.0间具有较高稳定性,表明该酶具有很好的耐碱性;金属离子对该酶催化活性没有明显的激活作用,表明该甲壳素酶是非金属酶.同时,对该酶的底物特异性进行研究,发现该酶对胶体甲壳素和甲壳素水解能力较强,对淀粉和纤维素无水解能力,对不同脱乙酰度的壳聚糖的水解程度随脱乙酰度不同而变化,表明该酶只能特异性识别并降解GlcNAc-GlcNAc之间的糖苷键;以胶体甲壳素为底物时,米氏常数K_m为4.41 mg/mL,最大反应初速度为1.08 mg/min.利用薄板层析和高效液相色谱对酶解产物进行分析,结果表明该甲壳素酶对胶体甲壳素的降解产物主要是(G1cNAc)_2.综上所述,本研究所涉甲壳素酶在甲壳二糖的酶法制备方面具有较好的应用前景.

来源于类芽孢杆菌属新型耐有机溶剂脂肪酶的克隆、表达与性质研究（英文）

脂肪酶(EC 3.1.1.3)全称为三酰基甘油水解酶,是一类能够将长链脂肪酸甘油酯水解成脂肪酸和二甘酯、单甘酯或甘油的酯键水解酶.它除了能够水解脂肪外,还具有催化酯化反应、酯交换反应、酸解反应、醇解反应以及氨解等反应的性质.在脂肪酶催化的反应中,通常用有机溶剂代替水.有机溶剂可以转移合成反应的平衡方向,通过溶剂工程修饰酶的选择性能够提高底物的溶解度、有机相产物的回收率、酶的热稳定性.但有机溶剂对酶活性和稳定性有不同程度的影响.因此,寻找在有机溶剂中表现出高活性和稳定性的脂肪酶是一个亟待解决的重要课题.由于微生物种类多、作用底物专一性强,且微生物来源的脂肪酶一般分泌到胞外,因此微生物脂肪酶是工业用脂肪酶的重要来源.目前,微生物脂肪酶的研究主要集中于根霉属(Rhizopus)、曲霉属(Aspergillus)、青霉属(Penicillium)、毛霉属(Mucor)、地霉属(Geotrichum)、假丝酵母属(Candida)、假单胞菌属(Pseudomonas)、伯克霍尔德菌属(Burkholderia)等具有工业应用价值的菌株.很少有类芽孢杆菌属所产脂肪酶进行相关酶学性质的研究.我们以Paenibacillus pasadenensis CS0611为出发菌株,在全基因序列草图中得到了一个新型脂肪酶基因lp2252.以Paenibacillus pasadenensis CS0611基因组为模板,设计特异性引物对目标序列进行扩增,并成功将其插入到表达载体p ET-28a中得到含有目的基因的重组质粒.在E.coli BL21(DE3)中,脂肪酶lp2252经0.1mmol/L的IPTG诱导后在20°C实现了高水平表达.重组脂肪酶的活性约为野生型的1631倍.用镍离子亲和层析柱快速、高效地纯化了两端带有组氨酸标签的重组脂肪酶,回收率为63.5%,纯化因子为10.78.纯化后的脂肪酶最适温度为50°C,在20-40°C范围内具有良好的稳定性.最适pH值为7,属于中性脂肪酶,同时在pH 3.0-8.0间具有较高稳定性.在金属离子如钙、镁离子和一些非离子表面活性剂的作用下,其活性有所提高.此外,纯化后的脂肪酶可被一系列水溶性有机溶剂激活,例如一些短链醇.而对某些水不溶性有机溶剂,其也具有高度的耐受性.综上所述,本文所涉新型脂肪酶在非水相催化领域具有广泛的应用和前景.

副干酪乳杆菌与芽孢杆菌属共培养种间关系对产细菌素的影响

为使芽孢杆菌属与副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)通过种间信息交流形成稳定的小生态环境,加大芽孢杆菌属的初始接种量,来探究L.paracasei HD1.7与其共培养的生态学关系。结果表明,将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)与L.paracasei HD1.7以5%:1%的初始接种比例共培养,L.paracasei HD1.7所产细菌素为其单培养的1.21倍,群体感应相关基因luxS,prcK和prcR分别上调表达3.14、4.98和5.41倍。同时,B.subtilis形成更多的芽孢以回避细菌素的攻击,芽孢形成相关基因spo0A,sigE,sigF和sigG分别上调2.37、2.71、3.15和2.56倍。此时,二者形成了一种协同合作的生态关系。冗余分析结果表明,共培养体系中与细菌素产生关系最为密切的是芽孢数量、培养时间以及B.subtilis活菌数。L.paracasei HD1.7与芽孢杆菌属之间存在不同的生态关系,有与之共培养后对L.paracasei HD1.7偏利的芽孢杆菌,也存在对其偏害的芽孢杆菌。

地芽孢杆菌属DYth03 DNA聚合酶基因的克隆、表达及性质分析

从东太平洋热液区E53站位的深海沉积物样品中分离出1株能在65℃生长的嗜热菌(DYth03).该菌的16S rDNA序列与地芽孢杆菌属(Geobacillus)内各种之间的同源性为98%以上.克隆得到DYth03的DNA聚合酶基因(DYth-pol),序列分析表明该基因全长为2 631 bp,G+C含量为55.5%,推测编码为876个氨基酸,与BstDNApolI的同源性最高(达98%).将该聚合酶基因克隆到pTTQ-h表达载体上,并在大肠杆菌DH1中进行表达.对纯化到的表达产物进行酶活性测定,结果表明该酶具有聚合酶活性和5’-3’外切酶活性.

芽孢杆菌属微生物腐蚀研究进展

研究发现金属腐蚀部位存在芽孢杆菌属微生物,其中有些种形成的微生物膜被认为可能是一种潜在的抑制微生物腐蚀的有效方法。本文拟对国内外有关芽孢杆菌属微生物腐蚀的研究现状进行综述,探讨芽孢杆菌属生物膜在金属腐蚀中的作用,分析芽孢杆菌属微生物腐蚀的研究趋势。

生乳中芽孢杆菌属芽孢的分布

生乳中芽孢杆菌属芽孢的分布龟井俊郎［日］等设定牛乳等低酸性食品的加热杀菌条件．必须把污染原料的微生物，尤其是把耐热强的细菌芽孢列为指标，并将其杀死为目的。形成细菌芽孢的有芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）；棱状芽孢杆菌（Ｃｌｏｓｌｒｉｄｕｍ）；芽孢乳杆菌（...

微板核酸杂交检测芽孢杆菌属的方法建立

以白酒发酵过程中的优势菌枯草芽孢杆菌为模式菌株,针对具有高保守性及特异性的16SrRNA设计一组核酸探针,建立了对芽孢杆菌属进行定性和定量分析的新型的微板核酸杂交检测方法,优化了关键检测条件。结果表明,当S1酶反应温度为42℃时,芽孢杆菌属检测探针能分开目标序列仅差一个碱基的近缘属。当捕获探针和信号探针工作浓度均为5nmol/L,与分析探针杂交温度都为50℃,杂交时间分别为60min和15min时,检测信号的强弱与细菌数呈良好的线性关系,能实现定量检测,灵敏度高达1.33×102cells/mL。本方法提供了一个快速定性定量的检测技术,具有很好的应用于白酒发酵过程中芽孢杆菌属实时监测的潜力。

芽孢杆菌属来源产尿酸氧化酶菌株的筛选、鉴定及酶学性质研究

尿酸氧化酶是一类可将尿酸氧化为尿囊素的酶,在动植物和微生物中普遍存在,但人类及猿类体内并未发现这一类酶,人体内尿酸过高常会引发高尿酸血症、痛风等相关疾病。如今痛风等疾病发病率日渐上升,尿酸氧化酶的研究也备受关注。本研究选取青海省茶卡盐湖样品通过富集培养、筛选纯化等方法获得一株编号为2YHBJ-3产尿酸氧化酶的细菌。经过16S rRNA鉴定,鉴定为芽孢杆菌属(Bacillus)菌株。该菌株最佳发酵时间为48 h,其所产的酶活力为0.0085 U/mL,最适作用pH为6.6,最适温度为20℃;在温度为15℃~50℃及pH为5.0~8.0范围内,该酶能够保持50%相对活性;Mg2+、Fe2+能够明显提高其酶活力,Cu2+及SDS对其表现出强抑制作用。这预示着该芽孢杆菌属菌株对于尿酸氧化酶的开发利用具有一定潜在价值,为后续的医药开发提供酶力资源。

土耳其研究冰湛淋中蜡样芽孢杆菌属细胞的产毒基因、腐败潜能以及抗菌能力

芽孢杆菌可以在环境中几乎任何地方都能检测到。它在食物中也很容易被检测到，并且会造成食物腐败，而由于它产生毒素和致病的性质以及其胞外酶，也可能造成食物中毒。

我国在秦始皇兵马俑1号坑土壤中发现芽孢杆菌属一新种

据2014年2月21日《光明日报》报道，福建省农业科学院刘波团队从豢始皇兵马俑l号坑土壤分离的FJAT-13831T菌株，这是世界上首次发现的一种地璩微生物：芽孢杆菌属的新种，命名为兵马俑芽孢杆菌（Bacillus bingmayon-gensissp．nov．），可为人类开发利用芽孢杆菌提供新材料。相关研究成果发表在国际权威的《列文虎克微生物学杂志》网络版，并还将于3月份在该刊印刷版刊发。

凝结芽孢杆菌TBC-169菌株治疗抗原诱导大鼠结肠炎的实验研究

背景:开发新的溃疡性结肠炎(UC)治疗药物是当前研究的热点。目的:探讨凝结芽孢杆菌(B.coagulans)TBC-169菌株对抗原诱导的大鼠结肠炎的疗效和作用机制。方法:以牛结肠黏膜蛋白多次免疫建立大鼠结肠炎模型,予B.coagulansTBC-169菌株制剂和美沙拉秦单独或联合治疗。21d后处死大鼠,评定结肠湿重指数、溃疡指数和组织学评分,测定肠系膜淋巴细胞转化率和血清白细胞介素(IL)-8、肿瘤坏死因子(TNF)-α、IgG水平。结果:美沙拉秦组、大剂量B.coagulans组和联合治疗组结肠湿重指数较模型对照组显著降低(P<0.05)。各治疗组结肠溃疡指数和结肠中上段组织学评分较模型对照组显著降低,T细胞转化率显著升高,血清IL-8水平显著降低(P<0.05)。与模型对照组相比,大剂量B.coagulans组和联合治疗组血清TNF-α水平显著降低(P<0.01),小剂量B.coagulans组血清IgG水平显著降低(P<0.01),单用美沙拉秦则无类似作用。结论:B.coagulansTBC-169菌株可明显改善模型大鼠的结肠黏膜损伤,其机制与调控炎症因子表达、恢复机体免疫功能等有关。

一株海洋芽孢杆菌的鉴定及抗菌活性研究

目的:对一株编号为ZJ8112的分离自东海海域海泥样品的细菌进行鉴定和抗菌活性研究。方法:采用传统的分类学方法观察菌株ZJ8112的形态、耐盐度,结合16S rDNA序列分析在GenBank上进行比对以确立其进化地位。利用稻瘟霉菌(Pyricularia oryzae)P-2b、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、大肠埃希菌(Escherichia coli)、啤酒酵母(Saccharomy cescerevisi-ae)、白念珠菌(Candida albicans)和黄瓜黑星病菌(Cladosporiumcu cumerinum)作为抗菌活性指示菌,检验ZJ8112的抗菌活性。结果:枯草芽孢杆菌ZJ8112革兰染色阳性,芽孢中生。其最佳生长盐度为10%,属于中等嗜盐菌。通过16S rDNA序列分析发现其与Bacillus subtilis F121112在进化位置上最为接近。该菌株的16SrDNA序列已经提交GenBank,接受号为EU100745。综合ZJ8112菌株的培养特性和形态特征,可认为ZJ8112是一株海洋芽孢杆菌。抗菌活性研究的结果表明其具有很强的抗稻瘟霉菌和抗大肠埃希菌活性。结论:ZJ8112为中等嗜盐的海洋细菌,其最适盐度为10%。生物学活性研究的结果表明,其发酵液具有很强的抗稻瘟霉活性和抗大肠埃希菌活性,具有潜在的抗生素研究的价值。