地衣芽孢杆菌2709和6816碱性蛋白酶基因在大肠杆菌中的克隆、表达及序列分析

用PCR方法从地衣芽孢杆菌 2 70 9和 6 816中扩增了碱性蛋白酶基因 (apr1和apr2 ) ,扩增的DNA片段插入到大肠杆菌载体 pET -2 8a中 ,构建成重组分泌型表达载体pAPR1、pAPR2 .pAPR1、pAPR2中碱性蛋白酶基因在大肠杆菌宿主JM 10 9(DE3)中得到表达 .SDS -PAGE分析显示融合表达产物的分子量均为 30 .5× 10 3 ,同核酸序列测定所推导的值相符 .表达产物分别占细胞总蛋白的 8.0 %和 7.5 % .2 70 9重组菌所得酶活为 12 10u/mL ,6 816重组菌所得酶活为 1175u/mL .研究发现 ,重组的碱性蛋白酶在进入大肠杆菌周质空间时可能存在前肽自动脱落的现象 .同时 ,对地衣芽孢杆菌 2 70 9碱性蛋白酶基因序列进行了测定和比较分析 ,发现与地衣芽孢杆菌 6 816碱性蛋白酶基因的同源性为 98% .图 5参

地衣芽孢杆菌2709碱性蛋白酶基因的克隆、序列测定及其表达

以克隆的地衣芽孢杆菌2709碱性蛋白酶编码序列的PCR扩增片段为探针,通过原位杂交从2709基因文库中筛选出两个含有完整的2709碱性蛋白酶基因的阳性克隆:pSC1和pSC7。对pSC7中的插入片段构建若干亚克隆后测定了其全部DNA序列,结果显示该插入片段含2709碱性蛋白酶及其信号肽与导肽(Pro-peptide)在内的全部编码序列(1140碱基对)及长度分别为299和832碱基对的上、下游序列,该序列同M.Jacobs等克隆的地衣芽孢杆菌NCIB6816的Subtilisin Carlsberg基因序列显示了极高的同源性。通过枯草杆菌-大肠杆菌穿梭质粒pBE2将克隆的2709碱性蛋白酶基因转入到蛋白酶缺陷型的枯草芽孢杆菌DB104中,结果表明2709碱性蛋白酶基因在枯草芽孢杆菌中得到了明显的表达。

地衣芽孢杆菌2709高去酰胺活性碱性蛋白酶发酵条件及酶学性质的研究

就地衣芽孢杆菌2709发酵生产高去酰胺活性碱性蛋白酶的发酵条件进行了研究,以酶液对大豆蛋白的去酰胺度和肽键水解度为指标,对产酶条件进行优化,并研究了该酶的基本酶学特性;确定了培养基的最佳碳源为玉米粉,最佳氮源为黄豆饼粉,C/N在1:2～1:1范围时去酰胺度最高;最适摇瓶发酵条件为:种龄18h,接种量2%,装液量30mL/100mL,摇床转速140r/min,pH7.0,35℃,发酵50h;碱性蛋白酶最适作用pH为10.0,最适反应温度为50℃,60℃保温2h后仅存5.9%的活力,在pH8～11之间有较高的pH稳定性。

地衣芽孢杆菌2709碱性蛋白酶编码序列的PCR扩增、克隆及序列测定

在地衣芽孢杆菌NCIB 6816菌株碱性蛋白酶基因已知序列的基础上,通过设计合适的引物,利用PCR(Polymerase Chain Reaction)技术从地衣芽孢杆菌2709菌株的柒色体DNA中扩增了2709碱性蛋白酶的编码序列。对两个克隆的PCR片段的全序列分析结果显示,2709碱性蛋白酶的编码序列同相应的NCIB 6816序列相比有3％左右的碱基组成差异。由此推定的2709碱性蛋白酶的氨基酸序列肯定了2709碱性蛋白酶属典型的subtilisin Carlsberg类,同时还表明来源于不同地衣芽孢杆菌菌株的subtilisin Carlsberg存在着若干氨基酸组成上的差异。

地衣芽孢杆菌2709与基因工程菌BD105原生质体融合的研究

本实验选用碱性蛋白酶生产菌地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)2709和工程菌枯草芽孢杆茵(B.Subtilis)BD105(pDW_2),在聚乙二醇的诱导下进行原生质体融合.报道了2709与BD105的原生质体的形成、再生与融合,融合子A有氯霉素抗性、能在基本培养基上生长且遗传稳定.初步检测,融合子A中含有质粒,发酵酶活高于亲本株近50%.

羊驼源地衣芽孢杆菌SXAU08的益生功能评价及其对小鼠肠道菌群的影响

本试验旨在探究分离自羊驼肠道的地衣芽孢杆菌SXAU08的益生功能及其对小鼠肠道菌群的影响。试验首先对分离菌株进行革兰氏染色和16S rRNA基因鉴定,将其命名为地衣芽孢杆菌SXAU08,然后测定该菌株的高温耐受性、在人工胃液和人工肠液中的存活率、抑菌活性和抗生素敏感性。选取40只21日龄清洁级昆明小鼠,随机分为2组,每组20只(公母各占1/2)。对照组饲喂基础饲粮并灌服生理盐水,试验组在基础饲粮的基础上灌服1×10^(10)CFU/mL地衣芽孢杆菌SXAU08,灌胃量均为0.3 mL/只。试验期30 d,研究该菌对小鼠肠道组织形态和菌群的影响。结果表明:1)该菌无细胞培养液可显著抑制金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和藤黄微球菌的生长;在40~100℃处理后仍可正常生长,在人工胃液和人工肠液作用6 h后仍可存活,且呈生长趋势;对庆大霉素、氟氧沙星和阿莫西林等10种常见饲用抗菌药物敏感。2)灌服地衣芽孢杆菌SXAU08后的小鼠无不良反应,存活率为100%,剖检无病理性变化。3)与对照组相比,灌服地衣芽孢杆菌SXAU08的试验组小鼠十二指肠绒毛高度和绒毛高度/隐窝深度(V/C)值极显著提高(P<0.01),十二指肠隐窝深度极显著降低(P<0.01)。4)与对照组相比,在门水平上,试验组小鼠空肠厚壁菌门和脱硫杆菌门相对丰度显著提高(P<0.05),空肠拟杆菌门相对丰度显著降低(P<0.05),盲肠脱硫杆菌门和髌骨菌门相对丰度显著提高(P<0.05);在属水平上,试验组小鼠空肠和盲肠乳杆菌属相对丰度均显著提高(P<0.05)。综上所述,源自羊驼肠道的地衣芽孢杆菌SXAU08能够改善小鼠肠道形态,提高肠道益生菌相对丰度,调节肠道菌群,维持肠道健康,可作为益生菌的备选菌株。

地衣芽孢杆菌对几丁质的降解作用及其发酵工艺优化

本试验筛选到一株高效产几丁质酶的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis bl3)菌株,为了提高该菌产几丁质酶的能力,提高降解虾壳的效率,对bl3菌株的发酵条件和培养基组分配比进行了优化。结果表明,bl3产几丁质酶的最适条件为pH 4.5~5.5,温度37~45℃,转速120 r·min^(-1),接种量0.40%,酶活性最高时间为36 h。通过Plackett-Burman设计试验、最陡爬坡试验和响应面试验,得到bl3产几丁质酶的最优培养基配方为虾壳11.406 g·L^(-1),KH_(2)PO_(4)0.601 g·L^(-1),MgSO_(4)·7H_(2)O0.263 g·L^(-1),酵母粉3.500 g·L^(-1),FeSO_(4)·2H_(2)O 15.00 mg·L^(-1),ZnSO_(4)0.750 mg·L^(-1)。优化后bl3发酵产几丁质酶活性达98.122 U·mL^(-1),相较于初始培养条件提高2.43倍。优化组合培养基中的虾壳、KH_(2)PO_(4)和MgSO_(4)·7H_(2)O含量以及维持稳定pH,可促进地衣芽孢杆菌持续生长和高效合成几丁质酶量。研究结果可为bl3菌株在降解几丁质方面的应用提供科学依据。

哈茨木霉和地衣芽孢杆菌对梨锈病的田间防治效果

为明确哈茨木霉和地衣芽孢杆菌对梨锈病的田间防治效果,选择1×10^(9) cfu/g哈茨木霉可湿性粉剂(WP)、2×10^(8) cfu/g地衣芽孢杆菌可湿性粉剂(WP)、35%咪鲜胺·乙蒜素可溶液剂(SL)、20%苯醚甲环唑水乳剂(EW)、25%吡唑醚菌酯悬浮剂(SC)开展田间药效试验。结果表明,1×10^(9) cfu/g哈茨木霉可湿性粉剂300倍液和2×10^(8) cfu/g地衣芽孢杆菌可湿性粉剂600倍液对梨锈病的病斑大小及锈孢子器的形成均具有显著的抑制作用。哈茨木霉、地衣芽孢杆菌施药后30 d,梨锈病的病斑直径较对照分别减小41.2%、30.9%;形成锈孢子器的病斑数量较对照分别减少50.0%、44.9%。2022、2023年哈茨木霉对梨锈病施药后15 d的防效分别为46.7%、73.3%,施药后30 d的防效分别为59.3%、71.9%;地衣芽孢杆菌对梨锈病施药后15 d的防效分别为54.7%、60.1%,施药后30 d的防效分别为61.7%、62.4%。试验结果表明,哈茨木霉和地衣芽孢杆菌对梨锈病均具有较好的防治效果,为充分发挥药效,建议在发病前或发病初期使用。

鱼类肠道益生地衣芽孢杆菌FA6发酵工艺的响应面法优化

研究以地衣芽孢杆菌FA6活菌数为指标,采用单因素实验和响应面法实验优化了地衣芽孢杆菌FA6发酵培养基和发酵条件,获得了地衣芽孢杆菌FA6最佳发酵培养基:70 g/L可溶性淀粉、40 g/L酪蛋白胨、2 g/L K2HPO4、1 g/L KH_(2)PO_(4)、2 g/L Na_(2)HPO_(4)、2 g/L MgSO_(4)和8 g/L NaCl;以及最佳发酵条件:初始pH 7.0、接种量1%、发酵温度28.8℃、发酵时间31h、装液量50 mL/250 mL和转速160 r/min。在此发酵培养基和发酵条件下,地衣芽孢杆菌FA6活菌数为7.97×10^(9)CFU/mL,较优化前提高了8.1倍。最佳发酵工艺的获得,将能够为鱼源芽孢杆菌的高密度生产,产业化应用提供基础。

地衣芽孢杆菌在肉鸡养殖中的应用

地衣芽孢杆菌是厌氧型革兰氏阳性细菌,具有耐高温、耐酸、产酶、产抗菌物质等特性,能够改善肉鸡生长性能,提高免疫性能,促进肠道发育和调节肠道菌群,防治鸡坏死性肠炎和球虫病等疾病,具有替代抗生素的潜力。文章综述了地衣芽孢杆菌对肉鸡生长性能、免疫功能、抗氧化性能、肠道发育和微生物组成的影响及其对坏死性肠炎和球虫病的防治作用,并总结了地衣芽孢杆菌的适宜添加量,以期为地衣芽孢杆菌在肉鸡生产中的应用提供参考。

质粒复制原点在地衣芽孢杆菌中的功能鉴定及理性设计

食品安全级工业微生物地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)与模式微生物相比,严重缺乏质粒载体等合成生物学标准化遗传工具,导致其研究与应用受到限制。该研究首先建立了质粒特性在地衣芽孢杆菌中的评价方法,由此鉴定获得了高效复制原点。在此基础上进一步解析了复制原点中茎环结构影响质粒拷贝数和稳定性的分子机制,并理性设计了系列人工复制原点。结果表明,枯草芽孢杆菌来源的复制原点ORIT5拷贝数是pHY300内源复制原点的2.15倍(达到40.2),同时具有更高的稳定性。3′端增加1个motif为TCCGCC茎环的人工复制原点pT1,拷贝数进一步提升至62.2,稳定性提高36%。以麦芽寡糖基海藻糖合成酶为报告蛋白,携带pT1复制原点的重组菌发酵最高酶活力达到8726.7 U/mL,比出发菌株提高了43.9%。人工复制原点的开发与应用为地衣芽孢杆菌表达系统的改进和完善奠定了基础。

地衣芽孢杆菌HR高密度培养及代谢产物解析

本试验旨在对地衣芽孢杆菌培养基进行优化,确定其最佳培养条件,为工业化生产是提供依据。以活菌数和OD_(650nm)为检测指标,对培养基和培养条件进行优化,并扩大至50 L罐规模。利用GC-MS检测分析培养液中挥发性物质并解析。结果表明:地衣芽孢杆菌培养的最佳条件为α-乳糖2 g/L、豆粕20 g/L、MnSO_(4)1 g/L、FeSO_(4)0.01 g/L、MgSO_(4)0.04 g/L、K_(2)HPO_(4)2 g/L,接种量4%,培养时间为24 h,初始pH为7,在50 L发酵罐培养其活菌数最大值为1.36×10^(9)CFU/mL。GC-MS共检测出12种物质,其中3,5-二甲基-1,3,4-己三醇、L-乳酸异丁酸和2-甲基丁酸对动物机体都有不同程度的益生效果。使用优化后的条件进行地衣芽孢杆菌HR培养,培养液中活菌数有所提高,从而提高了其生产效率,对其产业化推进有一定现实意义。

重组地衣芽孢杆菌全细胞转化法制备D-阿洛酮糖

该研究首次在地衣芽孢杆菌中异源表达溶纤瘤胃杆菌H10来源的D-阿洛酮糖3-差向异构酶(D-psicose 3-epimerase, DPE),开拓D-阿洛酮糖生物合成法又一新的表达载体途径。首先,选取不同启动子介导表达该酶,选取表达效果最好的重组菌BL1进行全细胞转化条件和发酵条件的优化。利用优化后的重组菌全细胞转化条件,65℃、反应体系细胞OD_(600)值为2、反应10 min、底物D-果糖100 g/L探索出发酵培养条件,碳源为蔗糖75 g/L、初始pH 7.5、37℃,最终利用全细胞转化方法,65℃、500 g/L D-果糖、反应体系细胞OD_(600)值为30、反应20 min,转化率达30.3%,D-阿洛酮糖产量可达120 g/L,单位酶活力达到33.3 U/mL。采用分4次添加与果糖摩尔质量比为0.4的硼酸至反应体系中的方法,将转化率提高至69.8%。该研究为工业生产D-阿洛酮糖提供一定的参考价值。

地衣芽孢杆菌产芽孢培养基和培养条件的优化

本研究以地衣芽孢杆菌CICC 20514为对象,芽孢数和芽孢率为目标参数,采用单因素、正交试验方法对培养基配方进行筛选,并在此配方基础上对培养条件进一步优化。结果表明:最终产芽孢发酵培养基的最佳组合为20 g/L果糖、20 g/L豆粕、5 g/L K2HPO_(4)、7 g/L NaCl、0.8 g/L CaCO_(3)和0.8 g/L MgSO_(4);产芽孢最佳培养条件为37℃,220 r/min,接种量5%,装样量20%,初始pH 6.5~7.5,发酵培养时间48 h。优化后的地衣芽孢杆菌CICC 20514培养基芽孢数及芽孢率均具有良好的稳定性,发酵液芽孢数达5.8×10^(9)CFU/mL,比优化前提高了58倍。

一株易转化、高生物量地衣芽孢杆菌的筛选与鉴定

【目的】地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)是发酵工业中表达异源蛋白的重要底盘细胞,筛选易转化和高生物量的B.licheniformis菌株,为有效提升宿主的改造效率和蛋白表达水平提供菌种资源。【方法】经过富集、gyrB扩增与16S rDNA序列分析从土壤中筛选与地衣芽孢杆菌同源性较高的菌株,将所筛菌株的电转效率和生物量与工业常用底盘细胞B.licheniformis 2709进行比较分析。对筛选出的易电转和高生物量菌株进行形态学与生理生化鉴定,并进行抗生素敏感性测定和高温碱性环境生长情况测定。【结果】筛选出10株与地衣芽孢杆菌同源性较高的菌株,其中菌株1-33电转化效率为6700 CFU/μg DNA,是B.licheniformis 2709的13.7倍。在豆粕玉米粉半固体培养基和SR液体培养基中培养,菌株1-33最大生物量达到5.2×10^(10) CFU/mL和6.8 g/L,分别为B.licheniformis 2709的1.71倍和1.3倍。进一步经过形态学、生理生化特性实验将菌株1-33最终鉴定为B.licheniformis,并表现出多种常用抗生素的敏感性和良好的耐碱与耐高温的能力。【结论】筛选出一株易电转和高生物量的B.licheniformis 1-33,为开发成高效表达外源蛋白的宿主菌奠定基础。

凡纳滨对虾肠道中地衣芽孢杆菌的分离鉴定及其生物学特性

为筛选对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)具有潜在益生效果的菌株,从体质量为(3.1±0.4)g的健康凡纳滨对虾肠道中筛选出一株具有耐高温(80℃)能力的菌株(命名为RHVJ),采用形态学观察、生理生化鉴定、基因序列比对、病原菌拮抗能力测定、安全性与耐受性分析和生长特性检测等方法对其展开研究。结果表明:菌株RHVJ为革兰氏阳性杆菌,综合其生理生化特征可初步鉴定该菌属于芽孢杆菌属(Bacillus);菌株RHVJ的16S rDNA序列与地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)的MH305331.1和NR074923.1完全匹配,其gyrB序列与CP038186.1和CP023729.1也达到了100%的一致性;综合菌体形态、生理生化及分子生物学特征,判定菌株RHVJ为地衣芽孢杆菌;地衣芽孢杆菌RHVJ可抑制副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)和维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)生长,对凡纳滨对虾无致病性;在胆盐质量浓度为0~1.2 g/L、pH为3~11环境下培养,以及在37~90℃下进行5min或15 min水浴处理后,菌株RHVJ仍可持续增殖,该菌在27℃、pH 7和盐度20条件下生长最佳。研究表明,凡纳滨对虾肠道源地衣芽孢杆菌RHVJ环境适应性良好且安全,具有一定的病原菌拮抗能力,可作为候选菌株开发为益生菌制剂。

地衣芽孢杆菌对黄羽肉鸡生长性能、免疫能力、抗氧化功能和肠道菌群的影响

试验旨在探究日粮添加地衣芽孢杆菌对黄羽肉鸡生长性能、免疫能力、抗氧化功能和肠道形态及盲肠菌群结构的影响。选用1日龄健康、平均初重为(32.39±0.37)g的雄性岭南黄羽肉仔鸡360只,随机分为3组,每组8个重复,每重复15只鸡。对照组饲喂基础日粮(对照组),BL500组、BL1000组在基础日粮中分别添加500、1 000 mg/kg地衣芽孢杆菌(活菌数1×10^(9) CFU/g),试验期56d。结果表明:与对照组相比,添加500 mg/kg和1 000 mg/kg地衣芽孢杆菌均可增加黄羽肉鸡的末体重(FBW)和平均日增重(ADG)(P<0.05),提高肉鸡血清免疫球蛋白M(IgM)含量和血清总抗氧化能力(T-AOC)(P<0.05),降低血清白介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和丙二醛(MDA)含量(P<0.05),增加空肠绒毛高度(VH)(P<0.05),提高了肉鸡盲肠中微生物丰富度和多样性(P<0.05),降低了厚壁菌门和另枝菌属的相对丰度(P<0.05);饲粮添加1 000 mg/kg地衣芽孢杆菌组肉鸡血清超氧化物歧化酶(SOD)活性和空肠绒毛高度与隐窝深度比值(VH/CD)高于对照组(P<0.05)、血清白介素1β(IL-1β)含量低于对照组(P<0.05)。由此可见,饲粮添加地衣芽孢杆菌可调节厚壁菌门和另枝菌属的相对丰度,提高血清免疫力和抗氧化能力,改善肠道形态结构,进而提高黄羽肉鸡生长性能,且饲粮添加1 000 mg/kg较500 mg/kg地衣芽孢杆菌效果更优。

产碱性蛋白酶地衣芽孢杆菌合成培养基筛选与优化

该研究对于产碱性蛋白酶地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)的合成培养基进行了系统的筛选与优化。基于豆粕成分分析及文献报道构建初始化学合成培养基CDM_(0),并通过单一组分移除实验,初步确定对菌体生长有显著影响(生长降低20%以上)的组分,包括3种碱基、4种维生素、11种氨基酸以及一些金属离子和无机盐。在此基础上进行了组分添加实验,分别添加单一组分移除实验从CDM_(0)中剔除的组分,进而筛选出对菌体生长具有20%以上促进作用的5种关键营养物质,并用全排列方法得到了26种组合添加方式,经实验确定了添加的最佳组合为(NH_(4))_(2)SO_(4)、腺嘌呤和天冬酰胺。此外,还研究了甘油、5种单糖和3种双糖对菌体生长及碱性蛋白酶合成的影响,最终以半乳糖为碳源确定了一种优化后的化学全合成培养基CDM_(3)。实验结果表明,与CDM_(0)相比,CDM_(3)显著提高了菌体的生长速率和碱性蛋白酶的产量,其中酶活力提升至10300.7 U/mL,提高了约2.5倍。该实验结果为今后研究该菌株的代谢特性奠定了基础。

地衣芽孢杆菌和丁酸梭菌对育肥羔羊生长、养分消化及血清生化指标的影响

[目的]高精料育肥引发的肉羊消化功能紊乱已引起了人们的高度重视,饲喂益生菌有助于羊的消化吸收。本研究将两种益生菌(地衣芽孢杆菌和丁酸梭菌)在饲粮中单独或联合添加,探究其对育肥羔羊生长性能、养分表观消化率及血清生化指标的影响。[方法]选择125只3~4月龄育肥后期湖羊公羔(30.89 kg±0.38 kg),随机分为5组:对照组、抗生素组(20 mg/kg莫能菌素)和3个益生菌组(4×10^(10) CFU/kg地衣芽孢杆菌、2×10^(8) CFU/kg丁酸梭菌和两种菌同剂量联合组),试验期60 d,测定试验前期(1~30 d)和后期(31~60 d)羔羊的生长性能、养分表观消化率,以及试验第1、30和60天羔羊的血清生化指标。[结果]与对照组相比,饲粮中单独或联合添加地衣芽孢杆菌和丁酸梭菌对羔羊平均日采食量均无显著影响(P>0.05),但两种菌联合添加显著提高了羔羊整个试验期的日增重(P<0.05),3个加菌组羔羊料重比(F/G)均显著降低(P<0.05),且试验后期联合添加组的F/G显著低于两个单菌组(P<0.05);两菌联合添加显著提高了羔羊试验前期和后期的干物质表观消化率(P<0.05),3个加菌组前期的酸性洗涤纤维消化率均显著提高(P<0.05)。另外,试验后期3个加菌组羔羊的血清葡萄糖含量较对照组提高了16.97%~28.18%,均差异显著(P<0.05)。[结论]饲粮中单独添加或联合添加地衣芽孢杆菌、丁酸梭菌均能提高羔羊的生长性能,改善消化性能,两菌联合添加效果较佳。