地高辛标记探针检测5种葫芦科作物病毒的斑点杂交方法

【目的】探索5种葫芦科作物病毒即小西葫芦黄花叶病毒(Zuccini yellow mosaic virus,ZYMV)、西瓜花叶病毒(Watermelon mosaic virus,WMV)、黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)、番木瓜环斑病毒西瓜株系(Papaya ringspot viruswatermelon strain,PRSV-W)和南瓜花叶病毒(Squash mosaic virus,SqMV)的斑点杂交检测技术,为葫芦科作物种子带毒的快速准确鉴定、流行病学研究和转基因检测等提供技术和方法。【方法】以构建的重组质粒为模板,用PCR方法合成了相应的地高辛标记的cDNA探针。通过斑点杂交检测西葫芦病叶汁液来考察探针的灵敏性和特异性。同时设计了3种不同长度的SqMV探针(0.55、1.6、2.7kb)对杂交效果进行了研究。【结果】ZYMV、WMV、CMV、PRSV-W和SqMV的5种探针检测各自侵染西葫芦病汁液的稀释低限分别为1﹕160、1﹕160、1﹕320、1﹕160、1﹕320,而每种探针与健康西葫芦和其它4种病毒的反应均为阴性。不同长度的SqMV探针杂交结果相同。【结论】用PCR方法合成的地高辛标记的探针,能够直接在植物组织中将5种病毒检测出来,具有较好的灵敏性、特异性和重复性。探针的长度对杂交的灵敏性和特异性没有影响。

地高辛标记探针检测猪胸膜肺炎放线杆菌的研究与应用

利用PCR反应扩增出胸膜肺炎放线杆菌ApxⅣ基因650 bp的DNA,回收并纯化PCR产物,用地高辛标记,制备出地高辛标记的核酸探针。该探针与不同血清型的胸膜肺炎放线杆菌均能发生特异性杂交,而与大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、沙门氏菌、葡萄球菌、猪肺炎支原体、支气管败血波氏杆菌等细菌的核酸杂交均为阴性。对胸膜肺炎放线杆菌的最低检出限量为10×102 个放线杆菌。对疑似胸膜肺炎放线杆菌感染病变组织检测结果表明,在扁桃体、鼻腔、气管、肺脏均可检测出胸膜肺炎放线杆菌,以扁桃体的检出率最高。为猪胸膜肺炎放线杆菌的诊断和流行病学调查提供了良好的方法。

地高辛标记探针检测重组双功能水蛭素中的DNA残留量

为检测注射用重组双功能水蛭素半成品中的DNA残留量 ,应用地高辛标记重组双功能水蛭素工程菌DNA ,并以此为DNA探针进行点杂交 ,同时做特异性及灵敏度实验。结果证明 ,该方法检测最低限值可达1pg ,且重复性好 ,特异性强 ,操作较简便 。

PCR法制备地高辛标记探针斑点杂交检测鳗弧菌

以鳗弧菌（Vibrio anguillarum）toxR基因内366～571bp之间的基因序列为靶序列，采用PCR法制备对鳗弧菌特异性的地高辛标记DNA探针，探针长度为206bp。选取2株鳗弧菌和8株与鳗弧菌亲缘关系非常接近的常见水产动物致病弧菌，通过斑点杂交法对制备的探针进行特异性检测，结果显示该探针对鳗弧菌杂交阳性，而与弧菌属的其它8株细菌均无交叉反应。这表明该地高辛标记探针具有很强的特异性，它能够很好地对鳗弧菌感染进行检测。

地高辛标记探针检测鼻气管鸟杆菌的研究与应用

【目的】建立鼻气管鸟杆菌(Ornithobacteriumrhinotracheale,ORT)快速、准确的检测方法。【方法】利用PCR扩增鼻气管鸟杆菌16 S rRNA基因的671 bp特异性片段,经回收纯化后用地高辛标记,建立了地高辛标记探针诊断ORT的方法。【结果】特异性试验表明,地高辛标记探针可与ORT不同血清型参考菌株的核酸发生特异性杂交,而与鸡大肠杆菌、副鸡嗜血杆菌、鸡白痢沙门氏菌、禽多杀性巴氏杆菌的核酸杂交均为阴性;敏感性试验结果表明,地高辛标记探针对ORT的最低检出量为100 pg/μL;利用该探针对分离菌株和疑似病料进行检测,结果均与PCR检测结果一致。【结论】建立了地高辛标记探针检测ORT的方法,为ORT的诊断提供了一种敏感性高、特异性强、简便且易行的方法。

地高辛标记探针检测生物制品中残余DNA含量

用地高辛标记探针检测由传代细胞系生产的人用精制狂犬病疫苗、重组 (CHO细胞 )乙肝疫苗、出血热疫苗及痢疾多糖结合疫苗原液中残余DNA含量。结果表明 ,该方法特异性强 ,灵敏度高 。

地高辛标记探针用于人白细胞基因定位

用地高辛标记探针在人染色体上进行了基因定位。使用了酶显色和荧光显色,两者得到了相同的定位结果,特异区阳性率分别为11.6％和19.8％’荧光显色特异性较高,说明基因定位效果受显示系统效率的影响,地高辛标记探针用于基因定位有比放射性探针、生物素探针更多的优越性。又讨论了几个影响效果的因素,提出以SDC代替甲酰胺洗涤;紫外照射于杂交前R显带方法能取得较好的基因定位效果。

地高辛标记探针与生物素标记探针用于斑点杂交检测HBV DNA的初步研究

为研究地高辛标记和生物素标记核酸探针斑点杂交检测HBVDNA的敏感性、特异性和稳定性，用两种探针和(32)P标记探针进行平行检测对照．结果表明，地高辛探针检测灵敏度为0．1Pg，已达到(32)P中标记探针水平。生物素探针为1～10Pg。两种探针与32P标记探针相比。符合率分别96．65％和89．13％；敏感性分别为94．44％和83．33％；特异性分别为96．43％和92．86％。两种探针在－20℃存放6月后检测结果前后一致。研究结果表明，地高辛标记探针和生物素标记探针斑点杂交检测HBV．DNA都具有较高的敏感性、特异性和稳定性，其中以地高辛标记探针更优。

猪圆环病毒2型地高辛标记探针检测方法的建立与应用

根据GenBank中已发表的猪圆环病毒2型(PCV-2)基因序列,在ORF2内设计1对特异性引物,利用PCR反应扩增出371 bp的核酸片段,回收并纯化PCR产物,用地高辛标记,建立了地高辛标记核酸探针诊断PCV-2的方法。该探针与8个PCV-2重组菌的核酸抽提物均能发生特异性杂交,而与对照猪圆环病毒Ⅰ型(PCV-1)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)的核酸杂交均为阴性;对PCV-2 DNA的最低检测量为10 pg。

鸡传染性支气管炎病毒地高辛标记探针检测方法的的建立和应用

根据GenBank中已经发表的IBV N基因的保守序列,设计合成一对引物,利用RT-PCR技术扩增IBVN基因的582 bp的核酸片段,并制备出地高辛标记的IBV核酸探针。特异性检测结果表明,该探针能与不同毒株的IBV核酸发生特异性杂交,而与对照的NDV、鹅副粘病毒的核酸杂交反应为阴性;敏感性检测结果表明,该探针对IBV的最低检出量为10 pg,显示所制备的核酸探针用于IBV的检测是可行的。

应用地高辛标记探针检测以Vero传代细胞制备人用狂犬疫苗中残余细胞DNA含量

用地高辛标记正常Ｖｅｒｏ细胞ＤＮＡ，制成特异探针，通过与制备人用狂犬疫苗的基质Ｖｅｒｏ细胞同源ＤＮＡ杂交，检测人用狂犬疫苗中残余Ｖｅｒｏ细胞ＤＮＡ含量，达到ＷＨＯ规程中“以传代细胞制备生物制品中残余细胞ＤＮＡ含量，每剂量ＤＮＡ须低于１００ｐｇ”的检测要求。检测灵敏度可达１ｐｇ，杂交反应特异性高，重复性好。测得以Ｖｅｒｏ细胞制备人用狂犬疫苗粗制原液中残余细胞ＤＮＡ含量为１００～１０００ｐｇ／ｍｌ，超滤浓缩后为１０４～１０６ｐｇ／ｍｌ，纯化后低于１０～１００ｐｇ／ｍｌ。这对以传代细胞为基质的生物制品中残余细胞ＤＮＡ的检测提供了一种常规可行的方法。

应用地高辛标记探针鉴定军团菌

目前鉴定军团菌的方法很多，如血清学测定、生化学特性、细菌分离培养等。随着分子生物学的发展，人们不断尝试将分子生物学的诊断技术引入各学科领域。本实验通过对两株初步认定为嗜肺军团菌进行ＤＮＡ分析，着重阐述核酸杂交技术鉴定军团菌的方法及应用意义。１方法１．...

地高辛标记探针检测蓝舌病病毒方法的研究

采用３种不同的方法变性处理蓝舌病病毒ＢＴＶ１６ＲＮＡ，与ＤＩＧ标记的ＢＴＶ１６ＶＰ７基因制备的探针经斑点杂交和Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印迹杂交。试验表明，ＤＭＳＯ变性处理的核酸杂交后探针的灵敏度最高。

用地高辛标记的核酸探针检测猪伪狂犬病毒野毒感染的研究

利用PCR技术从带有伪狂犬病毒(PRV)gE基因的重组质粒pMD18-T-gE中扩增回收约304 bp大小的片段,并制备出地高辛标记的gE基因核酸探针。特异性检测结果表明,该探针能与重组质粒DNA发生特异性杂交,而与对照的PRV Bartha-k61株疫苗毒DNA、猪细小病毒(PPV)DNA、猪圆环病毒(PCV)DNA、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)cDNA、猪瘟病毒(CSFV)cDNA的杂交反应均为阴性;敏感性检测结果表明,该探针对PRV野毒的最低检出量为4 pg。应用该探针对11份繁殖障碍病料进行了杂交检测,共检出4份阳性病料,该结果与PCR检测结果一致,表明该核酸探针可用于猪伪狂犬病野毒感染的临床诊断。

用地高辛标记的核酸探针从尿囊液和组织中检测传染性支气管炎病毒

将IBVT株基因组S1 基因上0.6kb 片段(位于S1 基因上1121bp～1723bp 之间) 克隆到PIBPCRCloning vector 中,用地高辛标记探针,分别与9 株IBV的PCR 产物和12 株IBV 的核酸进行点杂交均呈阳性反应,而该探针不与IBDV和NDV 的RNA,EDS76 病毒的DNA及正常鸡胚尿囊液的抽提物反应。探针检测IBVPCR产物的灵敏度为100～200pg。用该探针检测不同毒株IBV在鸡胚中的繁殖动态,接种24～30 小时后的的尿囊液均获阳性结果。用M 和宜株混合感染5 日龄雏鸡12 小时能从气管粘液中检出病毒,38～46 小时后能从肾组织中检出病毒。对7 只就诊病鸡的病变肾脏进行杂交检测,有5 只呈阳性反应。核酸杂交技术为生产上提供了直接从尿囊液和感染鸡组织中快速检测病毒,诊断IBV

转基因油菜地高辛标记DNA探针杂交检测方法的建立

通过PCR扩增法制备转基因油菜外源筛选基因FMV35S启动子的DIG-11-dUTP标记DNA探针,与该基因PCR扩增产物进行Southern杂交,通过显色反应对商品化转基因油菜进行检测。本研究对反应基片带正电荷的尼龙膜和硝酸纤维素膜进行了比较,并比较了不同固定条件和杂交条件下的杂交结果。尼龙膜较之硝酸纤维素膜可更好的结合DNA片段,经紫外线照射交联5 分钟,与含甲酰胺的杂交液在45℃杂交30 min结果较为理想。

用PCR法制备地高辛标记探针诊断DMD基因缺失

用ＰＣＲ法制备地高辛标记探针诊断ＤＭＤ基因缺失余元勋杜氏肌营养不良（ＤＭＤ）是一种对人危害严重的Ｘ－连锁隐性遗传病，大约每３５００名出生男婴中就有１名罹患此病［１］。约２／３的患者基因突变由遗传而来，而另１／３为新突变所致。肌营养不良蛋白（ｄｙｓｔｒ...

一种改进的地高辛标记探针斑点杂交法检测血清

一种改进的地高辛标记探针斑点杂交法检测血清顾士民，蒋伟伦，傅龙亭，潘鹤翔以地高辛（ＤｉｇＲｏｘｉｇｅｎｉｎ，简写Ｄｉｇ）标记探针检测血清ＨＢＶＤＮＡ，具有需时短，无放射污染，探针易长期保存等优点。但血清直接点膜检测其灵敏度尚不及使用３２Ｐ标记探针，且...