用地高辛标记核酸探针检测猪细小病毒的研究

根据猪细小病毒(PPV)基因组序列,设计引物克隆了PPV YK株保守序列NS1基因,将NS1基因纯化,利用地高辛标记制备了NS1基因PCR产物探针和克隆NS1探针,两种核酸探针的标记都达到了0.1 pg/μL。特异性试验结果表明,这两种探针都能与PPV DNA发生特异的阳性杂交,而与对照的PRV、PCV、PRRSV和HCV的核酸杂交呈阴性。敏感性试验结果表明,克隆NS1探针敏感度为0.5 pg/μL,NS1基因PCR产物探针敏感度为1 pg/μL。综上所述,这两种DIG标记探针特异性强,敏感性高,可用于PPV的检测。

地高辛标记核酸探针及其在分子杂交中的应用

地高辛标记核酸探针及其在分子杂交中的应用汤权江苏盐城市卫生防疫站（２２４００２江苏）地高辛一毛地黄毒甙配基（Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ，简称Ｄｉｇ）是甾族半抗原，ｄＵＴＰ分子可在Ｃ３位上通过空间短臂与之相连接（Ｄｉｇ－ｄＵＴＰ）。用Ｄｉｇ标记的核酸探针避...

猪圆环病毒2型地高辛标记探针检测方法的建立与应用

根据GenBank中已发表的猪圆环病毒2型(PCV-2)基因序列,在ORF2内设计1对特异性引物,利用PCR反应扩增出371 bp的核酸片段,回收并纯化PCR产物,用地高辛标记,建立了地高辛标记核酸探针诊断PCV-2的方法。该探针与8个PCV-2重组菌的核酸抽提物均能发生特异性杂交,而与对照猪圆环病毒Ⅰ型(PCV-1)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)的核酸杂交均为阴性;对PCV-2 DNA的最低检测量为10 pg。

猪流感病毒M基因核酸探针的制备与应用

以地高辛(DIG)标记猪流感病毒(SIV)M基因的保守片段制成核酸探针,与H1及H3亚型的猪流感病毒(SIV)的cDNA、猪呼吸与繁殖综合征病毒(PRRSV)的cDNA、猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)的DNA、猪瘟病毒(CSFV)cDNA、猪伪狂犬病(PRV)的DNA进行斑点杂交,以检测探针的特异性,结果该探针仅与H1及H3亚型的猪流感病毒(SIV)的cDNA杂交呈阳性,与其余病毒杂交呈阴性;敏感性试验显示,探针最低能检出约5 pg的H3亚型的SIV RT-PCR产物。应用该探针对35份疑似SI临床病料进行检测,结果检出9份阳性,与RT-PCR检测结果一致。本研究结果表明,建立的DIG标记的核酸探针特异性强,敏感性高,适合于对SI的诊断和流行病学调查。

鸡传染性支气管炎病毒地高辛标记探针检测方法的的建立和应用

根据GenBank中已经发表的IBV N基因的保守序列,设计合成一对引物,利用RT-PCR技术扩增IBVN基因的582 bp的核酸片段,并制备出地高辛标记的IBV核酸探针。特异性检测结果表明,该探针能与不同毒株的IBV核酸发生特异性杂交,而与对照的NDV、鹅副粘病毒的核酸杂交反应为阴性;敏感性检测结果表明,该探针对IBV的最低检出量为10 pg,显示所制备的核酸探针用于IBV的检测是可行的。

青蟹双顺反子病毒-1原位杂交检测方法的建立与应用

根据青蟹双顺反子病毒-1(mud crab dicistrovirus-1,MCDV-1)基因的保守序列设计1对引物,从感染MCDV-1的青蟹鳃组织中提取RNA为模板进行RT-PCR扩增,得到1 314 bp的c DNA片段。纯化后的PCR产物用地高辛(DIG)标记制备核酸探针,此探针与青蟹呼肠孤病毒(MCRV)、鲍肌肉萎缩症病毒(Ab SV)、类疱疹病毒(Ab HV)、白斑综合症病毒(WSSV)、虎纹蛙病毒(TFV)、锦鲤疱疹病毒(KHV)等水生动物常见病毒均无交叉反应,可以特异性的检测出MCDV-1,检出MCDV-1的灵敏度为8.58×107 copies/μL。采用原位杂交检测方法检测拟穴青蟹组织中MCDV-1的组织分布,结果表明,拟穴青蟹中MCDV-1 RNA的阳性信号主要分布于肝胰腺、神经节、肠道和食管。

PCR结合斑点杂交技术检测禽多瘤病毒方法的建立及应用

鹦鹉幼雏病是由禽类多瘤病毒(APV)引起的多种鹦鹉雏鸟死亡的急性病毒性传染病,严重危害鹦鹉养殖业的健康发展。为提高分子生物学方法检测APV的敏感性和特异性,对APV基因片段进行克隆和序列分析,设计合成1对特异性引物,以VP1基因为模板,经PCR扩增获得731 bp的核苷酸DNA,并用DIG标记,制备用于检测APV的特异性核酸探针;对制备的探针进行灵敏度检测,同时与普通PCR进行敏感性比较;使用制备的探针,对经分离鉴定和制备保存的其他7种禽病毒核酸进行特异性检测;用该核酸探针,对疑似感染APV的鹦鹉病料进行斑点杂交检测,并对鉴定为阳性的APV进行全基因组扩增和序列分析。结果显示:该探针可检测到2 pg量的APV特异性核酸片段;仅APV-VP1阳性核酸显色,呈现阳性反应,而阴性核酸和其他7种禽病毒核酸均不显色,呈阴性反应。结果表明:建立的核酸斑点杂交检测方法具有较高的灵敏度和特异性,可用于临床初步诊断。本方法的建立为我国开展APV分子流行病学调查及其感染的临床诊断提供了技术支撑。