NaYF_4:Er^(3+),Yb^(3+)UCNPs为供体的均相荧光分析

在基于荧光共振能量传递(FRET)的均相分析中,小尺寸的上转换发光纳米晶(UCNPs)用作供体被认为有很大的优势。通过配体交换的方式制备了大小约12nm、表面带有氨基的水溶性NaYF4∶Er3+,Yb3+UCNPs。傅里叶变换红外光谱证明配体交换成功;扫描电镜表明UCNPs的形貌和尺寸没有改变;圆二色光谱表征亲合素偶联UCNPs前后二级结构变化较小。以亲合素化的NaYF4∶Er3+,Yb3+UCNPs为供体;受体为生物素标记的藻红蛋白。通过亲合素—生物素系统拉近供体和受体,引发共振能量传递。当体系中加入自由的生物素分子,它们竞争地与UCNPs表面的亲合素结合,抑制能量传递过程,从而荧光光谱发生变化。根据这种光谱变化与加入生物素量之间的关系,对其进行定量检测,获得了纳摩尔级的检测限。

基于量子点的新型均相荧光免疫分析技术

研究一种检测人血清中癌胚抗原(CEA)的新型量子点均相免疫分析方法。制备还原型谷胱甘肽包被的水溶性量子点(QDs),偶联上抗CEA单克隆抗体,使异硫氰基荧光素(FITC)偶联上另一株抗CEA单克隆抗体,采用双抗体夹心法模式,充分利用两株抗体与CEA抗原的相互作用,从而验证QDs、FTTC两者与抗体偶联的生物活性,并研究QDs用于均相荧光共振能量转移(HFRET)免疫分析中的可行性与实用性。结果表明,FITC与QDs之间能够发生能量转移,其荧光共振能量转移信号与CEA浓度成线性相关,其工作曲线为LogY=2.504+0.154LogX(r2=0.981 97,P=0.002),并计算出其分析灵敏度为0.4ng/mL。该新型均相荧光免疫分析方法具有不需冲洗掉游离荧光标记物、灵敏度高等优势,为今后实现快速便捷、多通道、高灵敏度、微量化、自动化及高通量化的生物医学传感技术和现代免疫分析技术提供科学依据。

稀土穴状荧光配合物的合成与光谱性质

以2,6-二甲基吡啶-3,5-二甲酸二乙酯为起始原料,经N-溴代丁二酰亚胺(NBS)溴代、亲电取代反应合成了时间分辨荧光免疫分析双功能螯合剂2,6-{N,N′,N,N′-[二(2,2′-联吡啶-6,6′-二甲基)]二(氨甲基)}-吡啶-3,5-二羧酸二乙酯。经差热分析仪(DTA)、傅里叶变换红外光谱仪(FTIR)、核磁共振波谱仪(1 H NMR)、质谱仪(MS)等技术手段表征确认了化合物结构和性能。对该化合物与铕离子形成螯合物的荧光性质研究表明:激发光谱波长范围较宽,激发峰值为322nm;荧光发射峰为597nm(~5D_0-~7F_1)、618nm(~5D_0-~7F_2);荧光寿命为918μs;量子产率Φ=0.249。

微囊藻毒素-LR的纳米均相时间分辨荧光免疫分析法

目的建立了微囊藻毒素-LR(MC-LR)的纳米均相时间分辨荧光免疫分析(nano-homogeneous time-resolvedfluoroimmunoassay,NHTRFIA)法。方法制备MC-LR抗原包被发光微粒[加入1 mg发光微粒、偶联MC-LR的牛血清白蛋白(MC-LR-BSA)、人工抗原0.05 mg、0.4 mol/L氰基硼氢化钠溶液10μl,于37℃避光振荡反应48 h;加入0.3 mol/L的羧甲氧基胺半盐酸盐溶液(pH=5.0)10μl,以封闭未结合位点,于37℃避光孵育1 h后离心];在微孔中加入上述发光微粒、MC-LR标准品或样品、生物素化抗MC-LR单克隆抗体各25μl,于37℃孵育30 min,然后加入175μl包被链亲和素的感光微粒于37℃孵育10 min,采用纳米均相时间分辨荧光检测仪进行检测。结果该方法所得回归方程为y=-1 812x2-6 075x+12 424(R2=0.997 6),检出限为0.02 ng/mL,批内RSD为5.8%～7.2%,批间RSD为9.5%～9.9%,平均回收率为85.0%～120.0%。结论该方法具有特异性强、灵敏度高、稳定性好、操作简便、耗时短、测定范围宽、试剂寿命长的优点,尤其适合于生活饮用水中微量MC-LR的分析。

比较三种免疫分析法检测微囊藻毒素-LR

目的评估微囊藻毒素-LR(MC-LR)的时间分辨荧光免疫分析(TRFIA)、纳米均相时间分辨荧光免疫分析(NH-TRFIA)和酶联免疫分析(ELISA)三种免疫检测方法。方法通过比较包被板、反应步骤、信号系统和试剂用量,分析反应条件的差异;通过分析灵敏度、精密度和准确性,比较上述方法的性能指标;通过检测实际样品,评估方法的可靠性。结果 NH-TRFIA反应时间最短,试剂消耗量最少,灵敏度最高,量程宽;TRFIA信号最强,稳定性佳;三种方法精密度高,相对标准差均小于15%。三种方法检测实际样品与高效液相色谱法的分析结果差异无统计学意义,认为可靠。结论 TRFIA和NH-TRFIA,技术优势明显,应用前景广阔。

小鼠肿瘤坏死因子ELISA、TRFIA及ALPHAScreen检测方法的建立及评估

目的分别建立ELISA、TRFIA及ALPHAScreen检测小鼠肿瘤坏死因子(mTNF-α)的方法,对3种检测技术进行评估。方法采用两株针对mTNF-α不同表位的单克隆抗体,分别构建双抗体夹心法mTNF-α-ELISA、mTNF-α-TRFIA、mT-NF-α-ALPHAScreen,对以上3种检测方法进行反应动力学,方法学参数和相关性的比较。结果 ALPHAScreen采用均相反应系统,反应速度最快。TRFIA和ALPHAScreen由于采用了稀土离子作为标记物,其灵敏度和检测范围大大高于ELISA。样品检测结果表明,3种方法的相关性较好。结论本文建立的mTNF-α-TRFIA和mTNF-α-ALPHAScreen具有很好的应用前景。

铕螯合物的制备及光谱性质研究

稀土螯合物的制备是均相时间分辨荧光免疫分析中的关键部分,为了合成理想的稀土螯合物,以2,6-二(溴甲基)吡啶-3,5-二甲酸二乙酯为原料,首先优化合成了Li^+2,6-{N,N’,N,N’-[二(2,2’-联吡啶-6,6’-二甲基)]二(氨甲基)}-吡啶-二羧酸乙酯,使其产率明显提高。进一步选择乙腈和甲醇两种反应体系合成铕螯合物,并比较了不同反应体系下合成的铕螯合物的光谱性质。研究表明,乙腈和甲醇两种反应体系所得铕螯合物的激发光谱(最大激发波长为310nm)、发射光谱(最大发射波长为616nm)、量子产率基本相同,荧光强度在10^(-8)~10^(-5) mol·L^(-1)范围内与Eu^(3+)浓度均成线性,相关系数分别为0.993 73和0.986 65,两种铕螯合物(c=2.5×10^(-5) mol·L^(-1))的荧光强度略有差异,荧光寿命分别为825和830μs。因此,两种反应体系所得铕螯合物具有斯托克斯位移大、荧光强度强以及荧光寿命长等优点,并且此种穴状螯合剂结构中的吡啶-2,2-联吡啶可保护铕离子免受其他物质的干扰,是理想的稀土螯合物,可用于蛋白质、核酸等生物分子的标记。本研究不仅拓展了合成新型稀土螯合物的方法,而且为进一步建立均相时间分辨荧光免疫分析奠定了基础。

6,6'-二甲基-2,2'-联吡啶-4,4'-二甲酸甲酯的合成与表征

以6-甲基-2-羟基吡啶-4-甲酸甲酯为起始原料,经酯化反应制备2-甲基-6-(对甲苯磺酰氧基)吡啶-4-甲酸甲酯,使其在过渡金属镍络合物催化作用下自身偶联合成6,6'-二甲基-2,2'-联吡啶-4,4'-二甲酸甲酯,通过改变投料比例、反应温度及投料顺序获得最佳反应条件,收率77%。经核磁共振、红外光谱、质谱及差示扫描热量法等对分子结构进行了表征,验证了合成方法的可靠性。该结构能够满足均相时间分辨荧光免疫分析螯合剂中间体的需求。目前,它已成功用于均相时间分辨荧光免疫分析。

稀土铕双功能螯合剂的合成

均相时间荧光免疫分析(HTRF)是一种快速、简便的分析方法,它将荧光共振能量转移与时间分辨荧光相结合,以稳定的穴状稀土螯合剂为荧光标记物进行检测分析。为了满足HTRF的分析要求,以2,6-二甲基吡啶-4-羧酸甲酯为原料,经N-溴代琥珀酰亚胺(NBS)溴化、水解等化学反应制备得到Eu^(3+)-双功能螯合剂2,6-{N,N',N,N'-[二(2,2’-联吡啶-6,6’-二甲基)]二氨甲基}-吡啶-4-羧酸-Eu^(3+),通过IR、MS等表征方法证明各化合物结构的准确性。对螯合剂荧光性质进行研究。螯合剂的最大激发波长为320nm;最大发射波长为597nm (~5D_0-~7F_2),Stokes位移达到277nm;荧光寿命828μs;荧光量子产率Y_f=0.233。其荧光性质可以满足HTRF的分析要求。

新型稀土螯合剂6,6’-{N,N’,N,N’-[二（2,2’-联吡啶-6,6’-二甲基）]二氨甲基}-2,2’-联吡啶-4-羧酸-Eu3+的合成

以2-氯-6-甲基异烟酸甲酯为起始原料,经偶联、酯化、取代和水解等反应合成了新型稀土螯合剂6,6′-{N,N′,N,N′-[二(2,2′-联吡啶-6,6′-二甲基)]二氨甲基}-2,2′-联吡啶-4-羧酸-Eu 3+(C6),其结构和性能经FL,IR,MS(ESI)和元素分析表征。结果表明:C6的激发峰位于255~340 nm,最大激发波长为290 nm,发射峰为612 nm,荧光寿命为801μs。

铕螯合剂对甲胎蛋白单克隆抗体标记的研究

目的探究自合成铕螯合剂对甲胎蛋白单克隆抗体的标记方法。方法经EDC和NHS活化的铕螯合剂偶联甲胎蛋白单克隆抗体,通过透析收集标记抗体,检测荧光强度和免疫活性,计算回收率和标记率。结果标记抗体荧光强度高,免疫活性无明显变化,回收率为94%,标记率为15。结论自合成的铕螯合剂可用于甲胎蛋白单克隆抗体的标记,标记效果理想,可进一步建立均相时间分辨荧光免疫分析方法。

基于ELISA、TRFIA及AlphaScreen技术的血管内皮生长因子受体3拮抗剂筛选模型的构建及比较

血管内皮生长因子受体3(VEGFR-3)为淋巴管特异标记物,与肿瘤淋巴管生成和转移具有明显的相关性,VEGFR-3胞内域的酪氨酸激酶(TK)直接参与了胞内信号转导途径,因此VEGFR-3 TK抑制剂可能成为抑制肿瘤淋巴道转移的有效药物。采用大肠杆菌成功表达人源VEGFR-3酪氨酸激酶(VEGFR-3 TK),并以其为靶点,分别构建了基于ELISA,TR-FIA及AlphaScreen技术的高通量药物筛选模型,并从反应条件、方法学参数及相关性等方面对这三种模型进行了评估及比较。AlphaScreen采用均相反应系统,反应速度最快。TRFIA和AlphaScreen由于采用了稀土离子作为标记物,其灵敏度和检测范围大大高于ELISA,且自动化程度高。样品检测结果表明,三种方法的相关性较好,其中TRFIA和AlphaS-creen技术适用于大规模药物筛选,具有很好的应用前景。