坎皮纳斯类芽孢杆菌木聚糖酶的纯化以及酶学性质

采用硫酸铵盐析、Sephadex G-50凝胶过滤、DEAE Sepharose Fast Flow离子交换层析对坎皮纳斯类芽孢杆菌(Paenibacillus campinasensis)xy-7发酵液进行分离纯化,获得纯化的木聚糖酶,纯化倍数为26.36,酶活回收率为5.13%。十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结果为单一条带,分子质量为24.5 ku。酶学性质研究结果表明,该酶的最适反应温度为60℃,最适p H值为8.0。K+、Fe2+对酶有激活作用,Zn2+、Cu2+对酶有强烈的抑制作用。以榉木木聚糖为底物时,米氏常数Km=4.733 mg/m L,最大酶反应速率Vm=315.85μmol/(min·mg)。

产β-环糊精葡萄糖基转移酶菌株的筛选、鉴定及酶学性质

利用环糊精葡萄糖基转移酶（CGTase）快速筛选法从枝江酒业的酵泥中筛选获得11株CGTase产生菌。用酚酞法测定所得11株菌株的酶活,最终得到β-CGTase酶活最高的一株菌株,命名为Hhj-1。通过对菌株的形态观察以及16S rDNA测定,并建立该菌株的系统发育树,确定该菌株属于坎皮纳斯类芽孢杆菌（Paenibacillus campinasensis）。对该菌所产的β-CGTase粗酶液酶学性质进行研究,结果表明,该酶的最适反应温度为70℃,最适反应pH为7.5。在35~45℃保温1 h相对酶活仍可保持在90%以上,且该酶在pH 5.0~10.0的较宽范围内都较稳定,说明其对pH适应范围较广,因此应用有较大的灵活性。

β-环糊精葡萄糖基转移酶基因的克隆、表达及酶学性质

获取来自坎皮纳斯类芽孢杆菌(Paenibacillus campinasensis)的编码β-环糊精葡萄糖基转移酶(β-cyclodextrin glycosyltransferase,β-CGTase)的基因cgt,并将带有His-Tag去除信号肽的cgt基因克隆到表达载体p ET28a(+)后,转入大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达。通过热变性和Ni-NTA获得重组β-CGTase纯化酶,再通过SDSPAGE检测,蛋白分子量在74 k Da左右,并初步研究了重组β-CGTase的酶学性质。结果表明:重组β-CGTase的酶促反应的最适p H为7.0,并且在p H为5.5~10.0范围稳定,最适反应温度为为65℃,重组酶在55℃保温5 h时仍保持90%以上的活性。研究一些金属离子和化学试剂对重组酶的影响发现β-CGTase是一种金属酶,Ca^(2+)对酶的催化起关键作用,尤其是在低浓度下对酶的活性有促进作用。对重组酶的酶促反应动力学研究得出Km为3.75 mg/m L,Vmax为0.33 mg/(min·m L)。该研究成功实现了β-CGTase基因的异源表达,为进一步实现β-CGTase的工业化生产和应用奠定了基础。