猪产毒多杀性巴氏杆菌皮肤坏死毒素的细胞毒性及其抗体的制备

将猪产毒多杀性巴氏杆菌(toxigenicPasteurella multocida,T+Pm)增菌后经超声波破碎,用DEAE-52阴离子交换柱和Sephadex G-200处理,提纯天然多杀性巴氏杆菌皮肤坏死毒素(Pasteurella multocidatoxin,PMT)。经Western blot和细胞毒性试验证实,该毒素具有良好的反应原性,且7 ng/mL的PMT能使Vero细胞病变。用该毒素制成的类毒素菌苗免疫2头健康断奶仔猪,同时设T+Pm灭活苗和PBS对照组。4次免疫后,琼脂扩散试验检测类毒素菌苗组毒素抗体效价达1∶16,而灭活苗组未见毒素抗体产生。用200μg提纯的PMT和50亿T+Pm混合液经耳静脉攻毒各组试验猪,结果发现对照组和灭活苗组试验猪在攻毒后出现明显的急性败血症状,未产生毒素抗体;类毒素菌苗组试验猪10 d后耐过,经颈动脉采血收集高免血清,效价达1∶32。

猪源Bb SC-SN株的分离鉴定及其皮肤坏死毒素(DNT)全基因序列分析

【目的】了解当前支气管败血波氏杆菌（Bb）地方菌株皮肤坏死毒素（DNT）基因的变异特点。【方法】利用分离培养、PCR及16SrRNA扩增片段同源性分析,对采自四川遂宁某规模化猪场有明显萎缩性鼻炎症状的鼻拭子进行病原分离鉴定,并对分离株的DNT基因进行克隆和序列分析,对其抗原域、氨基酸二级结构、特定区域位于蛋白质表面可能性等参数进行预测,分析其B细胞抗原表位。【结果】成功分离得到一株支气管败血波氏杆菌,命名为支气管败血波氏杆菌SC-SN株。分离株DNT基因序列全长4 357bp,与其他11株菌DNT基因的核苷酸序列同源性为93.1%~100.0%,但由于其356位插入碱基A,使得该序列仅编码1 426个氨基酸,与上述11株DNT基因编码的氨基酸序列同源性仅为12.8%~47.0%。遗传进化树显示,SC-SN分离株与S798日本株和未知1株的亲缘关系最近。软件预测结果显示,Bb SC-SN株DNT基因编码氨基酸B细胞抗原表位发生较大变化。【结论】经鉴定,分离株确为支气管败血波氏杆菌,且SC-SN株的DNT基因序列变异较大,第356位插入的碱基A,对其氨基酸序列、ORF及B细胞抗原表位分布产生了较大的影响。

间斑寇蛛坏死毒素致大鼠急性肾损伤的病理改变

目的 以间斑寇蛛毒素致急性肾损伤的实验大鼠为模型,从病理角度研究不同剂量的蛛毒致大鼠肾损伤的程度。方法 采集蛛毒粗毒后注射到大鼠体内,每小时观察中毒反应,24 h后观察肾功能变化,处死后进行肾脏组织病理学实验。结果 蛛毒剂量达到10 ug/kg时,实验大鼠即产生了明显的神经毒反应,随着蛛毒剂量的增加实验大鼠肾脏逐渐表现出肾小囊及肾小管间质出血、水肿、肾小球坏死、肾小管内皮细胞呈空泡样变性、肾皮质部呈玻璃样改变、肾髓质部无完整的肾小球结构及玻璃样改变的连续病变特征;然而肾功能各项指标如尿素氮、尿酸、肌酐及电解质钾、钠、钙、氯也无变化(P>0.05),但各剂量蛛毒组的尿蛋白均显著升高(3+)(P <0.01)。结论 新疆间斑寇蛛的蜘蛛坏死毒素,较小剂量就可使大鼠表现出尿蛋白的大量升高,这与肾组织的病理性坏死直接相关,虽未表现出肾衰的特征,可能是与急性期的相关指标未来得及变化有关。

猪多杀性巴氏杆菌皮肤坏死毒素的毒力及免疫原性研究

为研究致猪萎缩性鼻炎的主要病原体—多杀性巴氏杆菌皮肤坏死毒素(PMT)的毒力及免疫原性,本研究从A型多杀性巴氏杆菌中提取、纯化该毒素后获得粗提的PMT,含量约为3 200μg/mL,纯度约2.2%;经纯化后纯度可达90%以上;将不同剂量的PMT感染小鼠,测定其半数致死量(MLD50),同时将不同剂量PMT感染仔猪,测定其致仔猪鼻甲骨萎缩的最小感染剂量。结果显示,纯化PMT对小鼠的MLD50为0.5μg/kg,对仔猪致鼻甲骨萎缩的最小感染剂量为0.15μg/kg。纯化PMT经甲醛灭活并加入氢氧化铝佐剂后制备类毒素疫苗,分别免疫小鼠和仔猪并测定其免疫原性;对免疫后的小鼠和仔猪攻毒,观察记录小鼠死亡情况与仔猪鼻甲骨萎缩程度,测定纯化PMT类毒素疫苗的保护效果。结果显示,采用纯化PMT免疫小鼠与仔猪,首免后28 d,血清经试剂盒检测抗体阳性率均达到100%;首免后28 d对小鼠攻毒,攻毒后7 d纯化PMT对小鼠提供的免疫保护率达到100%(10/10);首免后28 d对仔猪攻毒,攻毒后28 d纯化PMT对仔猪提供的免疫保护率达到100%(5/5)。本研究提取并纯化了PMT,虽然毒力较强但具有较好的免疫原性,为PMT的提取、纯化及制备灭活类毒素疫苗提供了实验依据。

猪多杀性巴氏杆菌皮肤坏死毒素亚单位蛋白的制备及免疫原性研究

为获得针对猪萎缩性鼻炎主要病原体——多杀性巴氏杆菌皮肤坏死毒素的高免疫原性抗原,本试验构建、表达并验证该毒素的亚单位蛋白抗原,将猪多杀性巴氏杆菌毒素PMT基因与pMD19-T载体进行连接、转化,经序列分析鉴定后,分别使用Bam HⅠ、Hin dⅢ与BlpⅠ限制性内切酶将其酶切为3个基因片段。将片段1(Tox1)、片段2(Tox2)和片段3(Tox3)分别亚克隆至原核表达载体pET32-b、pET32-a和pET32-b中,构建3个重组表达载体。将重组表达载体转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导后,分别进行SDS-PAGE与Western blotting检测,并使用小鼠与豚鼠初步研究其免疫原性。结果显示,构建的3个基因片段长度分别为776、409与410 bp,与GenBank中相关序列具有高度同源性;3个蛋白片段表达正常,表达量分别达到379.95、447.62与459.82μg/mL,SDS-PAGE验证条带分别为75、77与53 ku;因3个片段位置不同,仅Tox3有Western blotting检测条带,与理论预测相符;使用3种表达蛋白免疫小鼠与豚鼠后,二免后14 d,血清经试剂盒检测阳性率达到100%,对二免后14 d小鼠攻毒保护率达到93%。本研究成功构建了PMT的3个亚单位活性片段,且具有较好的免疫原性。

支气管败血波氏杆菌皮肤坏死毒素的重组表达及其生物学特性

皮肤坏死毒素(DNT)是支气管败血波氏杆菌的主要致病因子之一。通过PCR分段扩增和克隆获得了全长4 356 bp的dnt基因,并利用pET-28a/BL21系统对其进行了融合表达。Western blotting检测结果表明,表达产物具有良好的免疫学活性。使用His-band purification kit纯化试剂盒纯化后,得到纯度为93.2%的融合蛋白His6-DNT。在乳鼠皮肤坏死试验中,表达产物His6-DNT和天然DNT均能导致乳鼠皮肤产生坏死性病变。在乳鼠皮肤坏死阻断试验中,兔抗His6-DNT血清能中和天然DNT使其失去对乳鼠的皮肤坏死毒性。试验结果表明,重组蛋白具有天然DNT的生物学毒性和免疫原性,所产生的抗体具有中和活性。文中所获得的重组DNT蛋白具有良好的生物学活性,为DNT的结构和功能研究奠定基础。

产毒素多杀性巴氏杆菌的鉴定

采用菌落多重PCR方法对分离保存的28株多杀性巴氏杆菌进行种型和毒素基因的检测,结果表明,菌株C51-6、M-4和P-2237为产毒素多杀性巴氏杆菌,菌株C51-6和P-2237为荚膜血清D型,菌株M-4为荚膜血清A型。同时用金黄色葡萄球菌抑制试验、中性吖啶黄沉淀试验和豚鼠皮肤坏死试验对PCR方法进行了验证。基于对甘露醇、卫茅醇、山梨醇、海藻糖的发酵能力和产生鸟氨酸脱羧酶的特性,3株菌株鉴定为多杀性巴氏杆菌多杀亚种。

G型产气荚膜梭菌NetB毒素研究进展

G型产气荚膜梭菌可引起鸡坏死性肠炎和肠毒血症,致病力强,在自然界中广泛存在,严重危害养鸡业的发展。坏死性肠炎B样毒素(necrotic enteritis B-like toxin,NetB)是近年来发现的是一种新的β-成孔毒素(β-pore-forming toxin,β-PFT),是G型产气荚膜梭菌的主要致病性毒素和保护性抗原,深入研究该毒素的结构功能及致病机理对于鸡坏死性肠炎的防控具有重要意义,但至今尚无相关系统性综述报道。鉴于此,论文主要对国内外关于G型产气荚膜梭菌的流行概况、NetB毒素的分子结构特征、生物学特性、致病机理及其相关防治制剂等方面的研究进行综述,为进一步基于NetB毒素研制鸡坏死性肠炎的防治制剂提供参考。

支气管败血波氏杆菌dnt基因的克隆、表达及活性鉴定

通过PCR扩增获得支气管败血波氏杆菌的全长4 395 bpdnt基因,并利用pET-28a/BL21系统对其进行了融合表达。Western-blot检测结果表明,表达产物具有良好的免疫学活性。使用His-band purification kit纯化后,得到纯度为93.2%的融合蛋白HIS6-DNT。在乳鼠皮肤坏死试验中,表达产物HIS6-DNT和天然DNT均能导致乳鼠皮肤产生坏死性病变。在乳鼠皮肤坏死阻断试验中,兔抗HIS6-DNT血清能中和天然DNT,使其失去对乳鼠皮肤的坏死毒性。试验结果表明,重组蛋白具有天然DNT的生物学毒性和免疫原性,所产生的抗体具有中和活性,为DNT的结构和功能研究奠定了基础。

支气管败血波氏杆菌SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法的建立

为建立支气管败血波氏杆菌SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法,本研究根据波氏菌属毒力基因DNT设计一对特异性引物,通过优化,确定最佳反应条件,建立了支气管败血波氏杆菌荧光定量PCR检测方法。并对其进行敏感性、特异性、重复性试验以及临床样品的检测。以支气管败血波氏杆菌标准质粒为模板,建立标准曲线结果显示:标准品浓度在1.13×10~8拷贝/μL～1.13×10~2拷贝/μL范围内具有良好的线性关系,相关数R^2=0.997;该方法的灵敏度可达1.13×10~1拷贝/μL。建立的荧光定量PCR方法与副猪嗜血杆菌、猪链球菌、金黄色葡萄球菌等12种细菌和伪狂犬病毒、猪瘟病毒等4种病毒无交叉反应,具有良好的特异性;批内变异系数(CV)均小于2%,批间变异系数均小于4%,具有良好的稳定性。对临床样品的检测结果显示该方法检测的阳性率为57.7%,与普通PCR的符合率为93.24%。本研究建立的方法可以用作支气管败血波氏杆菌感染的早期诊断、快速检测与定量分析。

兔支气管败血波氏杆菌DNT蛋白的分段表达及其免疫保护性研究

皮肤坏死毒素(DNT)是支气管败血波氏杆菌(Bb)的主要毒力因子之一。为研究DNT结合位点和催化位点的免疫保护性,本研究分别将其核苷酸序列N-端的1 612 bp片段(DNT1)和C-端的973 bp片段(DNT3)克隆到原核表达载体pET-28a(+)中,经IPTG诱导后在E.coli BL21(DE3)中获得表达。SDS-PAGE和western blot检测表明重组蛋白DNT1、DNT3均具有良好的反应原性。在主动免疫保护试验中,重组蛋白免疫组小鼠均能够产生较高的DNT抗体水平;当使用2 LD50的Bb强毒株BJL0504进行腹腔攻毒后,其存活率为100%,而阴性对照组则为40%;当使用1.07×108 cfu/mL Bb强毒株BJL0504进行滴鼻攻毒后第9 d时,重组蛋白免疫组小鼠已基本清除肺脏内的Bb菌,而阴性对照组小鼠肺脏内的Bb菌落数仍高达1.2×105 cfu/肺。本实验结果表明,DNT的结合位点和催化位点均具有良好的免疫保护性,有希望作为疫苗添加成分,为新型疫苗的研制提供实验依据。

家兔支气管败血波氏杆菌重组蛋白DNT1的原核表达及其间接ELISA方法的建立

目的表达支气管败血波氏杆菌(Bordetella bronchiseptica,Bb)DNT蛋白,并以此建立检测Bb抗体的间接ELISA方法。方法参照GenBank公布的猪源支气管败血波氏杆菌dnt基因序列(AB020025)针对其N-端设计了一对特异性引物,PCR扩增出相应的核苷酸片段。将PCR扩增产物连接至原核表达载体pET-28a(+)载体中,以E.coli BL21(DE3)为表达菌株进行诱导表达,以纯化重组蛋白DNT1作为诊断抗原,通过探索最佳抗原包被量和抗体血清稀释倍数,建立检测支气管败血波氏杆菌重组蛋白DNT1抗体的ELISA方法。结果成功克隆了dntN-端的基因序列,并在E.coli BL21(DE3)中获得高效表达,经SDS-PAGE、Western blot分析显示重组蛋白DNT1具有良好的抗原性。应用重组蛋白DNT1为抗原建立了检测Bb血清抗体的间接ELISA诊断方法。试验确定重组蛋白DNT1抗原的包被浓度为6.25μg/mL,最适血清稀释度为1∶100。结论建立的ELISA检测方法,不仅为Bb抗体检测提供了一种比较实用的血清学检测手段,也为进一步开发Bb检测试剂盒奠定了基础。

慢性乙型肝炎中医证型的客观化判别分析

目的:探索慢性乙肝中医证候的微观辨证体系。方法:选取慢性乙肝患者100例,严格按照《病毒性肝炎中医辨证标准》进行中医分型并分组,抽血测定其血浆内毒素(ET)含量、血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)及肝功能(ALT、AST、TBIL)含量,与同期20例健康体检者作对照。并运用逐步判别分析法制定判别方程。结果:慢性乙肝各中医证型组血浆ET、血清TNF-α、IL-6及肝功能(ALT、AST、TBIL)之间呈显著正相关。通过逐步判别分析,筛选出ALT、TBIL、ET、TNF-α、IL-6五项判别能力强、显著性水平高的指标,建立的数学判别模型经回顾性检验,判断正确率为84.6%。结论:ET、ALT、TBIL及TNF-α、IL-6五项指标为慢性乙肝中医辨证有价值的指标。运用判别分析建立的判别方程式,为慢性乙肝中医辨证提供了客观的依据。

大承气汤对烫伤大鼠肠黏膜上皮细胞超微结构变化的影响

目的:了解和揭示大承气汤对SD大鼠烫伤后1周内血浆肿瘤坏死因子、内毒素、肠组织细胞凋亡的影响,观察烫伤大鼠小肠上皮细胞超微结构的变化,探讨本方对肠黏膜屏障保护作用机制。方法:将SD大鼠70只随机分成3组,60只大鼠制备成烫伤模型随机分成中药治疗组(30只)和对照组(30只),中药治疗组给予大承气汤,对照组给予生理盐水灌胃;第3组为正常组10只。治疗组和对照组在给药后第1、3、7天各处死10只,均检测血浆肿瘤坏死因子、内毒素的含量,观察大鼠肠组织细胞凋亡的变化,给药后第7天观察大鼠小肠上皮细胞超微结构变化。结果:大承气汤可明显抑制烫伤大鼠内毒素易位,减少肿瘤坏死因子的产生,抑制肠组织细胞凋亡,明显修复和改善烫伤大鼠肠黏膜细胞超微结构的损伤。结论:中药方剂大承气汤有较理想的肠道屏障保护作用,是预防和治疗肠道屏障功能障碍引发的多器官、多系统功能衰竭的有效的方药。

猪腹部火器伤肠管穿透后TNF-α在肝细胞凋亡中的作用

目的:探讨TNF-α在腹部火器伤肠管穿透后肝细胞凋亡中的作用机制。方法:健康长白仔猪42只随机等分为对照组和伤后1、2、4、8、12和24h组。伤后各组建立腹部火器伤肠管穿透模型。用显色基质鲎试剂法检测各组血浆内毒素水平,用免疫组织化学图像分析法测定各组肝内TNF-α含量,采用双抗体夹心ELISA法测定各组血清TNF-α水平,同时测定肝细胞凋亡情况。结果:伤后各组血浆内毒素水平、血清TNF-α水平、肝组织TNF-α的表达及肝细胞凋亡指数均明显高于对照组(P<0.05)。血浆内毒素水平于伤后8h出现高峰,伤后12h仍维持在高峰值水平。血清TNF-α在伤后12h达到高峰(94.36±10.18)ng/L,肝内TNF-α活性和肝细胞凋亡指数均于伤后2h和12h出现2个高峰,与伤后血浆内毒素水平变化基本一致。相关分析表明,伤后肝组织TNF-α含量与血浆内毒素水平及肝细胞凋亡指数均存在正相关(P<0.05)。结论:腹部火器伤肠管穿透后内毒素血症可引起肝内和血液内TNF-α增高,介导肝细胞凋亡的发生。

创面的环境质量决定瘢痕的严重程度——烧伤创面的环境哲学

探讨烧伤创面的环境性质、演化规律及其与人体环境的关系,依此指导临床治疗。创面是被坏死毒素污染的环境,烧伤病理变化的实质就是清除坏死毒素,净化再生环境,环境质量决定愈后瘢痕的严重程度。

阻塞性黄疸对肾功能损害的临床研究

目的:研究阻塞性黄疸患者在手术前后血液中内毒素、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、心钠素等物质浓度改变的情况及其对患者肾功能的影响程度。方法:观察阻塞性黄疸患者手术前3、1d,手术后1、3、7d5个时段内毒素、TNF-α、心钠素浓度的变化情况。并与非阻塞性黄疸的胆石症患者相比较。结果:观察组中术后1d血浆内毒素浓度较术前明显降低(P<0.05),并呈进行性下降。但术后7d仍较对照组的浓度高(P<0.05)。手术前观察组血浆心钠素含量高于对照组(P<0.01),在手术后呈进行性下降,于第7天与对照组相比差异无统计学意义。观察组血清TNF-α浓度在术前3、1d,术后1、3d均高于对照组(P<0.05),术后7d差异无显著性。结论:阻塞性黄疸患者发病过程中内毒素血症、TNF-α浓度升高是肾功能损害的重要原因,手术解除胆道梗阻能阻断病情进展,是治疗的根本方法。