巢湖鸭生长素基因和垂体特异性转录因子1基因的PCR-SSCP检测

以生长素基因Ghrelin和垂体特异性转录因子1Pit-1基因为候选基因,采用PCR-SSCP和DNA测序技术检测2个候选基因在巢湖鸭群体中的单核苷酸多态性(SNPs)。结果表明,Ghrelin基因exon 3第54 bp位置有G→A碱基的点突变,在巢湖鸭群体中检测到AA、AB、BB 3种基因型,A等位基因频率为0.49,B等位基因频率为0.51;在exon 5第149位和166位发生了C→A和G→T的突变,检测到MM、MN、NN 3种基因型,M等位基因频率为0.19,N等位基因频率为0.81。Pit-1基因的2对引物的扩增片段均未检测到多态性,说明所检测的Pit-1基因外显子3和4序列比较保守。

猪POU1F1基因第三内含子Msp Ⅰ酶切片段多态特征的研究

采用PCR-RFLPs技术,以Msp I为内切酶,检测猪POU1F1基因中片段为2.1 kb的第三内含子中的多态位点:1.68 kb(C等位基因)和0.85/0.83 kb(D等位基因),分析各多态位点在长白猪、杜洛克猪、小梅山猪、香猪、姜曲海猪5个品种群中的分布,并通过X2检验比较这5个猪种间的基因型差异。X2适合性检验结果表明:Msp I酶切突变位点的3种基因型在5个品种中分布差异均极显著(P<0.01)。中国地方品种小梅山猪、姜曲海猪等位基因C的比例很高,中国地方品种香猪等位基因C的比例则比较高,国外品种长白猪、杜洛克猪等位基因C的比例很低。

猪垂体特异性转录因子的研究进展

垂体特异性转录因子(PIT-1)是POU结构域因子家族的一员,POU结构域因子家族是一类转录调节基因.Pit～1发挥生物学功能的关键在于识别特异的基因顺序并与之结合,从而引起细胞内基因转录,促进垂体前叶促生长素细胞(S.Matotraphs)、催乳细胞(1actot.oph)和促甲状腺素细胞(thyvotroph)基因的转录,其生物学活性由它特有的分子结构决定。随着生物技术的发展与应用,该基因在人、猪和牛已被定位标记。本文对猪的垂体特异性转录因子的研究作一简要综述。

牛POU1F1基因单核甘酸多态性与产奶性状关系的研究进展

垂体特异性转录因子-1(pituitary-specific transcription factor,POU1F1)是与牛产奶性状相关的重要候选基因,发生在POU1F1上的单核苷酸突变与产奶性状密切相关。作者从POU1F1及其蛋白质的结构、功能及与产奶性状的关系等几个方面进行了阐述。

哺乳动物POU1F1基因对其生长发育的作用

POU1F1基因是POU基因家族的成员之一,它以GH、PRL和TSHβ起着重要的调控作用,对哺乳动物的垂体发育和激素表达有着重要的调节功能。POU1F1基因的突变可以导致垂体的发育不全,并阻碍GH、PRL、TSHβ基因的正常表达。笔者对POU1F1基因的结构及其功能特别是对鼠、猪和人类的生长发育所产生的影响进行了综述。

miR-155靶向调控SP1、E2F2mRNA转录水平的功能验证

目的观察微小RNA155(miR-155)对端粒酶逆转录酶(h TERT)调控相关蛋白特异性蛋白1(SP1)及转录因子E2F2重组质粒表达的影响,为进一步研究miR-155调控肿瘤细胞h TERT表达的机制提供实验基础。方法采用生物信息学预测软件Target Scan和Miranda预测SP1和E2F2 mRNA 3'-UTR是否是人miR-155的作用靶点。针对SP1和E2F2 mRNA 3'-UTR设计互补的两条寡核苷酸,包括目标序列(即SP1、E2F2野生型序列)及突变序列(SP1-mu、E2F2-mu),构建SP1和E2F2 mRNA 3'-UTR报告基因载体p MIR-SP1、p MIR-E2F2、p MIR-SP1-mu和p MIRE2F2-mu。培养HEK-293细胞,采用脂质体法将SP1和E2F2的野生型和突变型p MIR-Luc质粒共转染HEK-293细胞24 h。将细胞分为SP1空白对照组、SP1目标序列组、SP1突变序列组、E2F2空白对照组、E2F2目标序列组、E2F2突变序列组,均加入0.2μg重组质粒、0.01μg对照质粒和0.375μL寡核苷酸,培养24 h。采用双荧光素酶报告基因系统检测双荧光素酶活性,以萤火虫荧光素酶活性值(F)/海肾荧光素酶活性值(R)比值评价miR-155与SP1及E2F2 mRNA 3'-UTR结合效果。结果在线预测结果示,SP1 mRNA 3'-UTR和E2F2 mRNA 3'-UTR均有与miR-155完全互补配对的序列,确定二者均为miR-155的靶基因。经鉴定,SP1和E2F2报告基因重组质粒构建成功。SP1目标序列组F/R低于SP1空白对照组及SP1突变序列组(P均<0.05),E2F2目标序列组F/R低于E2F2空白对照组及E2F2突变序列组(P均<0.05)。结论成功构建了SP1和E2F2报告基因重组质粒,证实miR-155能够靶向结合SP1和E2F2 mRNA 3'-UTR,在转录后水平抑制SP1和E2F2的表达。

miR-23b-3p对延边黄牛垂体细胞中生长激素分泌影响的研究

为了分析血液外胞体miRNA对延边黄牛垂体细胞中生长激素(GH)分泌的影响,试验选择在延边黄牛和韩延牛血液外胞体中存在显著差异表达的miR-23b-3p,分析其对延边黄牛垂体细胞中GH分泌的影响机制。首先进行延边黄牛垂体细胞的原代培养,然后将miR-23b-3p的mimics(miR-23b-3p-mi组)、mimics对照品(NC组)、inhibitor(miR-23b-3p-in组)、inhibitor对照品(iNC组)转染至已建立的垂体原代细胞中,48 h后收集细胞,提取总mRNA和总蛋白,利用实时荧光定量PCR(qPCR)和Western-blot技术分别检测GH mRNA转录和蛋白的表达情况;利用targetscan和RNAhybrid分析软件对miR-23b-3p的靶基因进行预测,再利用双荧光素酶报告基因系统对miR-23b-3p的靶关系进行了验证;最后利用实时荧光定量PCR和Western-blot技术分别检测miR-23b-3p靶基因的mRNA转录和蛋白表达情况。结果表明:miR-23b-3p-mi组的延边黄牛垂体细胞中GH mRNA转录和蛋白表达水平极显著低于NC组(P<0.01),而miR-23b-3p-in组的延边黄牛垂体细胞中GH mRNA转录和蛋白表达水平显著高于iNC组(P<0.05);miR-23b-3p靶向了垂体特异性转录因子(POU1F1)的3′UTR;miR-23b-3p-mi组的POU1F1 mRNA转录和蛋白表达水平极显著低于NC组(P<0.01),而miR-23b-3p-in组的POU1F1 mRNA转录和蛋白表达水平极显著高于iNC组(P<0.01)。说明miR-23b-3p可通过调节POU1F1基因的表达来调控延边黄牛垂体细胞GH的分泌,进而调控延边黄牛的生长发育。

细胞分化周期蛋白27基因沉默抑制GH3细胞迁移及其分泌功能

目的进行3种全基因组外显子测序所得基因体外的功能验证,为垂体柄中断综合征病因研究的体内实验提供理论依据。方法将细胞分化周期蛋白27(cell division cycle protein 27,CDC27)、神经纤维瘤病1型(neurofibromatosis type1,NF1)、X染色体关联的泛素特异性蛋白酶9(ubiquitin specific peptidase 9,X-Linked,USP9X)三种基因经由小干扰RNA(si RNA)分别转染至细胞内,每种基因均设置实验组、阴性对照(negative control,NC)组、空白细胞组。通过RTPCR筛选出各基因最佳的si RNA敲低序列以用于复筛,Western bolt复筛各基因最佳敲低序列在蛋白水平的表达,以确定目标基因进行下一步研究。依次运用CCK-8检测细胞增殖能力及形态,细胞划痕实验检测细胞迁移,酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测细胞分泌功能,Western bolt检测垂体特异性转录因子-1(pit-oct-unc class 1homeobox 1,POU1F1)和垂体特异性转录因子祖先蛋白(homeobox protein prophet of pit-1,PROP1)表达水平。结果 1)CDC27在si RNA 117和1968序列时能够达到稳定的沉默效率,并且在mRNA及蛋白两个水平上均能够被敲低,NF1和UPS9X仅能在mRNA水平上实现敲低而未实现蛋白水平的敲低,无法进行后续实验;2)CDC27沉默对于细胞的增殖及形态无明显影响(P>0.05);3)CDC27沉默能够明显抑制细胞的迁移能力(P<0.05);4)CDC27沉默能够明显抑制细胞分泌生长激素(growth hormone,GH)、泌乳素(prolactin,PRL)分泌(P均<0.05),对促甲状腺激素(thyroid stimulating hormone,TSH)的分泌无明显影响(P>0.05);5)CDC27沉默能够明显下调POU1F1与PROP1的表达水平(P<0.05)。结论 CDC27沉默可以抑制GH3细胞的迁移及其生长激素、泌乳素的分泌。