用埃尔托霍乱弧菌噬菌体对非O_1群霍乱弧菌和拟态弧菌分型探讨

1989年我们在作埃尔托霍乱弧菌噬菌体分型的同时,也把非O1群霍乱弧菌的菌株同时进行分型,结果发现非O1群霍乱弧菌也可被某些型别的噬菌体裂解,为此我们将1986～2001年从各类标本中分离所得的284株非O1群霍乱弧菌和9株拟态弧菌用埃尔托型霍乱弧菌噬菌体进行分型探讨,现将结果报道如下.

埃尔托霍乱弧菌分型噬菌体VP_1～VP_5对O139霍乱弧菌的裂解

收集、分离、鉴定来自我省临床患者的 51株O1 39霍乱弧菌 ,用埃尔托霍乱弧菌的分型噬菌体VP1 ～VP5对它们进行裂解实验 ,它们被分成 1 1个类别 ,其噬菌体裂解谱相同于埃尔托霍乱弧菌噬菌体分型的 1、2、1 2、1 1、2 0、2 5、31、5、7、1 9、32型的裂解谱 ,显示O1 39霍乱弧菌可以进一步区分。埃尔托霍乱弧菌噬菌体分型的 1～ 6型是流行株 ,是使人致病的主要菌型 ;而本文中O1 39霍乱弧菌不论被VP1 ～VP5裂解得如何 ,都是使人致病的菌体。作为霍乱致病菌的埃尔托型和O1 39型菌株 ,O1 39霍乱弧菌使人感染的类别更多 ,传染性更强 。

埃尔托型霍乱弧菌变异与其保菌越冬的研究

埃尔托型霍乱弧菌变异与其保菌越冬的研究蚌埠医学院蚌埠２３３００３林特夫，黄谷良，蒋玖，娄峥，张元和，张世馥，李明君，姚敏，唐素兰上海细胞生物研究所朱景德蚌埠市卫生防疫站郭符则埃尔托型霍乱弧菌（Ｖｉｂｒｉｏｃｈｏｌｅｒａｅｂｉｏ－ｔｙｐｅｅｌｔｏｒ，Ｅ...

霍乱弧菌分型噬菌体VP3尾丝蛋白的表达及功能分析

目的研究霍乱弧菌分型噬菌体VP3的尾丝蛋白的受体结合功能,探讨VP3感染机制。方法分析VP3的尾丝蛋白gp44序列并克隆表达和纯化,以荧光显微镜和激光共聚焦显微镜观察尾丝蛋白与VP3敏感株和抗性株的结合能力。利用重叠PCR扩增、测定并分析对VP3有天然抗性的霍乱弧菌野生株的wav基因簇的序列。结果VP3的gp44与T7噬菌体尾丝蛋白gp17的同源性高。表达的重组蛋白His-gp44与大肠杆菌不能结合,与VP3敏感株和天然抗性株结合,敏感株的核心寡糖基因簇(wav)基因缺失后不能结合。能与His-gp44结合的敏感株和抗性株,其wav基因簇序列只有一个碱基的差异。结论VP3的gp44是尾丝蛋白,能与霍乱弧菌表面受体特异性结合。

4株霍乱弧菌非产毒株溶源性噬菌体pre-CTXΦ的基因组结构分析

霍乱弧菌溶源性噬菌体CTXΦ携带霍乱毒素基因ctxAB,通过其结构基因gⅢ编码产生的PⅢ蛋白识别霍乱弧菌毒素共调菌毛(toxin co-regulated pilus,TCP)的主要结构亚单位TcpA,从而感染具有TCP的霍乱弧菌,使之成为产毒菌株。CTXΦ还有不携带ctxAB的前体pre-CTXΦ,根据CTXΦ基因组中调控基因rstR序列型不同,可分成不同的型别。在不同霍乱弧菌菌株的基因组中,已发现CTXΦ/pre-CTXΦ基因组及其亚型的多种组合排列方式。研究该噬菌体家族的基因组多样性,能够分析其进化及在霍乱弧菌产毒株形成中的作用。本研究发现了4株O1和O139群霍乱弧菌非产毒株具有pre-CTXΦ基因组及多样的rstR序列型,进一步对pre-CTXΦ在4株菌株中的基因组特征进行了分析。利用第3代基因测序法(短读长测序技术和单分子长读长测序技术),获得了4株菌株的基因组序列。利用长读长测序和拼接分析,精确地获得了具有长片段重复序列结构的pre-CTXΦ基因组排列,明确了4株测序菌株中多样的pre-CTXΦ基因组排列。在非产毒株基因组菌株VC3193中发现了携带古典型pre-CTXΦ;还在菌株VC702的pre-CTXΦ基因组中首次发现了肺炎克雷白菌的转座子结构(Gen Bank序列号:SRIL00000000)。在这4株测序菌株中,受体TcpA以及pre-CTXΦ的PⅢ蛋白也具有明显差异的序列,有TcpA和PⅢ新序列型,这提示了CTXΦ家族感染宿主菌的受体-配体相互识别的复杂对应关系。本研究丰富了对CTXΦ/pre-CTXΦ家族基因组及其整合排列的多样化认识,也为分析该溶源性噬菌体在不同遗传特征霍乱弧菌菌株间的水平转移和促使新产毒克隆形成方面提供了更多的证据。

霍乱弧菌噬菌体VP2基因组序列的测定与分析

测定并分析了霍乱弧菌噬菌体VP2基因组序列,为VP2生物学特性和功能研究提供分子遗传学基础。为此构建了VP2DNA随机文库,鸟枪法(shot gun)测定其全基因组序列。测序结果用软件Phrad Prap拼接成最小重叠群(contig),引物步移法测定contigs间的缝隙(gap)序列,拼接后获得VP2全基因组序列。利用生物信息学技术分析VP2基因组,最后对VP2和相关噬菌体做DNA聚合酶(DNApol)基因的进化树分析。结果:VP2属短尾噬菌体科,基因组全长39853bp,为环状双链DNA,G+C含量为50.56%,较高于霍乱弧菌测序菌株N16961基因组G+C含量;VP2的基因组有碱基使用偏性;预测和注释了45个开放读码框(ORF),分析了DNA复制基因、衣壳蛋白和DNA包装基因、侵染相关基因。DNApol进化树比较结果,VP2与链球菌噬菌体Cp 1和芽孢杆菌噬菌体GA 1分为一群。根据对VP2基因组序列的测定和分析预测了VP2的ORF,并分析了其中的功能基因,推测VP2在进化关系上属于噬菌体phi29样噬菌体。

霍乱弧菌噬菌体在消除海产品中相关弧菌的潜在应用研究

噬菌体具有裂解病菌的作用,可用作生物净化因子。本实验以霍乱弧菌为宿主菌,采用双层平板法从鲍鱼养殖环境中分离到5株霍乱弧菌噬菌体。以23株弧菌为宿主菌,本文研究了霍乱弧菌噬菌体对海产品中常见弧菌的裂解消除能力,同时针对宽裂解谱噬菌体进行包括热失活、pH稳定性、紫外照射、不同镁离子浓度、不同柠檬酸钠浓度等理化因素对其裂解能力的影响,以探索其裂解消除弧菌的最优条件。实验结果表明噬菌体在消除霍乱弧菌方面有潜在的应用价值,紫外照射、柠檬酸钠对噬菌体裂解有不同程度的抑制作用,温度和pH值对噬菌体裂解也有不同程度的影响,而适度的镁离子则有促进作用。

霍乱弧菌新类型溶源性噬菌体基因组结构研究

目的研究霍乱弧菌埃尔托型（EVC）新类型溶源性噬菌体（CTXφ）和核心区不含ctxAB基因的溶源性噬菌体（nct-CTXφ）基因组的结构。方法采用基因扩增、测序及序列生物信息学等方法进行观察与分析。结果在我国EVC中,存在仅携带古典型（class）nct-CTXφ、CTXφ或埃尔托型（ET）CTXφ基因组类型,并发现nct-CTXclassφ和CTXETφ共存、nct-CTXnewETφ和CTXclassφ共存的新类型。CTXφ和nct-CTXφ基因组zot基因3′末端,60bp序列中40%位点不同,推测的氨基酸序列中60%位点不同。class、ET和newET类型ig 1、rstR和ig 2基因序列同源性分别为77.0%~97.4%,10.4%~17.9%,9.6%~64.8%,RstR同源性9.2%~24.1%。CTXφ基因组均位于染色体TLC基因簇附近。上述不同类型EVC的tcpA、TcpA、ctxA、ctxB、CtxA和CtxB与GenBank中EVC和O139群产毒株的同源性分别〉99%,99%,99%,98%,98%和96%。结论首次在EVC中发现nct-CTXclassφ和CTXETφ、nct-CTX^newET φ和CTX^classφ共存的新类型。

霍乱弧菌分型噬菌体VP3蛋白的双向电泳分析

目的:噬菌体-生物分型方案具有区分霍乱弧菌潜在致病力的作用,VP3是5个霍乱弧菌分型噬菌体之一。对VP3成熟颗粒的蛋白组成进行测定和分析,以补充基因组注释信息。方法:在全基因组测序及生物信息学分析的基础上,利用双向电泳技术及质谱鉴定,对纯化的成熟VP3噬菌体的结构蛋白进行分离及鉴定。结果:双向电泳分离得到近20个蛋白点,质谱鉴定出了其中的10个,对应于4个VP3蛋白和4个霍乱弧菌蛋白。结论:VP3结构蛋白的组成和T7具有很高的相似性。与噬菌体颗粒一起被纯化分离的宿主蛋白可能在VP3的转染过程中起作用。

霍乱弧菌含编码霍乱毒素基因的溶源性噬菌体转染检测

[目的 ]研究霍乱毒素基因 (ctx)在霍乱弧菌O1 群埃尔托型、古典型菌株和O1 39群菌株之间的传递现象 ,了解含编码霍乱毒素基因的溶源性噬菌体 (CTXΦ)在ctx基因转移中的作用。 [方法 ]从人工构建的供体菌中诱导出带有标记的CTXΦ并转染至受体菌 ,用PCR扩增和Southern杂交等方法检测受体菌、转染子及其质粒的目的基因片段。 [结果 ]从受体菌O395、569B(古典型 )和 80 0 71 (埃尔托型 )的转染子中均检出带有供体菌标记的质粒 ,PCR和Southern杂交结果表明这些质粒是CTXΦ的复制形式。 [结论

以报告基因分析霍乱弧菌噬菌体VP1的预测启动子

VP1为感染并裂解霍乱弧菌的噬菌体,全基因组为环状双链DNA。通过测定该基因组序列,预测出15个可能的启动子区,利用报告基因质粒转化及全噬菌体共感染的策略分析了这些推测启动子在霍乱弧菌中的活性,将预测的启动子区分别克隆到启动子探测lacZ融合质粒载体pRS1274,在转化于大肠埃希氏菌受体菌株JM109中时,所有克隆子均呈现兰斑。同时将质粒电击到缺失了lacZ基因的霍乱弧菌菌株7743△Z,然后用噬菌体VP1感染转化菌株。在转化成功的13个含预测启动子片段的重组质粒中,通过检测β_半乳糖苷酶活性表达随感染后时间的变化,提示P17为早期启动子,P2、P3、P9等为中期启动子,P18为晚期启动子。

霍乱弧菌分型噬菌体VP3基因组序列的测定与分析

测定和分析霍乱弧菌分型噬菌体VP3基因组序列,并为ElTor型霍乱弧菌两类菌株的分型方法原理提供研究基础。鸟枪法构建VP3噬菌体全基因组随机文库;测序拼接成最小重叠群,引物步移法填补缝隙序列,拼接后获得VP3全基因组序列。PCR随机扩增噬菌体DNA片段并酶切鉴定;预测可能存在的开放读码框(ORF);对VP3和相关噬菌体的DNA聚合酶基因作进化树分析,协助判定VP3的分类;对预测的部分启动子区利用报道基因进行活性分析。VP3全基因组为环状双链DNA,长度39504bp;酶切鉴定结果与序列一致。确定了49个ORF,注释了27个ORF的编码产物,其中有20个基因产物与T7样噬菌体同源,包括RNA聚合酶(RNAP)、参与DNA复制的蛋白、衣壳蛋白、尾管及尾丝蛋白、DNA包装蛋白等。DNA聚合酶(DNAP)进化树分析表明VP3与T7样噬菌体有同源性。将预测的10个启动子序列克隆到lacZ融合质粒pRS1274上,经检测均具有启动子活性。测定和分析VP3的基因组序列,基因组结构与进化树分析提示VP3属于T7噬菌体家族。

非O_1群霍乱弧菌噬菌体-生物学分型

目的：了解用霍乱弧菌噬菌体和溶血性等4项生物学试验对非O1群霍乱弧菌进行噬菌体-生物学分型实际应用意义。方法：用VP1-VP55组弧菌噬菌体对非O1群霍乱弧菌进行噬菌体分型；用溶源性噬菌体敏感试验、溶源性测定、山梨醇发酵和溶血试验对非O1群霍乱弧菌进行生物学分型。结果：236株非O1群霍乱弧菌中能被5组O1群霍乱弧菌噬菌体分型的62株，总分型率为26．3％，其中腹泻病人52株，从业人员10株，分型率分别为22．0％和9．3％，分属于11个噬菌体型，腹泻病人以21、26噬菌体型居多，从业人员无优势型别，对5组O1群霍乱弧菌体均不敏感的174株；62株非O1群霍乱弧菌分属于e、f、k、l等4个生物型，23个噬菌体-生物型在8-31型之间，均属非流行株范畴；对第Ⅳ组噬菌体（10^9／ml）及其常规稀释噬菌体和溶原性噬菌体、溶源性表现为不裂解。结论：非O1群霍乱弧菌进行噬菌体分型，对预测非O1群霍乱弧菌流行具有一定的实用和指导性意义。现成的噬菌体分型方法对非O1群霍乱弧菌进行噬菌体分型存在一定的缺陷，应寻找更适宜于非O1群霍乱弧菌分型的噬菌体用于实际应用。

湖南省90年代O_1群埃尔托霍乱弧菌药物敏感性分析

目的 了解分析湖南省 90年代 O1 群埃尔托霍乱弧菌对药物的敏感性。 方法 药敏试验采用 K- B法。结果 90年代湖南省 O1 群 EVC对氟哌酸、强力霉素、氨苄青霉素、新霉素、庆大霉素、卡那霉素均高度敏感且较稳定。对四环素、复方新诺明、痢特灵总的敏感度较低。近 3年来耐药模式非常集中 ,主要为复方新诺明 +痢特灵 +四环素及对复方新诺明的单耐。 结论 氟哌酸等可为我省霍乱抗菌治疗的首选药物 ,而四环素不宜首选应用 ,复方新诺明。

不同来源RNA聚合酶对霍乱弧菌分型噬菌体VP3启动子的作用

目的:研究不同来源的RNA聚合酶对预测的霍乱弧菌分型噬菌体VP3启动子的作用。方法:以含有预测的VP3启动子区的片段取代质粒pRL-null的T7启动子区,以海肾萤光素酶基因Rluc为报告基因,在霍乱弧菌N16961内检测霍乱弧菌RNA聚合酶对克隆的启动子区的作用;将上述重组质粒和表达VP3 RNA聚合酶的质粒共转化大肠杆菌JM109,检测大肠杆菌和VP3的RNA聚合酶对克隆的启动子区的作用。结果:N16961的RNA聚合酶不能识别并作用于启动子P1、P2、P5、P6、P10和P12,JM109的RNA聚合酶可能识别并作用于启动子P7和P11;只有P2、P7、P8、P9、P13、P16和P17在JM109内可以被克隆表达的VP3 RNA聚合酶识别转录。结论:宿主菌N16961与非宿主菌JM109的RNA聚合酶识别转录VP3启动子的能力不同,可能与噬菌体的宿主特异性有关;VP3的RNA聚合酶对大部分有活性的VP3启动子具有直接启动转录作用,但部分启动子可能需要VP3或宿主蛋白的辅助作用才能表现出更强的活性;VP3启动子对VP3 RNA聚合酶的特异性也不同,P1、P2和P12对VP3的RNA聚合酶具有高度特异性,P7和P11的特异性较弱。

埃尔托霍乱弧菌感染棘阿米巴原虫的实验研究

目的探讨埃尔托霍乱弧菌能否在棘阿米巴原虫内生存繁殖,并观察棘阿米巴原虫对埃尔托霍乱弧菌存活的影响。方法采用埃尔托霍乱弧菌与棘阿米巴共培养的方法,通过倒置显微镜和电镜切片观察霍乱弧菌在阿米巴滋养体内的生长情况。结果共培养8h后可见埃尔托霍乱弧菌已进入棘阿米巴滋养体的细胞质中。随着共培养时间的延长,吉曼尼兹染色下可见埃尔托霍乱弧菌在棘阿米巴滋养体的空泡中的数量增多。共培养液经成囊培养待95%棘阿米巴转化为包囊后,使用盐酸处理的包囊传代实验能再分离培养出埃尔托霍乱弧菌。与棘阿米巴共培养的霍乱弧菌的活菌数在15d内维持在(1.02～9.77)106CFU/mL;而单独培养的埃尔托霍乱弧菌的活菌数量2d后下降了3个数量级,在后续13d内基本保持(1.40～3.07)×103CFU/mL;对每一时间段两者作t检验比较,差异在统计学上都有显著性意义(P<0.01)。结论埃尔托霍乱弧菌能在棘阿米巴的滋养体和包囊内生存繁殖,棘阿米巴能提高埃尔托霍乱弧菌的存活数量。

O139霍乱弧菌噬菌体的分离

为了探索O139霍乱弧菌分型技术 ,对江苏省临床患者的O139霍乱弧菌施行噬菌体分离 ,得到 3株噬菌体 ,命名为JSФ5、JSФ9、JSФ10。在O139菌株的裂解实验中 ,上述菌株被裂解的 (复愈株 )占82 .2 % ,不被裂解的 (溶源株 )占 6 .7% ,非溶复株占 11.1% ,这一现象相同于“kappa”噬菌体把ElTor霍乱弧菌裂解为溶源株、复愈株和非溶复株。用JSФ5裂解JSN14得到菌株JSN14 (JSФ5 /JSN14 )。它对JSФ5、JSФ9、JSФ10和它自己的过夜培养物不裂解 ,显示JSФ5是溶源性噬菌体 ;JSФ5、JSФ9、JSФ10对江苏省O139霍乱弧菌的裂解谱相同 ,表明这

辽宁省1980—1996年埃尔托霍乱弧菌染色体DNA酶谱分析

辽宁省１９８０—１９９６年埃尔托霍乱弧菌染色体ＤＮＡ酶谱分析姚文清刘彩莲①赵汉良姜伟辽宁省卫生防疫站（１１０００５沈阳）探索霍乱流行病学规律，了解霍乱弧菌本身的构成及变异在流行规律中的作用，已为很多学者所重视。分子流行病学是近十年来发展起来的一种新的...