枯草芽孢杆菌培养上清液对绵羊瘤胃上皮细胞β-防御素-1表达的影响

[目的]探究枯草芽孢杆菌培养上清液对绵羊瘤胃上皮细胞(ovine ruminal epithelial cells,ORECs)中绵羊β-防御素-1(sheepβ-defesin-1,SBD-1)表达的影响。[方法]采用Cell Counting kit-8(CCK-8)方法筛选对ORECs无明显毒性作用的枯草芽孢杆菌培养上清液刺激浓度范围与刺激时间范围。用筛选出的无明显毒性作用的不同浓度枯草芽孢杆菌对应的培养上清液刺激ORECs 8 h后,采用荧光定量PCR(qPCR)技术和酶联免疫吸附(ELISA)检测方法筛选枯草芽孢杆菌培养上清液诱导SBD-1表达的最佳刺激浓度,以该浓度枯草芽孢杆菌对应的培养上清液刺激ORECs不同时间,采用qPCR技术和ELISA检测方法确定枯草芽孢杆菌培养上清液诱导SBD-1表达的最佳刺激时间。[结果]①对ORECs无明显毒性作用的枯草芽孢杆菌对应的培养上清液浓度范围为10^(7)~10^(11) CFU/mL,刺激时间范围为2~24 h。②利用qPCR技术和ELISA检测方法筛选出最佳刺激浓度为10^(11) CFU/mL枯草芽孢杆菌对应的培养上清液。③以该浓度枯草芽孢杆菌对应的培养上清液刺激ORECs不同时间,采用qPCR技术和ELISA检测方法确定枯草芽孢杆菌培养上清液诱导SBD-1表达的最佳刺激时间为24 h。[结论]枯草芽孢杆菌培养上清液可以诱导ORECs SBD-1的表达。

嗜酸性乳杆菌培养上清液对抗生素相关性腹泻小鼠肠道菌群的影响

目的：研究嗜酸性乳杆菌LA14菌株耗尽培养上清液（spent culture supernatant，SCS）对抗生素相关性腹泻小鼠肠道菌群的影响．方法：小鼠60只，随机分为正常组、模型组、SCS组、活菌组、SCS＋活菌组及自然恢复组（每组n=10）．采用ip氨苄青霉素2000mg／（kg·d），连续3d造成肠道菌群失调性腹泻动物模型．正常组和模型组小鼠于造模后即处死，取盲肠内容物进行肠道菌群分析.其余各组小鼠分别灌胃受试药物或生理盐水30mL／（kg·d）[含菌组中活菌数量为3×10^9CFU／（kg·d）】，3d后处死，取盲肠内容物进行肠道菌群分析．结果：小鼠ip氨苄青霉素造成肠道菌群失调，肠道内4种主导菌群的数量（1gCFU／L）明显改变，与正常组比较肠杆菌和肠球菌数量显著上升（10．13±0．10 vs 9．03±0．11，10．52±0．11 vs 9．11±0．09，P〈0．01），乳杆菌和双歧杆菌数量明显下降（10．51±0．07 vs 11．88±0．10，P〈0．01;10．38±0_31 vs 11．61±0．13，P〈0．05）．而灌胃给予SCS、活菌、SCS加活菌后，与自然恢复组比较肠道乳杆菌和双歧杆菌数量明显回升（乳杆菌：11．53±0．17 vs 9．74±0．37，P〈0．01：11．54±0．05，11．45±0．07 vs 9．74±0．37，P〈0．05：双歧杆菌：11．54±0．22，11．30±0．99 vs 9．51±0．52，P〈0．05：11．13±0．16 vs 9．51±0．52，P〈0．01），肠杆菌和肠球菌数量下降（肠杆菌：9．42±0．22，9．50±0．06，9．22±0．39 vs 9．97±0．61，P〈0．05；肠球菌：9．48±0．20，9．45±0．16，9．37±0．21 vs 9．89±0．43．P〈0．05）．结论：嗜酸性乳杆菌活菌和SCS均能调整抗生素相关性腹泻小鼠肠道菌群失调，对乳杆菌和双歧杆菌有显著扶持作用．

嗜酸性乳杆菌培养上清液对实验性腹泻的作用

目的研究嗜酸性乳杆菌LA14菌株耗尽培养上清液(spent culture supernatant,SCS)对小鼠实验性腹泻的影响。方法小鼠100只,随机分为10组。采用小鼠灌胃给予80 g.L-1的番泻叶水煎剂(25 mL.kg-1)或蓖麻油(15 mL.kg-1),造成小鼠实验性腹泻动物模型,造模前分别以SCS、活菌、SCS+活菌25 mL.kg-1.次-1给小鼠灌胃,以及思密达冲剂3 g.kg-1.次-1给小鼠灌胃,每天2次,连续3 d。造模后连续观察6 h内小鼠腹泻累积次数、腹泻发生率和稀便率。结果在SCS组、活菌组以及SCS+活菌组,两种实验性腹泻小鼠的稀便率均有降低,与模型组比较差异显著(P<0.05或P<0.01),同时各时间点腹泻累积次数也有所下降,与模型组比较差异显著(P<0.05或P<0.01)。结论嗜酸性乳杆菌SCS和活菌均有一定的抗小鼠实验性腹泻的作用。

测定细胞培养上清液中亚硝酸盐的荧光分光光度法

目的 :建立检测细胞培养上清液中亚硝酸盐的方法。方法 :以 2 ,3 -二氨基萘与亚硝酸盐反应生成荧光产物 2 ,3 -二氨基萘三唑或 1-[H] -萘三唑 ,用荧光分光光度法测定。结果 :2 ,3 -二氨基萘浓度为 0 63mmol·L- 1,反应液和终止反应后pH值各为 2 0 0和 12 10 ,2 0℃水浴 15min是较适测定条件。本法的检出限为 61 3 4nmol·L- 1,日内和日间变异系数分别小于 3 %和 5% ,加入NaNO2 0 3 6、1 45、2 54nmol的回收率各为 99 12 %±4 64%、10 3 2 8%± 2 68%、10 5 14 %± 4 3 6%。测定大鼠腹腔巨噬细胞、大鼠胎鼠大脑半球神经细胞培养上清液亚硝酸盐含量分别为 ( 10 9 95± 4 57) μmol·L- 1和 ( 6 52± 1 57) μmol·L- 1,后者的 95%分布范围为 3 44-9 60 μmol·L- 1。核磁共振氢谱显示标准品化学位移δ7 3 3 0 2 7ppm和细胞培养上清液化学位移δ7 3 3 0 2 3ppm。结论 :本法特异、敏感、快速、简便 。

外用脂肪干细胞培养上清液对二氧化碳点阵激光焕肤术后伤口愈合的影响

目的探讨局部外用脂肪干细胞培养上清液在二氧化碳点阵激光焕肤术后伤口愈合过程中的作用。方法 9名受试者的双侧前臂内侧分别接受二氧化碳点阵激光治疗。随机选择受试者一侧前臂激光治疗处外敷脂肪干细胞培养上清液,另一侧则外敷DMEM细胞培养基。分别在上述处理后第1,4,7,14,21天检测受试部位经皮水分丢失、皮肤颜色及皮肤弹性。结果经过局部外用脂肪干细胞培养上清液一侧的红斑指数、黑色素指数和经皮水分丢失均显著低于对照侧。而皮肤弹性与对照侧差异无统计学意义。结论局部应用脂肪干细胞培养上清液是促进二氧化碳点阵激光焕肤术后伤口愈合和减少不良影响的一种有效方法。

炭疽杆菌培养上清液抗原的制备及免疫保护效果测定

目的制备炭疽培养上清液抗原并对其免疫效果进行测定。方法将炭疽A16r菌种接种于培养基中培养,收集无菌滤液,并进行超滤浓缩,经Al(OH)3佐剂吸附后,皮下免疫Balb/c小鼠,用炭疽Vollum(s)强毒株腹腔攻击测定其免疫效力。结果制备出具有高保护性的上清液抗原,9 h产物对Balb/c小鼠免疫效果良好(94.4%)。结论本研究为进一步研究炭疽疫苗免疫保护机制和炭疽疫苗改进研究打下基础。

链球菌抗原刺激的银屑病外周血单个核细胞培养上清液对角质形成细胞的作用

目的了解链球菌抗原刺激的银屑病外周血单个核细胞(PBMCs)培养上清液对角质形成细胞的作用以探讨链球菌感染后的银屑病的发病机制。方法3H-TdR掺入法检测PBMCs培养上清液对角质形成细胞DNA合成的影响;免疫组织化学方法检测细胞间黏附因子1(ICAM-1)和人类白细胞抗原DR分子(HLA-DR)表达。结果银屑病患者链球菌抗原刺激的PBMCs培养上清液对角质形成细胞的促增殖作用较对照组显著增强,并能诱导角质形成细胞表达HLA-DR和ICAM-1分子。结论受链球菌抗原刺激的银屑病PBMCs培养上清液可促进角质形成细胞增殖和活化,可能是链球菌感染之后银屑病发病的重要原因。

成骨细胞培养上清液对大鼠糖皮质激素性骨质疏松症的治疗作用

目的:研究成骨细胞培养上清液对糖皮质激素性骨质疏松症的治疗作用。方法:36只糖皮质激素性骨质疏松症大鼠随机分为成骨细胞培养上清液组(A组)、原始培养液组(B组)和对照组(C组),每组12只。A组每周2次肌肉注射成骨细胞培养上清液,每次0.5ml/kg;B组每周2次肌肉注射原始培养液0.5ml/kg;C组每周2次肌肉注射生理盐水,每次0.5ml/kg。8周后对各组大鼠的第3腰椎行骨密度测量及左股骨组织形态计量学分析。结果:A组第3腰椎骨密度值明显高于B组(P<0.01)和C组(P<0.01),B组和C组之间无显著性差异(P>0.05)。左股骨组织形态计量学分析结果显示:A组的骨体积、类骨质表面、类骨质宽度和成骨表面均比B组(P<0.01)和C组显著增高(P<0.01)。骨吸收表面三者之间无显著性差异(P>0.05)。结论:成骨细胞培养上清液可有效治疗糖皮质激素性骨质疏松症。

肺腺癌A549细胞培养上清液对人单核细胞衍生树突状细胞的影响

目的 :观察肺腺癌A5 4 9细胞培养上清液 (TSN)对人单核细胞衍生树突状细胞 (MoDC)的表型、增殖和抗肿瘤A5 4 9免疫应答的影响。方法 :制备人肺腺癌A5 4 9细胞的TSN、灭活TSN和冻融抗原 ;人MoDC培养按照不同培养条件组合分为 7组 ,分别于培养全程或晚期 (第 7d)加入TSN或第 4d加入冻融抗原冲击致敏 ,制备MoDC瘤苗 ,第 9d收获细胞。检测各组MoDC表型、MoDC凋亡率、体外混合淋巴细胞反应 (MLR)、MoDC诱导的细胞毒性T细胞 (CTL)抑瘤活性、培养上清液中IL 12含量。结果 :培养全程加TSN的MoDC ,相对特异性表型CD80、CD83和人类白细胞抗原 (HLA DR)明显下调 ,凋亡率明显升高 ,同时 ,激活T细胞增殖能力、诱导CTL抑瘤活性及分泌IL 12的量均显著低于正常培养组 ;培养晚期加TSN的MoDC及培养全程加入灭活TSN的MoDC ,均无上述影响 ;脱离TSN影响、体外正常制备的MoDC瘤苗 ,表型明显上调、各项免疫指标明显升高 ,诱导出了高效的抗A5 4 9免疫应答。结论 :TSN能干扰MoDC成熟过程 ,下调其表型表达 ,诱导其凋亡发生 ,抑制其介导的抗肿瘤免疫应答 ;而脱离TSN影响。

嗜酸乳杆菌耗尽培养上清液对兔离体肠平滑肌收缩的影响

目的:观察嗜酸乳杆菌LA14菌株耗尽培养上清液(spent culture supernatant,SCS)对兔离体肠平滑肌收缩的影响,并初步探讨其作用机制。方法:制备兔离体回肠标本,分别记录肠平滑肌的正常收缩频率和幅度作为给药前对照,然后按累积剂量分别加入嗜酸乳杆菌SCS、活菌菌液、SCS+活菌菌液。每次给药0.3ml,给药间隔6min,在每次给药4min后开始描记收缩曲线,记录时间2min。观察嗜酸乳杆菌各治疗组对离体肠平滑肌收缩的作用。另取肠段按毛果芸香碱、阿托品或SCS、再毛果芸香碱的顺序给药,观察嗜酸乳杆菌SCS对M型胆碱受体的作用。结果:按累积剂量连续给予SCS或SCS+活菌菌液0.6～1.5ml后,兔离体肠平滑肌收缩频率明显降低,与给药前比较差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01),其余各点与给药前比较均无统计学差异。SCS、活菌菌液、SCS+活菌菌液在0.3～1.5ml剂量范围内,仅SCS+活菌菌液在给药达1.5ml时,兔离体肠平滑肌收缩幅度的降低与给药前比较有统计学差异(P<0.05),其余各点均无统计学差异。SCS或阿托品可明显对抗毛果芸香碱引起的兔离体肠平滑肌收缩幅度的增加(P<0.05或P<0.01),SCS还能使兔离体肠平滑肌收缩频率明显减少(P<0.01)。结论:嗜酸乳杆菌SCS可能通过阻断M型胆碱受体抑制兔离体肠平滑肌蠕动。

应用蛋白质L检测和纯化培养上清液中的单链抗体

目的 探索一种检测和纯化单链抗体的新方法。方法 使用不同的酶标记物 ,观察ELISA法检测培养上清液中单链抗体的相对灵敏度。含单链抗体的培养上清液经超滤、313g L饱和硫酸铵沉淀及蛋白质L 琼脂糖亲和层析纯化单链抗体。结果 HRP标记蛋白质L可检测到 1∶16孔的阳性结果 ,而HRP标记蛋白质A仅检测到 1∶2孔的阳性结果。用 9E10单抗检测培养上清液中的单链抗体时 ,除加入未经稀释培养上清液孔略有显色外 ,其他加入稀释后的培养上清液孔均不显色。蛋白质L亲和层析纯化的单链抗体经SDS PAGE及ELISA鉴定 ,所得到的单链抗体纯度高、活性保持良好。结论 蛋白质L是一种能灵敏检测和有效纯化单链抗体的结合物 ,本实验建立的方法是一种有效。

不同激活状态的巨噬细胞培养上清液对7721肝癌细胞增殖和迁移的影响

目的研究不同激活状态的巨噬细胞培养上清液对7721肝癌细胞株(SMMC7721)增殖和迁移的影响。方法人类单核白血病细胞(THP-1)经佛波酯(PMA)诱导成为巨噬细胞(UaM),再分别采用脂多糖(LPS)诱导成为经典活化的巨噬细胞(M1),白细胞介素(IL-4+IL-13)诱导成为替代性活化的巨噬细胞(M2);用ELISA法检测其IL-10和IL-12的表达水平,定量PCR法检测TNF-α、CCL3、iNOS、AMAC-1、CCL22和Arg-1的表达;用CCK8法和Transwell试验检测UaM、M1和M2培养上清液对SMMC7721增殖和迁移的影响。结果 M1诱导组IL-12、TNF-α、CCL3和iNOS表达升高,M2诱导组IL-10、AMAC-1、CCL22和Arg-1表达升高。M1诱导组SMMC7721细胞增殖活力均明显低于UaM组和M2组(F=12.135,P<0.01);UaM和M2诱导组SMMC7721细胞的增殖活力在浓度比为1∶1时无统计学差异(F=5.356,P=0.293),在其他浓度组均存在统计学差异(P<0.01);SMMC7721在各组间穿过Transwell基底膜的细胞数量均存在差异(F=105.442,P<0.01)。结论 M1培养上清液能抑制SMMC7721的增殖和迁移,M2培养上清液能促进SMMC7721的增殖和迁移。

变形链球菌细胞表面及培养上清液中抗原提取的比较

对变形链球菌中的远源链球菌(S·Sobrinus)的菌细胞表面抗原及培养上清液中抗原的提取在质与量上进行了比较。结果显示,二者的中抗原总浓度相近似,SDS—PAGE 中的高、低分子量的蛋白条带均处于同一水平位置。故认为二者均为提取抗原的重要来源,但利用菌细胞表面提取抗原则更具有省时、省力、节约经费之优点。

骨髓间质干细胞培养上清液调控肝细胞的体外研究

目的探讨骨髓间质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSC)培养上清液对肝细胞增殖、凋亡的影响,初步探讨BMSC治疗肝纤维化的旁分泌机制。方法采用密度梯度离心及贴壁细胞分离相结合提取BMSC。培养48h的BMSC细胞培养上清液按BMSC不同处理(培养)时间和含量两种方法建组。不同处理时间建组:取培养48hBMSC上清液处理肝细胞(完全培养),分为处理24h、48h、72h组,对照组为1640培养基处理24h的肝细胞。不同含量BMSC建组:实验1组为完全BMSC培养上清液(含肝细胞的6孔板中每孔加入BMSC上清液2ml)处理肝细胞;实验2组为部分BMSC培养上清液(每孔加BMSC上清液1ml+1640培养基1ml)处理肝细胞;对照组为完全细胞培养基(每孔加1640培养基2ml)处理肝细胞。用酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒检测BMSC旁分泌肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)情况及培养时间对其的影响;用流式细胞仪观察肝细胞细胞分期和检测凋亡细胞数;用蛋白免疫印迹法(Western-blot)检测样本上清液中白蛋白的表达。结果 BMSC分泌HGF,其含量变化具有时间依赖性。加入BMSC培养上清液后,与对照组相比,实验1组中的培养上清液可以明显促进肝细胞增殖、抑制其凋亡,并随着处理时间的延长而增加(处理72h>处理48h>处理24h,均为P<0.05);实验组(1组、2组)的白蛋白分泌较对照组上调,且随着处理时间的延长白蛋白含量增加。结论 BMSC有可能通过分泌HGF促进肝细胞增殖、抑制凋亡,促进白蛋白分泌,从而抑制肝脏纤维化。

胚胎培养上清液中可溶性HLA-G表达与胚胎发育潜能的关系

为了减少产妇及后代的病死率,全世界都在努力控制体外受精（IVF）或卵胞浆内单精子注射（ICSI）后的多胎出生,据最近的辅助生殖协会统计,辅助生殖技术（ART）出生胎儿中49%是多胎分娩[1]。国内彭献东等[2]2007年报道其中心IVF/ICSI周期双胎、三胎和四胎的发生率分别为26.32%、4.43%和0.34%。多胎妊娠对母婴健康不利,在不降低妊娠率的情况下选择单一胚胎进行移植,可有效避免多胎妊娠的发生,因此如何选择具有着床及继续妊娠能力的胚胎已成为辅助生殖工作中至关重要的问题。

骨髓间充质干细胞培养上清液治疗支气管哮喘及对肺部炎症的影响

背景:医学界普遍认为支气管哮喘是一种与Th2相关的免疫反应疾病,目前尚缺乏理想的治疗方法。骨髓间充质干细胞作为一种成体干细胞,不仅具有增殖和多向分化能力,还具有低免疫原性和免疫调节能力。目的:探讨骨髓间充质干细胞培养上清液对支气管哮喘小鼠肺部炎症的影响。方法:将20只实验小鼠随机分为对照组和实验组,每组10只,在第0天及第14天小鼠腹腔注射卵清蛋白溶液致敏,并在第24-26天雾化吸入卵清蛋白溶液激发。实验组从第24天开始,在每次激发前2 h,腹腔注射制备好的骨髓间充质干细胞培养上清液2 m L,对照组腹腔注射生理盐水。末次激发后麻醉致小鼠安乐死亡,采取血清、肺泡灌洗液及肺脏组织进行研究。结果与结论:1对照组小鼠肺组织结构发生异常,黏膜下层和肌层内能够看见大量嗜酸性粒细胞及单核细胞浸润,经骨髓间充质干细胞培养液治疗后,实验组小鼠肺部炎症较轻。2实验组白细胞总数、嗜酸性粒细胞数、嗜酸性粒细胞百分比显著低于对照组(P<0.01)。3实验组肺泡灌洗液以及血清中白细胞介素17水平显著低于对照组(P<0.05);肺泡灌洗液以及血清中白细胞介素4水平与对照组比较差异无显著性意义(P>0.05)。上述结果提示支气管哮喘小鼠腹腔注入骨髓间充质干细胞培养上清液能够减轻肺部炎性病理反应严重程度,降低肺泡灌洗液以及血清中相关的炎症指标水平。

几种组织培养上清液对造血祖细胞体外增殖分化的比较

目的：寻求既经济又有效的造血生长因子样活性物质。方法：采用造血祖细胞体外培养与造血生长因子生物活性检测等实验血液学技术，检测胎肌培养上清液、骨髓基质细胞培养上清液、胸腺细胞培养上清液与脾细胞培养上清液对造血祖细胞CFU-GM、BFU-E和CFU-Mix增殖分化的影响。结果：胎肌培养上清液和对CFU-GM和CFU-Mix的体外增殖与分化有明显刺激作用，而胸腺与脾细胞条件培养上清液对BFU-E的生长有显著促进作用。结论：胎肌培养上清液中可能含GM-CSF样活性物质，而胸腺与脾细胞培养上清液具有较高IL-3样活性，可以利用组织与细胞培养上清液替代重组造血生长因子进行造血细胞的实验研究和临床诊断。

肝癌细胞H22培养上清液对鼠细胞L929细胞周期、CyclinD1、P27蛋白表达的影响

目的:探讨小鼠肝癌细胞H22培养上清液对鼠L929细胞细胞周期、CyclinD1、P27蛋白表达的影响。方法:采用肝癌细胞H22的培养上清液诱导正常成纤维细胞L929,诱导细胞为L929-H22。采用流式细胞术检测L929细胞与L929-H22细胞细胞周期分布,免疫细胞化学方法检测2种细胞中CyclinD1、P27蛋白的表达。结果:与L929相比,L929-H22G0/G1期细胞比例明显减少,S期细胞比例明显增加(P<0.05),增殖指数PI明显升高(P<0.05);CyclinD1的表达增强(P<0.05),P27的表达减弱(P<0.05)。结论:小鼠肝癌细胞培养上清液诱导的细胞CyclinDl、P27的表达及细胞周期分布与正常细胞不同,CyclinDl表达增强和P27表达减弱可能在细胞恶性转化过程中发挥作用。

HepG2．2．15细胞培养上清液中HBVDNA及其抗原的检测

乙型肝炎病毒（HBV）是一种引起急性和慢性坏死炎症性肝病及肝细胞癌的DNA病毒。HBV具有特异嗜肝性、非细胞损伤与裂解、易发展为慢性等特征。HepG2．2．15细胞是能够表达HBV抗原和分泌完整HBV颗粒的肝胚瘤细胞系，也是目前用来研究HBV复制．肝细胞对干扰素（IFN）应答最为合适的细胞模型系统。