视网膜下液对培养的人眼视网膜色素上皮细胞、成纤维细胞内Bcl-2蛋白表达的影响

目的 了解视网膜下液 (subretinal fluid,SRF)对培养的视网膜色素上皮 (retinal pigmentepithelium,RPE)细胞、成纤维细胞 (fibroblast,FB)内 Bcl- 2蛋白表达的影响。 方法 应用 Western-blotting技术及免疫组化技术分别检测视网膜下液 (subretinal fluid,SRF)作用于 RPE细胞、FB一定时间后细胞内 Bcl- 2的表达水平。 结果 在 SRF作用 4h后两种细胞内 bcl- 2表达量与无血清培养基静息的对照组相比都有不同程度的增加 ;作用 36 h后 ,所有实验组和对照组细胞内 bcl- 2表达量都下降 ,但 SRF作用下的 RPE细胞和 FB内 bcl- 2水平的下降幅度较为明显 ,而对照组在实验观察期末细胞内 bcl- 2蛋白水平仍维持在较高的水平。 结论 实验早期 SRF具有促进 RPE细胞、FB内 Bcl- 2表达的作用 ,但作用一定时间后加速细胞内 bcl-

增强ESAT6-CFP10融合蛋白诱导小鼠细胞免疫应答佐剂的筛选

目的筛选能增强特异性抗原早期分泌抗原靶6蛋白(Early secretory antigenic target 6,ESAT6)-培养滤出液蛋白-10(Culture filtrate protein 10,CFP-10)融合蛋白(E1C0)诱导小鼠细胞免疫应答的佐剂,建立基于细胞免疫应答的小鼠模型,以评价基于体外干扰素γ释放分析(IFNγrelease assay,IGRA)结核诊断方法中特异性刺激抗原E1C0的活性。方法建立小鼠IFNγ双抗体夹心SABC-ELISA检测系统,并验证系统的线性、灵敏度、重复性和特异性。将BALB/c小鼠随机分为7组:E1C0+单磷酸类脂A(Monophosphoryl lipid A,MPL)+双十八烷基二甲基溴化铵(Dimethyl dioctadecylammonium bromide,DDA)组、E1C0+DDA组、E1C0+MPL组、E1C0+弗氏不完全佐剂(IFA)组、E1C0组、生理盐水组和MPL+DDA联合组,每组6只,经小鼠后肢内侧皮下免疫3次,间隔2周,免疫剂量为:E1C0 100μg/只,MPL 25μg/只,DDA 250μg/只,IFA 100μl/只。末次免疫4周后处死小鼠,无菌取脾,分离脾淋巴细胞,加入E1C0进行培养,MTT法检测特异性淋巴细胞增殖反应,ELISA法检测培养上清中IFNγ水平。采用筛选出的最佳佐剂与抗原组合免疫3批BALB/c小鼠,进行IFNγ诱生测定。结果检测系统的线性范围为:40～2 560 pg/ml(R>0.98);灵敏度为40 pg/ml;变异系数(CV)<15%,检测大鼠、豚鼠和兔血清IFNγ均为阴性;E1C0+MPL+DDA组、E1C0+IFA组和E1C0+DDA组小鼠特异性淋巴细胞增殖刺激指数均明显高于生理盐水组(P<0.01);E1C0+MPL+DDA组小鼠的脾淋巴细胞经E1C0体外刺激后,产生的IFNγ水平明显高于其他组(P<0.001);重复试验结果显示,E1C0+MPL+DDA组3批小鼠免疫后,脾淋巴细胞诱生的IFNγ水平差异无统计学意义(P>0.05)。结论 E1C0与MPL和DDA联合免疫所诱导的小鼠Th1型细胞免疫应答最强,成功建立了用于评价刺激抗原E1C0活性的小鼠模型。

结核分枝杆菌模拟抗原的筛选及初步应用

目的通过对早期分泌抗原-6(ESAT-6)及培养基滤过蛋白-10(CFP-10)肽库的结核分枝杆菌模拟抗原的筛选,旨在建立一个临床鉴别诊断结核分枝杆菌感染的新方法。方法基于蛋白ESAT-6和CFP-10的序列,随机设计合成一组19肽库,通过γ-干扰素释放试验筛选特异性结核分枝杆菌抗原模拟多肽,并研究确立其工作浓度。结果经过多轮筛选获得3条特异性模拟多肽,分别是P1MG、P8NV、P11LD,灵敏度分别为93.3%、90.0%、80.0%,特异性均>90.0%;工作浓度均为2μg/ml;将3种模拟多肽等浓度混合作为刺激原,初步临床验证试验表明,其灵敏度为95.3%,特异性为96.2%。结论基于蛋白ESAT-6和CFP-10的序列设计、筛选、制备的混合型模拟多肽抗原,有望建立一种临床结核分枝杆菌鉴别诊断的新方法。