基于iTRAQ蛋白质组学的OsAAP6不同转基因水稻胚乳差异蛋白筛选

【目的】基于iTRAQ蛋白质组学筛选不同OsAAP6转基因水稻胚乳的差异蛋白,明确胚乳中的差异蛋白,以期为后续利用OsAAP6基因提升稻米的营养品质提供理论依据。【方法】以水稻OsAAP6超量表达阳性[OX(+)]和阴性对照[OX(-)]材料及OsAAP6互补表达阳性[ZpZc(+)]和阴性对照[ZpZc(-)]为试验材料,采用同位素标记相对与绝对定量(iTRAQ)技术对其进行蛋白质组学检测分析,并利用考马斯亮蓝G-250法对其胚乳中的4类储藏蛋白(谷蛋白、醇溶蛋白、清蛋白和球蛋白)进行含量检测。【结果】与ZpZc(-)和OX(-)转基因阴性对照相比,ZpZc(+)和OX(+)转基因阳性胚乳中OsAAP6基因的表达量分别在P<0.01和P<0.001水平极显著升高。与ZpZc(-)和OX(-)转基因阴性对照相比,ZpZc(+)和OX(+)转基因阳性水稻共有58种差异蛋白共同上调或下调表达,其中有39种蛋白显著增加(P<0.05,下同),有19种蛋白显著降低。在39种共同上调表达的蛋白中有27种蛋白参与水稻种子储藏底物的合成与积累,且有16种上调表达蛋白参与种子储藏蛋白的代谢和积累。与ZpZc(-)和OX(-)转基因阴性对照相比,ZpZc(+)和OX(+)转基因阳性水稻胚乳中的谷蛋白、醇溶蛋白、清蛋白和球蛋白含量均显著增加。【结论】OsAAP6基因上调表达,能抑制与支链淀粉合成相关蛋白的积累,但能促进其胚乳中储藏蛋白的积累,进而提高胚乳中谷蛋白、醇溶蛋白、清蛋白和球蛋白含量,可用于高蛋白水稻新品种的分子育种和遗传改良。

基于抗体的水稻蛋白质组学——开端与展望

为了深入开展水稻基因功能研究,借鉴人类蛋白质研究中的相关理念,提出了基于抗体的水稻蛋白质组学的策略.AbRP的要点在于,建立针对水稻蛋白质的抗体资源库,利用大规模免疫分析技术,揭示水稻蛋白质在不同时空条件下的表达状态并了解其相关功能.用AbRP策略可以对特定的基因家族或途径相关蛋白质进行研究,可以检测蛋白质的表达量及修饰的变化等.AbRP的实施将为水稻基础和应用研究创建一个重要的支撑平台,基于抗体的蛋白质表达数据与基因组、转录组数据相整合,可望进一步丰富水稻乃至其他植物研究的公共数据资源.

肉芽肿性乳腺炎病灶组织差异表达蛋白质筛选及关键分子验证

目的分析肉芽肿性小叶性乳腺炎(GLM)病灶组织中的差异表达蛋白质,筛选GLM的生物标志物,再根据结果对关键分子进行验证。方法采用TMT标记定量蛋白质组学方法,对GLM患者(3例)病灶与正常乳腺组织中蛋白质组进行鉴定和定量,筛选出发生显著变化的差异表达蛋白质,导入Proteome Discoverer软件中,搜索Uniprot数据库,完成生物信息学分析。采用细胞因子抗体芯片技术对筛选出的关键分子进行定量和验证。结果GLM病灶组织与正常乳腺组织筛选出差异表达蛋白质1405个,其中1106个表达上调,299个表达下调。GO富集分析显示,这些差异表达蛋白质主要参与细胞过程、代谢过程、蛋白质代谢、生物学调节等。KEGG通路分析发现,差异表达蛋白质参与补体活化、免疫调节、炎症反应等。细胞因子定量分析验证了GLM病灶组织中IL-1β、MCP2、IL-6表达升高。结论GLM病灶和正常乳腺组织中存在差异表达的蛋白质参与炎症、免疫等多种信号通路,可能是GLM发生发展的关键分子。特定蛋白质是值得进一步研究的生物标志物。

基于抗体的水稻蛋白质组学理论与实践

水稻是最重要的粮食作物之一,不仅是世界上一半以上的人口以水稻作为主粮,也是基础研究的模式植物。项目团队在前人研究的基础上,结合蛋白质研究的需求和发展趋势,凝练提出了“基于抗体的水稻蛋白质组学”概念,十多年来,不断优化技术路线,积极拓展和丰富相关理论并开展实践。1主要创新点1.1首次提出了“基于抗体的水稻蛋白质组学”概念。

利用蛋白质组学技术探究叶绿素含量对植物生长的影响

本研究基于蛋白质组学技术,结合主成分分析和偏最小二乘法判别分析等方法探究叶绿素含量对植物生长的影响。依次收集冷处理前、冷处理后和复性3个阶段的水稻幼苗叶片,测定叶绿素含量,同时进行蛋白质组学分析。将蛋白质组与叶绿素含量的变化结合进行差异蛋白质组学分析,通过通路分析富集出淀粉蔗糖代谢、糖酵解途径等7个代谢途径,筛选出与叶绿素含量强相关的近30种酶。通过探寻与叶绿素含量变化相关的代谢途径,从蛋白质组学角度证明叶绿素含量可以作为植物生长健康状况的重要指标。

红莲型水稻细胞质雄性不育花药蛋白质组学初步分析

采用固相pH梯度-SDS PAGE双向电泳对红莲型细胞质雄性不育水稻的不育系(YTA)和保持系(YTB)单核期花粉总蛋白质进行了分离,通过银染显色,获得了分辨率和重复性较好的双向电泳图谱。Image Master 2DV5.0软件可识别约1800个蛋白质点,其中差异表达的蛋白质点数为85。将其中16个差异点采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(matrix assisted laser desorption/ionizaton time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)进行了肽质指纹图分析,通过采用Mascot软件对MSDB数据库查询,其中9个蛋白质点得到了鉴定。YTA相对于YTB有部分参与碳代谢和淀粉合成的酶缺失或表达量降低,这些蛋白质分别是ADP-葡萄糖磷酸转移酶(AGPase),UDP-葡萄糖醛酸脱羧酶,乙酰辅酶A合成酶和二氢硫辛酸脱氢酶等。其中AGPase是参与淀粉合成的蛋白,与花粉发育密切相关。乙酰辅酶A合成酶和二氢硫辛酸脱氢酶是细胞内合成乙酰辅酶A的重要酶,而乙酰辅酶A是进入TCA循环的重要底物,乙酰辅酶A的缺乏可以导致TCA循环不能顺利进行,从而不能提供小孢子发育所需要的大量能量。YTA相对于YTB部分参与碳水化合物代谢的重要酶缺失或表达量降低,有可能导致因线粒体提供的能量不足,淀粉合成受阻,因而花粉不能正常发育。

孕穗期水稻不同功能叶的发育蛋白质组学分析

从蛋白质组学角度对杂交水稻汕优63孕穗期4个叶位功能叶片蛋白质组变化进行了研究,以揭示水稻孕穗期叶片蛋白质组的表达差异。4个不同时期功能叶片蛋白质经双向电泳得到分离,应用Imagemaster 2D Elite 5.0软件对所得到的双向电泳图谱进行分析比较,共得到差异表达蛋白质点23个,差异表达蛋白质点经质谱分析,有14个得到鉴定。对鉴定出的蛋白功能进行研究,结果表明:差异表达的蛋白质大部分(9个)为参与光合作用和呼吸作用的蛋白质;其次为与蛋白结构及功能调控相关的蛋白质(3个),表达量表现为随叶位上升而上调;其余为参与氨基酸代谢的蛋白质(2个),表达量在较低叶位叶片中无显著规律,在剑叶中的表达量显著上调。蛋白质是细胞功能执行者,受细胞功能或细胞环境变化的影响,因此,上述蛋白质发生变化的原因应与水稻不同叶位叶片生长发育特性有关。

水稻育秧肥的壮秧效应及其蛋白质组学分析

通过比较育秧肥和化肥作基肥的早稻秧苗质量的差异,及在这两种育秧条件下水稻叶片的蛋白质组表达差异,揭示了育秧肥的壮秧机理。结果表明,育秧肥具有促进秧苗分蘖和发根,使秧苗矮壮,提高秧苗叶绿素含量和光合生产能力,提高秧苗综合素质等作用。经双向电泳分离,获得了18个不同处理下发生差异表达的蛋白质。经质谱分析,其中16个蛋白质得到鉴定,包括9个参与光合作用的蛋白质,3个与蛋白质合成密切相关的蛋白质以及3个与抗性相关的蛋白质和1个未知功能蛋白质。

逆境胁迫下水稻蛋白质组学研究进展

水稻在生长发育过程中要面对各种非生物胁迫如干旱、高盐、温度、重金属和生物胁迫如病虫害等,通过观察水稻在各种胁迫条件下的蛋白质组表达情况,动态分析水稻的蛋白质组变化,对新逆境相关蛋白质进行分离与功能鉴定,这不仅能揭示参与胁迫耐受的蛋白质翻译后调控机制,而且可以增进对耐受胁迫分子机理的认识。综述了水稻应答逆境胁迫蛋白质组学研究的最新研究进展,探讨了存在的主要问题。

养分胁迫对籽粒灌浆期水稻叶片衰老影响的蛋白质组学分析

采用蛋白质组学分析技术,对养分胁迫下杂交水稻威优916功能叶片蛋白质组差异表达进行研究,以揭示养分胁迫影响籽粒灌浆期水稻衰老的分子机理。经双向电泳分离,从功能叶中获得34个差异表达蛋白质,其中26个蛋白质功能得到鉴定,包括11个参与光合作用蛋白质,4个参与呼吸作用蛋白质,10个参与抗氧化及信号传导蛋白质和1个未知功能蛋白质。分析结果表明,养分胁迫下,灌浆期水稻叶片光合作用及呼吸作用显著下降;清除活性氧类蛋白质表达量下调,活性氧生成蛋白质及胁迫信号传导蛋白质表达量上调,水稻抗性减弱,叶片中活性氧积累,水稻衰老加剧。

养分胁迫对水稻籽粒灌浆充实影响的蛋白质组学研究

以杂交早稻威优916为试验材料,采用水培方式栽培,生育后期设置养分胁迫和全营养液两种处理,从蛋白质组学角度研究后期持续的养分胁迫对水稻籽粒灌浆的影响,以期为水稻高产栽培提供科学依据。籽粒蛋白质经双向电泳分离后共获得了37个发生差异表达的蛋白质,经串联质谱分析(ESI-Q MS/MS),27个蛋白质功能得到鉴定,包括4个参与光合作用的蛋白质、13个与籽粒充实发育相关的蛋白质、9个逆境相关的蛋白质及1个呼吸代谢相关的蛋白质。分析结果表明,养分胁迫下,逆境相关蛋白质在籽粒灌浆的前中期大量上调表达,籽粒光合作用减弱,后期呼吸作用增强,籽粒的氮代谢受到显著影响,谷蛋白及胚蛋白表达相对滞后,蛋白质和脂肪合成减少,从而造成籽粒灌浆不足,产量降低。

引发提高水稻劣变种子发芽率的蛋白质组学分析

引发处理是目前简便有效的提升种子发芽率和整齐度的方法,但引发提高水稻劣变种子发芽能力的机理并不清楚。利用蛋白质组学方法,分析清水引发和藤茶提取物二氢杨梅素引发2种处理方法与对照的差异蛋白,初步揭示引发提升种子发芽能力的机制。分析双向电泳图谱差异获得2倍以上显著差异蛋白点79个,通过MALDI TOF/TOF MS质谱分析鉴定出74个蛋白,其中2种引发处理与未引发对照相比同步上调或下调的共有蛋白,即引发相关蛋白有57个。分析引发相关蛋白可知,绝大多数的逆境防御蛋白类、能量相关蛋白类以及蛋白质合成和目标类蛋白丰度在引发处理中显著增加,推测引发提高种子发芽率的原因与逆境记忆、能量代谢活动和蛋白质合成能力增强等密切相关。

苗期水稻叶片发育进程的差异蛋白质组学分析

【目的】从蛋白质组学角度对杂交水稻汕优63苗期的叶片蛋白质组变化进行研究,以揭示水稻苗期叶片蛋白质组的表达差异。【方法】蛋白质点经双向电泳得到分离,并采用Imagemaster 2D Elite5.0软件对所得到的双向电泳图谱进行分析比较。【结果】经图谱分析共得到差异蛋白质点41个,其中三叶期后新增蛋白质点17个,包括9个仅在三叶期出现特异的特异蛋白质点,13个蛋白质点表达丰度先逐渐增强随后减弱或在消失,其它11个蛋白质点中,自二叶期开始表达丰度呈现下降的蛋白质点有3个,保持上升的有6个,不规律出现的有2个;其中的15个蛋白质点经质谱分析得到鉴定。【结论】蛋白质是细胞功能执行者,受细胞功能或细胞环境变化的影响,因此,上述蛋白质发生变化的原因可能与水稻苗期分蘖发生有关系。

水稻品种“佳辐占”应答细菌性条斑病病原菌侵染的蛋白质组学分析

运用双向电泳分析高抗水稻品种“佳辐占”受强毒力细菌性条斑病病原菌侵染2d后的叶片蛋白质组变化,共发现38个蛋白质发生差异表达,其中32个上调,5个下调,1个新增。用MALDI-TOF-MS分析和数据库检索鉴定出其中的33个差异表达蛋白质,并将它们分为4个功能类群,即信号转导相关蛋白、防卫相关蛋白、代谢相关蛋白和蛋白质稳定相关蛋白。这些蛋白分别参与了信号识别、信号传递、抗氧化、糖代谢、细胞壁加固、植保素合成等抗病生理反应。研究表明,水稻对细菌性条斑病病原菌的侵染存在着一个复杂的抗病信号应答和代谢调控网络,其作用机理可以通过差异表达的蛋白质(酶)反映出来,其中差异表达的8个R蛋白和3个PR蛋白可能与水稻对细菌性条斑病的抗病性密切相关。本研究为进一步揭示水稻对细菌性条斑病的抗性机理及相关抗病基因的功能克隆提供了依据。

低叶绿素b水稻突变体类囊体膜的比较蛋白质组学

采用蓝绿温和胶凝胶电泳(blue-nativepolyacrylamidegel-electrophoresis,BN-PAGE),以及改进的第二向SDS-PAGE分离了水稻低叶绿素b突变体ZH249-Y和野生型ZH249-W类囊体膜蛋白复合物,系统比较了突变体和野生型各复合物亚基的表达差异.结果显示,第一向BN-PAGE分离了PSⅠ-LHCⅠ、LHCⅠ缺失的PSⅠ、ATP合成酶、细胞色素b6f、CP43缺失的PSⅡ及LHCⅡ六种复合物.上述各复合物经第二相SDS-Urea-PAGE分离后,利用胶内酶解,高效液相层析分离肽段,电喷雾串联质谱鉴定了复合物的亚基.结合免疫印迹研究,证明和野生型相比,突变体光系统Ⅱ捕光天线复合体的表达量适度下降,但光系统Ⅰ捕光天线破坏严重,同时光系统Ⅱ核心蛋白和ATP合成酶的表达量上升.研究结果对揭示低叶绿素b水稻突变体较高光化学效率和光稳定性的分子基础提供了线索,同时也表明,改进的BN/SDS-PAGE双向电泳不仅可以有效地分离膜蛋白复合物及亚基,也可以进行不同生理条件下,或野生型和突变体之间膜蛋白质组的比较研究.

温敏核不育系水稻株1S及其矮秆突变体SV14茎的蛋白质组学比较

采用双向凝胶电泳对温敏核不育水稻株1S和其矮秆突变体SV14的茎(穗颈下第1节和第2节)蛋白进行了分离,通过银染显色,获得了分辨率和重复性较好的双向电泳图谱.选取了26个蛋白质点采用MAL-DI-TOF-MS进行肽质谱指纹图分析,最终有12个蛋白质点得到了可靠鉴定.其中在SV14中相对于株1S上调的仅有OSJNBa0039C07.13蛋白,其它蛋白均表现为下调.这些差异蛋白按照功能可分为4类:(1)能量代谢相关蛋白;(2)次生代谢相关蛋白;(3)调控蛋白;(4)未知蛋白.对光合系统Ⅱ氧延伸复合物蛋白质前体2,果糖二磷酸醛缩酶,UDP-葡糖醛酸脱羧酶对应的基因进行了半定量RT-PCR分析,发现这几个基因与蛋白质的表达不一致,可能是RNA发生了翻译后修饰而减少了蛋白表达量的结果.这些差异蛋白很可能与水稻矮化有关,为水稻矮秆基因的寻找提供了另一个有效途径.

水稻矮化少蘖突变体dlt3的基因定位和蛋白质组学分析

【目的】株高是农作物的重要农艺性状之一。导致株高变矮的原因很多,最受关注的是赤霉素(GA)和油菜素内酯(BR)对株高的影响,其调控机制的阐明对于植物科学基础研究及遗传育种研究均具有重要意义。【方法】利用γ射线诱变水稻材料9311,获得一个矮化少蘖突变体,命名为dlt3 (dwarf and low-tillering 3),通过形态学调查手段分析dlt3突变体的株高、分蘖数、叶夹角、叶形态和结实率等性状,通过叶枕部位的伸直情况和α-淀粉酶活性检测分析其对外源BR和GA应答的敏感性,通过构建遗传群体和筛选分子标记对其进行基因定位,并利用基于i TRAQ的定量蛋白质组学技术分析dlt3突变体的蛋白质组表达谱。【结果】表型分析显示dlt3突变体具有半矮化、少分蘖、叶夹角减小、叶表面皱褶、叶形变短变宽和结实率降低等多个突变表型;突变体对GA正常应答,而对BR处理表现为不应答。遗传分析显示dlt3突变因单个基因隐性突变导致;利用分子标记将dlt3基因定位在第6染色体标记RM2615和R6M14之间。定量蛋白质组学分析在dlt3突变体中鉴定到330个差异表达蛋白,包括222个上调和108个下调表达蛋白。其中,4个差异表达蛋白与BR信号途径直接相关;多个差异表达蛋白与水稻株高或生长发育调控直接相关;此外,多个差异表达蛋白,如丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶、Ca^(2+)结合蛋白和锌指结构域蛋白等在dlt3突变体中大量富集。【结论】dlt3是一个BR不敏感的矮化少蘖突变体,DLT3基因突变引起BR信号途径的异常,进而可能导致胞内蛋白磷酸化信号转导和转录激活途径受到广泛影响,从而引起植株生长发育等多方面性状异常。

6-苄基腺嘌呤延缓水稻衰亡效应的蛋白质组学分析

以苗期杂交水稻威优916为试验材料,分别以蒸馏水和8 mg/L 6-苄基腺嘌呤溶液培养,通过对功能叶片蛋白质组差异表达分析,以揭示养分胁迫下6-苄基腺嘌呤延缓水稻衰亡的效应及其机理。叶片全蛋白质经双向电泳分离,获得了22个响应6-苄基腺嘌呤处理的蛋白质,经质谱分析,其中15个功能得到鉴定,涉及光合作用、呼吸作用、激素代谢及逆境反应等多个代谢途径。分析结果显示,养分胁迫下,6-BA诱导了叶片中光合蛋白质、呼吸代谢相关蛋白质的表达量上调,减少衰亡发生密切相关蛋白质的积累,从而提高叶片光合能力,促进呼吸,满足植株生长对物质及能量的需求,延缓植株衰亡。

养分胁迫对不易早衰类型水稻生育后期叶片影响的蛋白质组学分析

为揭示不易早衰水稻耐养分胁迫机理,应用蛋白质组学分析技术,对养分胁迫下不易早衰水稻隆平001生育后期叶片蛋白质组差异表达进行了研究。叶片蛋白质图谱经软件Imagemaster 2D Elite 5.0分析,有26个蛋白质发生差异表达,其中17个蛋白质功能经质谱分析(ESI-Q MS/MS)得到鉴定。差异表达蛋白质功能分析显示,养分胁迫下,隆平001叶片中光合及养分再利用相关蛋白质表达量增强,从而满足养分胁迫下植株生长发育的需要,是其具有较强抗养分胁迫的内在机理,而参与活性氧清除及逆境保护相关蛋白质表达量增强,可以保护光合机构免受胁迫伤害,从而对养分胁迫有更强的耐性、不易发生早衰。

差异蛋白质组学在水稻响应逆境胁迫中的应用

水稻逆境胁迫差异蛋白质组学是分析比较正常和逆境胁迫条件下的水稻样本的蛋白质组,找出特异表达的蛋白质并分析其功能,从而揭示水稻响应逆境胁迫的分子机理。对差异蛋白质组学概况进行了介绍,对水稻响应逆境胁迫(如干旱、高温、病虫害)的蛋白质组学的研究进展进行了详细的综述,指出了水稻逆境胁迫蛋白质组学研究的下一步工作是研究蛋白质翻译后修饰和蛋白质与信号分子之间相互作用,并强调将基因组学、蛋白质组学和转录组学等学科交叉结合起来进行研究来揭示水稻响应逆境胁迫的分子机理。