基于三引物荧光PCR-毛细管电泳法的FMR1基因突变检测技术建立及其在自闭症辅助诊断中的应用

目的对自闭症患者FMR1基因5′非编码区CGG重复序列及重复数进行检测,探索检测脆性X综合征的新方法。方法应用三引物荧光PCR-毛细管电泳法(Qseq100TM全自动核酸分析系统检测)对111例自闭症患者进行筛查,检测其FMR1基因5′非编码区CGG序列,计算CGG重复数,并与ABI 3500Dx基因分析仪毛细管电泳测序法进行结果比较验证。结果 111例临床检测为自闭症的样本中,有2例为FMR1前突变携带者,一例为中间型。与3500Dx毛细管电泳测序结果一致。结论三引物荧光PCR-毛细管电泳法能够用来检测FMR1基因5′非编码区CGG重复序列,在脆性X综合征发病机制及大规模携带者筛查方面都具有一定的应用价值。

艰难梭菌数字化PCR-核糖体基因分型方法的建立与应用

目的建立艰难梭菌数字化PCR-核糖体基因分型方法并用于临床菌株的基因分型。方法利用荧光毛细管电泳技术代替琼脂糖凝胶电泳检测艰难梭菌PCR-核糖体分型产物,建立数字化PCR-核糖体分型方法;利用40株分属于10种核糖体型(RT)的艰难梭菌参考菌株构建常见基因型的数字化参考图谱,利用71株艰难梭菌临床菌株初步验证该方法的临床实用性。结果荧光毛细管电泳技术准确地检测出40株艰难梭菌参考菌株的PCR-核糖体分型片段,并以数字化的形式呈现出来,10种核糖体型艰难梭菌的PCR-核糖体分型数字化图谱差异明显。同为RT027的21株菌株间、RT002的3株菌株间和RT015的2株菌株间的数字化分型结果相似性都非常高,而7株RT001菌株则可分为4种亚型,2株RT014分为2种亚型。49株深圳地区儿童中分离出的艰难梭菌共分为22种核糖体型,其中RT017共7株,BA03和BA16各5株,BA13共4株。22株悉尼地区莫西沙星耐药的艰难梭菌均为高毒力核糖体型027(RT027)。结论成功建立艰难梭菌数字化PCR-核糖体分型方法,同时构建了艰难梭菌10种核糖体型的数字化PCR-核糖体分型参考数据库;深圳地区婴幼儿中分离出的艰难梭菌基因型以RT017为主,与国内成人中的分离株相似。悉尼地区莫西沙星耐药的艰难梭菌均为高毒力RT027。

STR遗传标记荧光复合扩增系统的法医学应用

目的:建立D20S601、D6S474、D6S2418荧光标记复合扩增体系,并对其进行法医学实用性研究。方法:利用传统复合扩增技术扩增D20S601、D6S474、D6S2418基因座,在不同条件下对复合扩增系统的同一性、灵敏性、可重复性等进行测试,用实际案例进行验证。结果:建立的D20S601、D6S474、D6S2418荧光标记复合扩增体系的扩增条件要求不高,法医实用性研究证明该体系实用性好。结论:建立了D20S601、D6S474、D6S2418遗传标记的荧光标记复合扩增体系。法医学应用性研究证明,该系统分型结果稳定,重复性好,灵敏度高,对陈旧斑痕具有检测能力,能够对常见介质上的斑痕正确分型,与常见的动物及微生物无交叉反应,可成功应用于法医检案。

艰难梭菌数字化聚合酶链反应-核糖体分型方法及参考图谱的建立

目的建立艰难梭菌数字化PCR-核糖体分型方法及常见基因型的参考图谱。方法利用荧光毛细管电泳技术代替琼脂糖凝胶电泳检测艰难梭菌PCR-核糖体分型产物，建立数字化PCR-核糖体分型方法；利用40株分属于10种核糖体型（RT）的艰难梭菌参考菌株构建常见基因型的数字化参考图谱。结果荧光毛细管电泳技术准确地检测出40株艰难梭菌参考菌株的PCR-核糖体分型片段，并以数字化的形式呈现，10种核糖体型艰难梭菌的PCR-核糖体分型数字化图谱差异明显。同为RT027的21株菌株间、RT002的3株菌株间和RT015的2株菌株间的数字化分型结果相似性都非常高，而7株RT001菌株则可分为4种亚型，2株RT014分为2种亚型。结论成功建立艰难梭菌数字化PCR-核糖体分型方法，同时构建了艰难梭菌10种核糖体型的数字化PCR-核糖体分型参考数据库。

我国艰难梭菌核糖体分型库的标准化及应用

目的建立中国艰难梭菌核糖体分型的标准操作流程并补充和验证核糖体分型数据库,为提高各级网络实验室数据间可比性和建立我国艰难梭菌监测网络提供解决方案。方法参照国外和本实验室已有的核糖体分型操作流程制定实验室标准核糖体分型操作程序,建立基于BioNumerics 7.6软件分析的数据库使用方法,应用此分型程序和数据库使用方法分析54株欧洲地区及美国标准菌株来评价该数据库,对我国2010-2018年13个城市收集的374株艰难梭菌分离菌株进行分型以补充数据库信息,采用Kappa一致性检验方法分析验证实验一致性强弱。结果欧洲地区及美国标准菌株的毛细管电泳结果条带清晰、位置稳定,聚类结果快速准确;补充分型结果显示,此次分离株中共出现84种型别,其中25种RT型别与国外标准菌株型别一致,而其余的58种型别不同,并且在40种国外标准菌株型别中,有15种型别本次分型未出现;两次验证结果一致性检验Kappa值为0.891(P<0.01),两次测定结果具有一致性,其一致性强度为极强。结论应用基于QIAxcel毛细管电泳仪建立的标准实验室分型操作流程,所获得的电泳结果具有条带清晰、位置稳定的特点,标准化后的核糖体分型库具有良好的实验室间数据可比性和数据共享便捷性。

高毒力艰难梭菌的基因型和毒力相关基因检测

目的鉴定莫西沙星耐药的艰难梭菌临床菌株的基因型和毒素相关基因的携带情况。方法 22株莫西沙星耐药的艰难梭菌临床菌株收集自澳大利亚悉尼地区,利用基于荧光毛细管电泳的聚合酶链反应(PCR)-核糖体分型技术对其进行基因分型;利用PCR方法检测其毒素A、B编码基因tcdA、tcdB和二元毒素编码基因cdtA、cdtB;利用PCR-基因测序方法检测毒素调节基因tcdC的基因序列,通过与参考菌株VPI 10463(Genbank收录号:X92982)比对了解其基因突变情况,通过与Genbank中的序列比对确定其序列型。结果 21株菌株为高毒力核糖体型027(RT027),另1株为RT078;22株菌株毒力编码基因均为tcdA+tcdB+cdtA+cdtB+;21株RT027 tcdC序列型为sc1,另1株RT078序列型为WA39,与参考株VPI 10463比较,RT027菌株tcdC序列均出现连续18个核苷酸(nt330-347)的缺失和第117位单核苷酸的缺失,RT078菌株则出现连续39个核苷酸(nt341-379)的缺失和第184位(C>T)的突变。结论高毒力RT027是最常见的莫西沙星耐药的艰难梭菌基因型;高毒力RT027和RT078均携带毒素A、B和二元毒素编码基因,且毒素调节基因tcdC均存在基因突变。

PCR技术在基因突变分析和定型中的应用

聚合酶链反应 (PCR)技术的应用在基因突变分析和定型领域引起了翻天覆地的变化 。

15个STR位点在潮汕地区人群的群体遗传学分析

〔目的〕分析潮汕地区汉族人群15个STR位点遗传多态性。〔方法〕利用五色荧光标记多重PCR和全自动毛细管电泳技术对STR位点进行基因分型。〔结果〕统计分析346例无关个体15个位点的基因频率,所有位点均符合Hardy-Weinberg平衡。经计算,FGA、D2S1338和D18S5 1属于高度多态性位点,D8S1179、D2 1S11、D19S4 33、D13S317、vWA、D5S818和D16S5 39属于中高度多态性位点,而D37S82 0、CSF1PO、D3S135 8、TH0 1和TPOX多态性方面相对稍差。15个位点个体识别能力累积值>0 .999999999,三联体非父排除概率的累积值>0 .99999、二联体非父排除概率>0 .999,平均杂合度为0 .777,累积偶合率为1.2 6×10 -17。〔结论〕获得的潮汕地区汉族人群15个STR位点的等位基因频率,为将这些位点成功应用于本地区的亲子鉴定和个体识别提供依据。

GA118-16A型遗传分析仪的法医学有效性验证

从毛细管空间校正能力、恒温炉温度、荧光标准物Matrix的生成、内标准确性、基因分型软件的测试及980份现场检材、3500份数据库样本的平行检测等方面,对国产遗传分析仪进行法医学有效性验证,结果表明其与国际同类产品性能一致,可用于法医科学的案件检验和数据库建设。

我国新育成葡萄品种SSR指纹图谱的建立

目的：建立我国近年来新育成葡萄品种的指纹图谱，明确他们之间的亲缘关系。方法：收集了国内新育成的24个葡萄品种，采用6对国际通用的SSR荧光标记引物对其进行扩增，通过毛细管电泳进行基因分型。结果：这6个标记不仅可以明确的区分每一个供试品种，而且能很好鉴定葡萄品种的倍性，同时这些标记也可以用于品种间亲缘关系的鉴定，区分不同亲本、不同种群及不同亚属的葡萄品种。

一个脊髓性肌萎缩症的家系报道

目的 对一个生育过脊髓性肌萎缩症患儿的家系进行产前诊断,同时对三种实验室检测技术进行方法学的比较。方法 应用荧光定量PCR、荧光PCR-毛细管电泳法及MLPA对家系外周血样本及绒毛组织、羊水组织进行了检测。同时进行了亲缘鉴定以排除母源污染。结果 第一胎患儿为SMN1基因7、8号外显子纯合缺失合并SMN2基因的3拷贝重复,患儿父亲为SMN1基因第7、8号外显子的杂合缺失携带者合并SMN2基因的3拷贝重复,患儿母亲为SMN1基因第7、8号外显子的杂合缺失携带者,SMN2基因2拷贝。本次妊娠胎儿为SMN1基因第7、8号外显子杂合缺失及SMN2基因3拷贝重复。结论 经检测胎儿仅为SMN1基因杂合缺失的携带者,可继续正常妊娠。同时,荧光PCR-毛细管电泳法和MLPA可同时对SMN1和SMN2基因拷贝数进行检测,检测较为全面,但荧光定量PCR检测操作方便,检测周期短,适合大样本人群的普筛。