基于有机小分子钙离子荧光探针研究进展

Ca^(2+)是细胞内浓度变化最大的二价阳离子,参与多种生理过程,常作为信号通路中的第二信使。特异性可原位检测Ca^(2+)的方法引发了大量的研究兴趣,取得了不错的进展。其中基于小分子荧光探针的方法具有探针尺寸小、适用原位监测、生物兼容性高等优点备受关注。总结了近年来基于罗丹明、香豆素等小分子为荧光团的Ca^(2+)荧光探针,希望为未来性能更卓越的红外钙离子荧光探针提供强有力的结构活性基础。

新型荧光素类细胞钙离子荧光探针Fluo-Cl的设计、合成及表征

设计合成了一种新型荧光素类细胞钙离子荧光探针,并对其结构及光谱特性进行了表征.

利用荧光探针Fluo-4检测胸腺细胞内钙离子浓度变化

利用荧光显微数码成像系统测量荧光探针Fluo-4荧光强度的改变,建立动态检测细胞内钙离子浓度的方法。用荧光探针Fluo-4/AM标记原代培养小鼠胸腺细胞,以KCL刺激胸腺细胞去极化,并打开细胞膜上电压依赖性钙通道,细胞内荧光强度会发生改变。利用荧光显微数码成像系统动态监测Fluo-4荧光强度的改变可分析计算钙离子浓度。本方法灵敏度高,能实时监测细胞内钙离子浓度的变化。

新型含氟细胞钙离子荧光探针Fluo-3F的合成

目的设计并合成新型含氟荧光素类细胞钙离子荧光探针Fluo-3F。方法以5-氟邻硝基苯酚为起始原料,5步反应得到中间体BAPTA-F-CHO,再与4-氯间苯二酚缩合。结果新型含氟荧光素类钙离的结构经核磁共振光谱,红外光谱,质谱,元素分析得到证实。结论合成的新型含氟荧光素类钙离子荧光探针Fluo-3F荧光性能优异,为合成新型钙离子荧光探针提供了新的思路。

荧光法研究钙离子存在下槲皮素与牛血清白蛋白的相互作用

用荧光法研究了钙离子存在下槲皮素与牛血清白蛋白的相互作用。结果表明,与槲皮素一样,槲皮素-钙离子以形成配合物的形式静态猝灭牛血清白蛋白的内源性荧光,钙离子在一定范围内对槲皮素与牛血清白蛋白的结合起着重要的作用,槲皮素与牛血清白蛋白、槲皮素-钙离子与牛血清白蛋白的表观结合常数/结合位点数分别为5.905×105L.mol-1/1.012、1.245×106L.mol-1/1.037。

量子点荧光探针检测钙离子

以巯基乙酸(TGA)为稳定剂,水相合成了CdTe量子点(QDs)。向量子点溶液中加入槲皮素,由于槲皮素(QCT)与量子点之间发生作用而使其荧光猝灭,加入Ca^(2+)后量子点荧光又得以恢复,且荧光恢复程度与Ca^(2+)的浓度成一定线性关系,从而建立了基于量子点的荧光"开关"探针检测Ca^(2+)的新方法。在最佳实验条件下,当CdTe量子点的浓度为2.5×10^(-5)mol/L,槲皮素浓度为2.0×10^(-5)mol/L时,Ca^(2+)的线性检测范围为0.4×10^(-5)~4.0×10^(-5)mol/L,检出限为1.6×10^(-7)mol/L。该法已用于牛奶中Ca^(2+)的测定,结果令人满意。

阴离子染料荧光素生物探针测定蛋白质

以荧光染料单体和二聚体平衡转化为基础 ,提出了荧光素二聚体生物探针测定蛋白质的方法 .其结果与常用的考马斯亮兰法一致 ,但线性范围宽 。

微泵进样流动注射钙离子荧光探针的分析特性研究

用钙黄绿素 OH- Ca2 +体系 ,以流动注射荧光分析技术探讨了利用钙黄绿素 (Calcein)作为Ca2 +荧光探针的可能性 .详细研究了各因素对体系荧光强度的影响 ,在最佳的实验条件下 ,检测限为 1× 10 -8g/mLCa2 +,Ca2 +浓度在 0～ 8× 10 -5g/mL范围内呈良好的线性关系 ,相对标准偏差 (RSD)为 3 % (n =11,5× 10 -5g/mLCa2 +)

新型双光子钙离子荧光探针

Ca^2＋是细胞内的第二信使，胞内Ca^2＋的检测与成像一直是人们研究的热点。传统的荧光探针由于采用单光子激发，存在许多难以克服的问题。例如，紫外光的穿透性差，对活体细胞有损伤，会激发细胞的本底荧光及发生光漂白等。

稀土离子Tb^(3+)与拟南芥钙调素相互作用的荧光光谱及分析应用

钙调素 (CaM)是一种普遍存在的钙受体蛋白 ,它调节了许多细胞生物学功能。钙调素分子有 4个金属结合位点 ,而植物钙调素Ⅰ ,Ⅱ ,Ⅲ位点不含酪氨酸残基 ,只有第 4位点含一个酪氨酸残基。与动物体不同的是 ,植物能表达多种功能不同的钙调素亚型。文章利用Tb3 +荧光探针 ,采用直接激发 ( 2 2 1nm)或敏化激发 ( 2 80nm)并测量 5 4 5nm处的荧光发射强度 ,研究拟南芥CaM与Tb3 +的结合作用及分析应用。直接激发 ( 2 2 1nm)Tb3 + CaM络合物时 ,Tb3 +的发光显著增强 ,这归因于CaM中配位基取代了Tb3 +的配位水分子 ,从而导致荧光速率常数增加。直接激发滴定曲线中 ,当cTb3+/cCaM <4时 ,荧光强度呈不断上升的直线 ,之后出现平台区 ,这与CaM只结合 4个钙离子的结论一致。而间接激发滴定曲线近似为S型 ,且荧光强度较弱 ;其中当cTb3+/cCaM≤ 2时 ,荧光强度增加较弱 ;当 2 <cTb3+/cCaM<4时 ,荧光强度增加较大 ,这是由于与Tb3 +配位的CaM的弱结合位点中的酪氨酸残基发生显著的能量传递之故。进一步根据两类滴定曲线均在cTb3+/cCaM=4时呈现明显转折点的事实 ,建立一种测定钙调素浓度的方法。此方法估测CaM浓度具有灵敏度 ,准确度较高 。

激光扫描共聚焦显微镜观察胰蛋白酶对肺上皮细胞游离钙离子的影响

目的:研究PAR-2激动剂SLIGKV和tc-LIGRLO、胰蛋白酶及其抑制剂对H292肺上皮细胞[Ca2+]i的影响。方法:应用Fluo-3/AM荧光标记技术和激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)检测不同因素处理的H292肺上皮细胞[Ca2+]i。结果:胰蛋白酶、SLIGKVt、c-LIGRLO均能引发H292细胞[Ca2+]i的增加,平均荧光强度分别比加入药物前增加267%,60%和37%。胰蛋白酶抑制剂大豆胰蛋白酶抑制剂(SBTI)和α1-抗胰蛋白酶(α1-AT)可以抑制胰蛋白酶诱导的细胞[Ca2+]i的增加。结论:PAR-2可以介导H292肺上皮细胞[Ca2+]i的释放增加,胰蛋白酶抑制剂可以抑制胰蛋白酶诱导的细胞[Ca2+]i的增加。

健脾祛痰化瘀方对氧化型低密度脂蛋白诱导血管细胞信号分子钙离子和蛋白激酶C表达的影响

为了探讨健脾祛痰化瘀方在抗氧化型低密度脂蛋白致动脉粥样硬化中对信号转导分子钙离子和蛋白激酶C的影响 ,分别以健脾祛痰化瘀方—沥水调脂胶囊含药血清 (浓度分别为 5 %、10 %和 2 0 % )、氧化型低密度脂蛋白 (10 0mg L)处理人脐静脉内皮细胞和人脐动脉平滑肌细胞 ,以流式细胞仪检测两种细胞胞质游离钙离子浓度 ,以液体闪烁仪检测平滑肌细胞胞膜蛋白激酶C活性。结果发现 ,沥水调脂胶囊含药血清对氧化型低密度脂蛋白引起的内皮细胞、平滑肌细胞胞质游离钙离子浓度升高及平滑肌细胞胞膜蛋白激酶C活性升高有明显的抑制作用 ,其中 2 0 %含药血清作用最为明显。结果提示 ,健脾祛痰化瘀方可能通过调节钙离子、蛋白激酶C两种信号传递分子的变化起抗氧化作用 ,进而抑制内皮细胞凋亡及平滑肌细胞增殖 ,达到阻止动脉粥样硬化发生的作用。

钙离子与碱性蛋白酶的相互作用及机理研究

研究了Ca^(2+)与碱性蛋白酶的相互作用,并通过动态光散射(DLS)实验和荧光光谱法探讨其作用机理。实验结果表明,Ca^(2+)对碱性蛋白酶的活性具有一定的激活作用,其中CaCl_2较Ca(HCO_2)_2对碱性蛋白酶酶活的激活作用更加显著。动态光散射实验表明,Ca^(2+)与碱性蛋白酶主要通过静电作用力结合,Ca^(2+)的加入使得碱性蛋白酶分子的平均粒径减小,疏水结构逐渐向酶分子内部转移,有利于碱性蛋白酶活性的提高。利用荧光光谱研究Ca^(2+)与碱性蛋白酶的结合作用,结果表明Ca^(2+)对碱性蛋白酶的猝灭机制属于静态猝灭,Ca^(2+)与碱性蛋白酶形成稳定的复合物,且结合能力很强,结合过程能够自发进行。

稀土离子对钙调蛋白与蜂毒素作用的影响

分别用钙调蛋白和蜂毒素的内源荧光光谱以及铽离子的敏化荧光光谱考察了铽离子对钙调蛋白构象变化以及对钙调蛋白与蜂毒素相互作用的影响 .结果表明 ,铽离子首先结合在钙调蛋白的第Ⅰ和第Ⅱ位点 ,铽离子不影响钙调蛋白与蜂毒素的相互作用 ,蜂毒素与钙调蛋白作用后不影响铽离子在钙调蛋白上的键合顺序 .傅里叶变换红外光谱结果表明三价的镧离子与钙调蛋白作用使钙调蛋白的α螺旋结构增加 ,β折叠结构减少 ,与钙离子对它的二级结构影响相类似 .稀土离子在钙调蛋白 -蜂毒素复合体系中主要与钙调蛋白作用 .

铽离子探针法研究单宁酸与伴清蛋白相互作用

以pH7.4、含有0.1mol?L-1NaCl的0.01mol?L-1Hepes为缓冲液,在(25±0.2)℃,采用荧光光谱法研究了单宁酸(TA)与伴清蛋白(apoOTF)的相互作用.由蛋白内源荧光测定表明:TA分别与apoOTF,TbN3+-apoOTF和TbN3+-apoOTF-TbC3+结合形成1∶1配合物,其表观结合常数(KA)分别为7.15×105,4.16×106和3.77×106mol-1·L.以Tb3+敏化荧光测定表明:TA与Tb3+可形成1∶2配合物,且TA与Tb3+的结合能力大于apoOTF与Tb3+的结合能力.3TA-Tb2+配合物也可与该蛋白结合形成1∶1复合物,其KA为1.86×105mol-1·L.

锌离子和钙离子对槲皮素与牛血清白蛋白结合作用的影响

运用荧光光谱法,分别考察了Zn^(2+)、Ca2^(2+)对槲皮素与牛血清白蛋白(BSA)相互作用的影响,两种金属离子是否影响槲皮素对BSA的荧光猝灭作用机理、槲皮素与BSA结合作用常数、结合位点数、作用力类型等。结果表明,Zn^(2+)和Ca^(2+)存在时,不改变槲皮素对BSA的荧光猝灭机理、不改变槲皮素与BSA结合作用的作用力类型、结合位点数基本不变。但Zn^(2+)存在时,会导致槲皮素对BSA的结合常数减小;Ca^(2+)存在时,会导致槲皮素与BSA的结合常数增大。说明两种离子会影响槲皮素的蛋白质结合浓度。

稀土离子对钙调蛋白与单克隆抗体分子识别的影响

分别采用酶联免疫吸附 (ELISA)法和荧光标记技术比较了 Ca2 +,La3 +,Eu3 +和 Yb3 +离子对钙调蛋白与单克隆抗体 2 C3之间分子识别的影响 .结果表明 ,金属离子与钙调蛋白作用后会诱导其发生不同的构象变化 ,并进一步影响到钙调蛋白与单克隆抗体 2 C3分子之间的结合强度 .当钙调蛋白分别与 La3 +,Eu3 +,Yb3 +作用后 ,它与单抗 2 C3分子之间的解离常数为 (2 6 .8± 2 .5 ) ,(2 1 .8± 3.4 )和 (6 4 .8± 5 .1 ) nmol/ L,而结合 Ca2 +前后的钙调蛋白与单抗分子的解离常数分别为 (1 77.2± 2 .8)和 (1 5 7± 4 .2 ) nmol/ L.这一结果表明 ,稀土离子诱导钙调蛋白发生的构象变化明显不同于钙离子的作用 ,这种差异可能是稀土与钙离子对钙调蛋白调控作用表现出差别的原因 .

3-氨基香豆素衍生的荧光探针

香豆素是常用的荧光生色团,在发展新型高效的荧光探针中有重要应用。3-氨基香豆素是一种α,β-脱氢氨基酸内酯,为其发展成为有多种生物活性与其他功能分子提供了独特的结构基础。迄今为止,以3-氨基香豆素为原料发展了一系列荧光探针分子,快速检测金属离子和生物分子。综述了以3-氨基香豆素为原料发展的一系列新的荧光探针,这些探针主要用于选择性地高效探测Hg^(2+)、Ag+、Cu^(2+)、Cu+、Pd^(2+)、Zn^(2+)和Cr^(2+)等多种金属离子、硫离子、半胱氨酸和β-巯基乙醇等生物硫醇、H_(2)O_(2)和活性蛋白质。

应用重组表达钙离子敏感蛋白YC2.1研究粟酒裂殖酵母细胞内钙离子浓度的分布

把重组表达钙离子敏感蛋白的YC2.1基因(yellowcameleon2.1)导入了粟酒裂殖酵母中,观察了粟酒裂殖酵母细胞内钙离子浓度的分布。结果发现,钙离子敏感蛋白所指示的钙离子呈细胞周缘胞质较高浓度分布,而在细胞胞质中部的钙离子浓度相对低一些。通过DAPI染色实验证实这是由于胞质中部细胞核的填充而形成。fluo-3染色的裂殖酵母细胞,由于fluo-3进入到细胞器(房室化现象),所以出现胞质的内部区域高的荧光信号,而在周缘的胞质区相对弱,不能真实反应胞质钙离子的分布。因此重组表达钙离子敏感蛋白测定钙离子的方法优于fluo-3荧光探针的方法,对于裂殖酵母细胞胞内钙离子的研究具有良好的应用前景。

敲减钙离子/钙调蛋白依赖性激酶Ⅳ抑制干扰素-γ诱导C2C12细胞免疫分子的表达

目的探究敲减钙离子/钙调蛋白依赖性激酶Ⅳ(Ca MKⅣ)基因对炎性培养条件下C2C12细胞免疫分子表达的影响。方法采用慢病毒基因干扰技术敲减C2C12细胞的Ca MKⅣ基因,以2%马血清将C2C12细胞分化成肌管,以干扰素-γ(IFN-γ)刺激C2C12细胞,采用Real-time PCR和Western blotting检测Ca MKⅣ的表达,采用Western blotting和免疫荧光检测免疫分子主要组织相容性复合体(MHC) classⅠ(H-2Kb)、MHC classⅡ(H2-Ea)、Toll样受体3(TLR3)的表达,采用Real-time检测肌细胞分泌型促炎性细胞因子白细胞介素(IL)-1β、IL-6、肿瘤坏死因子(TNF)-α、巨噬细胞炎性蛋白(MIP)-1α和单核细胞趋化因子(MCP)-1的基因表达。结果 IFN-γ可诱导成肌干细胞以及分化肌管表达或上调表达免疫分子MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ、TLR3,同时上调C2C12细胞促炎性细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α、MIP-1α和MCP-1的基因表达量;敲减Ca MKⅣ基因导致上述上调趋势被抑制。结论敲减Ca MKⅣ基因可有效抑制IFN-γ诱导的免疫分子的表达,可能提示Ca MKⅣ参与调节肌细胞的免疫学特性。