2023年黑龙江地区某鹅场鹅星状病毒分离鉴定及ORF2基因序列分析

为调查2023年黑龙江地区某鹅场中鹅星状病毒(goose astrovirus,GoAstV)的感染及遗传进化情况,采集发病鹅的内脏组织样品进行RT-PCR检测,检测阳性样本通过鹅胚接种进行病毒分离,并利用RT-PCR以及电镜进行鉴定,利用二代测序技术进行分离毒株的全基因组测序,运用MEGA6软件对ORF2基因进行遗传进化分析。结果显示,在15份样品中,GoAstV的阳性率为6.67%(1/15)。阳性样本处理后接种鹅胚进行病毒分离,盲传至第5代时,尿囊膜增厚,出现尿酸盐沉积,鹅胚在120 h内死亡率达到83.33%(20/24),死亡鹅胚尿囊液进行GoAstV RT-PCR检测,结果为阳性。电镜观察结果显示,可观察到30 nm左右的病毒粒子。提取第5代病毒尿囊液RNA进行全基因组测序,并对该毒株ORF2基因进行同源性分析和系统发育进化树分析,结果显示,鉴定的毒株与其他GoAstV的ORF2基因核苷酸同源性为54.7%到96.6%,与GoAstV LYG2株的核苷酸同源性最高,为96.6%,而其与GoAstV FLX株差异较大,为54.7%。系统发育进化树结果显示,试验鉴定的毒株属于GoAstV G2型,与火鸡星状病毒遗传关系较近。研究对黑龙江地区某鹅场GoAstV进行分离鉴定并对ORF2基因进行序列分析,为黑龙江省GoAstV遗传进化及其分子流行病学调查研究提供了基础数据。

基于ITS2序列及其二级结构对矩镰荚苜蓿和近缘种的分子鉴定

为准确鉴定矩镰荚苜蓿(Medicagoarchiducis-nicolai)及其近缘种花苜蓿(M.ruthenica)、阔荚苜蓿(M.platycarpos)和毛荚苜蓿(M.edgeworthii),利用DNA条形码技术对4个物种的ITS2序列进行注释、比对、检验,计算种内种间遗传距离,邻接法(neighbor-joining, NJ)构建系统发育树,通过RNAfoldwebserver预测4个近缘种的ITS2二级结构。结果显示,矩镰荚苜蓿及其近缘种的ITS2序列长度为220~221 bp,稳定性好;种间遗传距离(0.004 55~0.022 73)明显大于种内遗传距离(均为0),存在明显的“BarcodingGap”区域;NJ系统发育树显示,毛荚苜蓿聚为一支,矩镰荚苜蓿、花苜蓿和阔荚苜蓿聚为另一支,然后矩镰荚苜蓿与阔荚苜蓿又各自形成单系;在二级结构中,矩镰荚苜蓿与阔荚苜蓿、毛荚苜蓿存在明显差异,但与花苜蓿极为相似,难以区分。分析表明:除花苜蓿外,以ITS2序列作为条形码并辅以二级结构,可以达到对矩镰荚苜蓿、阔荚苜蓿和毛荚苜蓿准确、快速鉴定的目的。

基于ITS2序列的球兰属植物种间鉴定研究

目的:利用ITS2序列对球兰属植物进行DNA分子鉴定,为其物种鉴定和遗传多样性研究寻求新路径。方法:提取80份球兰样品的DNA,通过PCR扩增ITS2序列并测序,预测其ITS2二级结构。运用MEGA6.0等软件构建邻接(NJ)系统发育树,计算各类别遗传距离。通过叶片形态学特征对其聚类结果进行验证。结果:80份球兰属植物ITS2序列长度约为250 bp,样品CG含量在60.44%~72.88%之间,平均CG含量为68.12%。种内恒定位点数为32,变异位点数为217。NJ系统发育树中80份样品可聚类为11类。序列总体平均遗传距离为0.171,对80份球兰样品的鉴别成功率约为81.25%,结合ITS2序列二级结构可直观地将大部分球兰属植物区分。基于ITS2序列的NJ进化树可阐述球兰属植物的种间关系,聚为一类的球兰属植物叶片颜色和叶形较为相似,也在一定程度上验证了聚类树构建的合理性。结论:ITS2序列可作为解决球兰属植物物种鉴定难题的有效方法。

油菜杂交种合油杂2号纯度鉴定的SSR引物筛选

以陕西渭北旱塬最新审定的双低油菜品种合油杂2号以及亲本为试验材料,用SSR标记技术研究杂种与双亲之间的扩增谱带多态性以甄别真假杂种。结果发现,200对SSR引物先用亲本进行预选,有45对引物可以特异区分两亲本,进一步反复筛选,其中引物CB10524分别在杂交种和其双亲之间存在扩增条带的多态性,表现为杂交种条带均为父母本的互补型,很适合做杂交种纯度鉴定。用该引物对合油杂2号杂交种进行SSR纯度鉴定,所测纯度分别为93%,与田间实测纯度94.27%非常接近,表明开发的SSR标记技术在合油杂2号油菜杂交种子纯度室内快速检测中具有广阔的应用前景。

1株牛病毒性腹泻病毒的分离鉴定及其结构蛋白E2序列分析

为了解河北省唐山市规模化奶牛场中牛病毒性腹泻病毒(BVDV)流行毒株的基因特征,本试验于唐山市2个规模化奶牛场采集了49份临床样品进行逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测,并对阳性样品进行病毒的分离,最终成功分离到1株非致细胞病变的BVDV毒株,命名为HB-1株。电镜观察结果显示,HB-1株具有典型的BVDV病毒粒子形态。对HB-1株全基因组序列进行扩增和测序,基因遗传进化分析结果显示,HB-1株属于BVDV-1m亚型。HB-1株结构蛋白E2全长序列糖基化位点和抗原表位预测结果显示,HB-1株E2蛋白含有4个保守的糖基化位点,其中抗原表位1高度保守。本试验为河北省进一步开展牛病毒性腹泻(BVD)流行病学调查、疫苗株筛选以及检测方法建立提供数据支撑。

ITS2序列作为DNA条形码鉴定几种虎耳草科植物的有效性研究

利用DNA条形码分子诊断技术对几种虎耳草科药用植物进行鉴定并评价ITS2序列对虎耳草科植物鉴定的有效性,为虎耳草科植物鉴定提供一种新思路。于不同区域采集13份虎耳草科植物样本,提取基因组DNA后,利用ITS2序列扩增引物进行PCR扩增及测序,并从GenBank数据库中下载11条同属及同科序列。基于HHMer注释方法去掉两端区段获得ITS2序列,采用MEGA7.0软件进行序列长度、碱基含量对比,并基于K2P模型计算并分析种内、种间遗传距离,采用邻接法构建NJ系统进化树,采用靴带检验法(1000次重复)检验各分支的支持率,于ITS2数据库网站预测并比较ITS2序列的二级结构。结果显示,虎耳草科植物种间遗传距离大于种内遗传距离,能将各物种区分;系统进化树中各属分别聚为一支,同属内各物种大多分别聚为一小支,部分物种的鉴定需要进一步研究;各物种ITS2二级结构均存在不同差异,可对物种鉴定进行辅助分析。利用ITS2序列作为DNA条形码可有效地区分鉴别几种虎耳草科药用植物。

猪细小病毒BJ2株的分离鉴定及全基因组序列分析

为了解国内猪细小病毒(PPV)的流行、毒株变异情况,采用PPV特异性PCR方法检测2020—2021年从江苏、河南和北京3个省市采集的组织样品,将PPV阳性病料接种猪睾丸细胞(ST)进行病毒分离,利用间接免疫荧光方法(IFA)、实时荧光定量PCR(qPCR)和电镜观察对分离株进行鉴定,并测定分离株全基因组核苷酸序列,之后应用MEGA 6.0和MegAlign软件对分离株进行遗传变异分析。结果表明,成功分离到1株PPV,命名为BJ2株;全基因组核苷酸一致性分析结果显示,BJ2株与皮炎型强毒株Kresse株、Challenge株核苷酸一致性为99.3%,与实验室2019年分离株HeN1202株核苷酸一致性为95.9%;VP2基因核苷酸一致性和遗传进化分析结果显示,BJ2株与德国27a株处于同一进化分支,其核苷酸一致性为99.3%,HeN1202株与弱毒株NADL-2株亲缘关系较近;BJ2株与德国27a株相比,VP2蛋白氨基酸序列存在2个位点差异。综上,PPV BJ2株与德国27a株亲缘关系较近。

兔出血症病毒2型的分离鉴定与序列分析

兔出血症(Rabbit hemorrhagic disease,RHD)是由兔出血症病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV)引起的一种具有高度传染性、急性致死性兔病。兔出血症病毒2型(RHDV2)引起的RHD主要在欧洲流行,病兔的死亡率高达90%,而用经典RHDV毒株制备的疫苗几乎不能预防家兔感染RHDV2,从而给世界养兔业造成了巨大的经济损失。2020年4月,中国四川省某兔场首次发生由疑似RHDV2引起的RHD,笔者所在实验室通过红细胞凝集试验(Hemagglutination,HA)、逆转录-聚合酶链式反应(Reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)扩增、vp60基因序列分析和病毒复制试验,对采集的病死家兔肝脏样本进行病原鉴定。HA结果显示,部分病死家兔的肝脏样本不能引起血凝现象;RT-PCR结果显示,样品中出现了RHDV2的特异性条带。对新发现毒株cDNA的RT-PCR产物进一步分析发现,所扩增vp60基因核苷酸序列与经典RHDV vp60基因核苷酸序列的一致性为77.5%~80.1%,与RHDV2 vp60基因核苷酸序列的一致性为93.6%~96.1%,并且与RHDV2处于同一个进化分支。病毒复制试验结果显示,用病死家兔肝脏组织与磷酸缓冲盐溶液(Phosphate buffer saline,PBS)按1 g∶10 ml混合后制成的悬液分别人工感染5只非免疫25日龄未断奶仔兔和5只2月龄兔,在24~48 h全部死亡。基于以上试验结果,确定本研究新发现的RHDV毒株为RHDV2,并将其命名为SC2020,这是在中国首次发现RHDV2毒株,应引起高度重视。

鸭瘟病毒的分离鉴定及其UL2、TK基因序列分析

2015年,福建省福州地区2个鸭场(M18肉鸭场及蛋鸭场)发生大量鸭死亡,初诊疑似鸭瘟。为明确其病原,分别采集病死鸭肝脏、食道样品进行鸭瘟病毒特异性PCR检测和病毒分离,对获得的2株病毒分离株分别进行鸭已知病原的检测,确定均为鸭瘟病毒。对新分离鉴定的2株鸭瘟病毒株的UL2基因进行序列测定及分析发现,均具有强毒株的分子特征;经TK基因序列测定及分析表明,2株新分离的鸭瘟病毒株与强毒代表株、弱毒疫苗株的TK基因核苷酸同源性均高达98.7%。

基于ITS2序列鉴定川贝母及其混伪品基原植物

本研究对川贝母5种不同基原植物ITS2序列进行PCR扩增和测序;同时扩大研究范围,从GenBank上下载川贝母及其常见混伪品共10个物种13个样本的ITS2序列。用MEGA4.1计算其种间、种内的K-2-P距离,并分析各样本间ITS2序列二级结构的差异,最后利用ITS2序列重构其系统发育树。结果显示川贝母基原植物种内最大K-2-P距离为0.0276,与混伪品的种间最小K-2-P距离为0.0583;川贝母及其混伪品的ITS2二级结构存在明显差异;重构的系统发育树显示川贝母不同基原物种聚为一支,能较好与混伪品区分。研究结果表明ITS2条形码序列能够成功鉴定川贝母及其混伪品的原植物,为川贝母混伪鉴别提供了新工具。

羊传染性脓疱病毒松原分离株的分离鉴定及B2L基因的克隆与序列分析

利用原代犊牛睾丸细胞从临床上表现口疮症状的羔羊痂皮材料中分离获得1株病毒,对该株病毒进行病毒形态学、理化学、PCR检测与动物回归试验等系统鉴定后,证实该分离株为羊传染性脓疱病毒(Orf virus,ORFV),命名为ORFV-sy。利用PCR方法克隆出其B2L基因,并将该基因序列和推导的氨基酸序列与6个不同来源的ORFV毒株进行同源性和亲缘关系的比较分析。结果表明,各毒株间核苷酸和氨基酸的同源性分别为97.8%～99.5%和97.6%～99.5%;系统发育进化树结果表明,ORFV-sy毒株与印度分离绵羊株ORFV-Mukteswar67/04、ORFV-Izatnagar79/04的亲缘关系较近,表明不同地区分离毒株的B2L基因差异不大。

基于ITS2序列鉴定中药材金沸草、旋覆花及其近缘混伪品

目的:应用ITS2序列鉴定中药材金沸草、旋覆花及其近缘种混伪品,以确保药材质量,保障临床安全用药。方法:通过对金沸草、旋覆花等药材的3个基原物种条叶旋覆花、旋覆花和欧亚旋覆花及其同属近缘物种进行DNA提取、PCR扩增ITS2序列并双向测序,用CodonCode Aligner对测序峰图进行拼接后,用MEGA5.0软件进行相关数据分析,并构建NJ系统聚类树以直观反映鉴定结果。结果:各基原物种ITS2序列变异位点稳定,其种内平均K2P距离均远小于各自药材以及同属近缘混伪品的种间平均K2P距离;基于ITS2序列的NJ树可以将金沸草和旋覆花药材与同属其它近缘混伪品明显区分开。结论:ITS2序列可准确鉴别中药材金沸草和旋覆花及其同属近缘混伪品。

大黄与易混伪品土大黄、虎杖原植物的ITS2序列鉴定

目的分析大黄与其易混伪品原植物的rDNA上的ITS2序列信息,探索鉴定大黄及其混伪品的新方法。方法提取DNA模板后对其ITS2区进行PCR扩增、测序;拼接序列;计算种内种间K2P距离,最后基于K2P距离建立NJ树。结果大黄与其混伪品的最小种间K2P距离(38.6%)大于最大种内K2P距离(8.0%),NJ树中大黄三个基原的不同来源样品聚为一支。结论因此ITS2序列可以作为鉴定大黄与易混伪品土大黄、虎杖的候选条形码序列,DNA条形码技术在中药鉴定中具有极大的前景。

ITS2序列鉴定筋骨草及其近缘种

本研究对筋骨草ITS2区段测序,探讨该片段用于中药筋骨草、白苞筋骨草、白毛夏枯草和夏枯草种间分子鉴别和系统学研究中的意义,我们对核基因ITS2区段进行PCR扩增并测序,获得了该区间的完整序列,所得序列用软件MEGA4.0进行相关分析。测得筋骨草、白苞筋骨草、夏枯草和白毛夏枯草的ITS2片段长度分别为312bp,304bp,303bp,304bp。四个物种ITS2片段序列的遗传距离(Kimura2)为0.010～0.175,各个筋骨草种内的不同产地该序列无差异。用MP法根据ITS2序列的遗传距离建立系统发生树,聚类结果和形态分类相符。根据ITS2序列特征,能有效区分筋骨草和其他易混中药材。ITS2具有做为鉴定的条形码序列的潜力。应用该序列可以有效鉴定筋骨草及其近缘种。

ITS2序列鉴定小茴香及其常见混伪品

目的探讨基于ITS2序列鉴定小茴香及其混伪品的新方法。方法对小茴香4份样品的ITS2序列进行PCR扩增和测序,同时从GenBank上下载小茴香及其常见混伪品共6个物种42个样本。用MEGA4.1计算其种间、种内的K-2-P距离,并分析各物种间ITS2序列二级结构的差异,最后利用ITS2序列构建其系统发育树。结果小茴香种内最大K-2-P距离为0.0307,与混伪品的种间最小K-2-P距离为0.0405;小茴香及其混伪品的ITS2二级结构存在明显差异;构建的系统发育树显示小茴香的不同来源样本聚在一支,能很好与混伪品区分。结论 ITS2序列能够成功鉴定小茴香及其易混伪品,可以作为小茴香及其混伪品的分子鉴定方法。

基于ITS2条形码序列鉴定中药材佩兰及其混伪品

目的:对中药材佩兰及其混伪品进行ITS2条形码鉴定,以确保该药材的质量以及临床疗效。方法:提取佩兰的DNA,利用PCR技术扩增其ITS2序列,双向测序,所得序列经过CodonCodeAligner拼接后,用软件MEGA5进行相关数据分析,计算其种内、种间遗传距离,并构建系统发育树。结果:佩兰药材的ITS2序列长度为218 bp;佩兰种内最大K2P距离为0.009,与混伪品种间最小K2P距离为0.024。ITS2序列的NJ系统聚类树可明显区分佩兰药材及其混伪品,表现出良好的单系性。结论:ITS2条形码序列能够成功鉴定中药材佩兰与其混伪品,为保障临床安全用药提供了新的技术方法。

重庆地区猪圆环病毒2型的分离鉴定与序列分析

为了解2007年以来重庆地区猪圆环病毒2型（PCV-2）的流行情况,对2007年—2013年重庆地区送检样品进行了PCV-2荧光定量PCR检测,并对阳性样品进行了病毒的分离鉴定,成功分离到12株PCV-2,对分离的12株PCV-2进行了全基因组克隆与序列分析。结果显示,所分离的PCV-2均处于PCV-2b分支,基因组全长均为1 767bp,与PCV-2b参考毒株（AF055394）的核苷酸同源性为96.2%-99.7%,与疫苗SH株的核苷酸同源性为96.0%-98.4%,而与疫苗LG株同源性仅为95.5%-95.8%。研究结果为PCV-2的研究及其感染的防控奠定了基础,也为重庆地区PCV-2疫苗毒株的选择提供了理论依据。

ITS2序列鉴定大蓟、小蓟药材及其近缘混伪品

目的:应用ITS2序列鉴别大蓟、小蓟药材及其近缘混伪品,以保障临床用药准确。方法:收集大蓟、小蓟药材的基原物种蓟和刺儿菜及其近缘混伪品,经DNA提取、PCR扩增、测序和序列拼接等步骤,获得ITS2序列,结合Gen Bank载序列共14个物种54条序列,用MEGA6.0对序列进行比对分析,计算种内种间K2P(Kimura 2-Parameter)遗传距离,构建系统邻接(NJ)树。结果:ITS2序列分析表明,蓟和刺儿菜种内变异位点数均远小于其与混伪品种间变异位点,以上2个物种种内最大(平均)K2P距离均小于其与混伪品种间最小(平均)K2P距离;基于ITS2序列的系统NJ树可以将蓟和刺儿菜及其近缘混伪品很好地区分开,且各物种均单独成支。结论:ITS2序列可以很好地鉴定大蓟、小蓟药材及其近缘混伪品。

H9N2亚型猪流感病毒山东分离株的分离鉴定及其HA、NP、NS基因序列分析

从山东地区疑似流感发病猪分离到 10株流感病毒 ,经国家流感中心鉴定均为 A型流感病毒 H9N2亚型。将其中 1株 Sw/ SD/ 1/ 2 0 0 3(H9N2 )的血凝素基因 (HA)、核蛋白基因 (NP)和非结构蛋白基因 (NS)进行克隆与测序 ,与Gen Bank收录的其他猪流感和禽流感 H9N2亚型的相关基因进行比较 ,推测 Sw/ SD/ 1/ 2 0 0 3(H9N2 )可能源于禽流感病毒 H9N2亚型和 H5 N1亚型的重组病毒 ;Sw/ SD/ 1/ 2 0 0 3的 HA氨基酸裂解位点与其他 H9N2亚型不同 ,Sw/ SD/1/ 2 0 0 3的 HA氨基酸裂解位点是 R- S- L- R- G,而其他猪流感和禽流感 H9N2亚型都是 R- S- S- R- G。

猪呼肠孤病毒SC-A株的分离鉴定及σ2基因的克隆与序列分析

通过在病毒培养液中添加胰酶的方法,从仔猪腹泻粪样中分离并鉴定了1株能在Vero细胞上稳定产生CPE,并以细胞颗粒增多、肿胀、漂落为特征的猪呼肠孤病毒SC-A株。在感染细胞中,病毒胞浆包涵体及特征性微管样结构明显,病毒粒子多呈典型的晶格状排列,大小约70 nm。S2基因的克隆测序结果表明,SC-A S2全基因(DQ396805)大小为1 331 bp,其开放阅读框编码一个由418个氨基酸组成,相对分子量约为47 140的σ2蛋白;与标准株T1L、T2J、T3D的核苷酸序列和推导氨基酸序列的同源性分别为86.9%、76.7%、85.4%及94.6%、93.3%、98.3%。以σ2氨基酸序列构建的进化树分析显示,标准株及野外分离株可被划分为A(T3)、B(T2)、C(T1)3个群;除T3C31外,其余3型野外分离株及SC-A株和所有血清1型均位于C群中。