CDC 25A和CDC 25B基因在宫颈癌中的表达和临床意义

目的：检测及讨论CDC 25A和CDC 25B基因在宫颈癌中的表达水平及其临床意义。分析CDC 25A和CDC 25B基因剪切变异分子CDC 25A1—2、CDC 2581—4在宫颈组织中的表达分布规律。方法：采用RT—PCR和Western印迹法检测61例宫颈癌组织、18例宫颈良性病变组织中CDC 25的表达情况，并分析CDC 25的表达水平与宫颈癌临床病理参数之间的关系。结果：CDC 25A和CDC 25B基因在宫颈癌组织和宫颈良性病变组织中的表达差异有统计学意义（P〈0．05）；CDC 25的各剪切变异分子表达在宫颈癌患者不同年龄、癌组织病理类型、临床分期及癌细胞分化程度间差异有统计学意义（P〈0．05），而与宫颈癌的淋巴结转移无关（P〉0．05）。结论：宫颈癌组织中存在CDC 25A和B的高表达，CDC 25分子及其剪切变异体的表达异常可能是宫颈癌发生、发展的重要细胞内调控机制之一。

RNA干扰技术沉默CDC25a基因对人肝癌细胞HepG2增殖的影响

目的:研究细胞分裂周期素25a(cell division cycle 25a,CDC25a)基因沉默后对于人肝癌细胞系Hep G2增殖的影响。同时探讨该影响发生的可能作用机制。方法:使用RNA干扰技术沉默人肝癌Hep G2细胞的CDC25a基因,采用实时荧光定量PCR技术检测肝癌细胞中的CDC25a及其作用基因cyclin E及CDK2的mRNA表达水平,Western blotting检测CDC25a的蛋白表达水平,并采用MTT法、Giemsa染色法及流式细胞技术检测细胞的增殖情况。结果:CDC25a的mRNA及蛋白表达水平在RNA沉默组细胞中的表达低于阴性对照组及正常对照组细胞(P<0.05)。Cyclin E及CDK2的mRNA表达水平在沉默组低于阴性对照及正常对照组(P<0.05)。MTT法、Giemsa染色法结果显示沉默组细胞增殖能力低于阴性对照组及正常对照组细胞(P<0.05),流式细胞技术结果显示沉默组细胞阻滞在G1期。结论:LV-CDC25a-RNAi重组体感染Hep G2细胞可以有效抑制CDC25a基因的表达,使人肝癌Hep G2细胞增殖受到抑制,提示CDC25a基因可能是肝癌治疗的关键靶点。

过敏性鼻炎伴哮喘综合征患者细胞分裂周期相关蛋白5基因表达和临床意义

目的研究过敏性鼻炎伴哮喘综合征(combined allergic rhinitis and asthma syndrome,CARAS)患者淋巴细胞差异表达基因及相关功能,寻找参与调控CARAS的重要基因,并探讨其表达水平与疾病进展的关系。方法通过过敏性哮喘mRNA表达芯片数据集筛选正常人和过敏性哮喘患者差异表达基因,并对基因进行功能注释,根据基因注释结果筛选参与过敏性哮喘调控的重要基因。对筛选出的细胞分裂周期相关蛋白5(cell division cycle associated 5,CDCA5)基因在过敏性鼻炎、CARAS患者外周血淋巴细胞中验证其表达水平,并分析其表达水平与过敏性鼻炎和哮喘之间的关系。结果 GSE104472数据库分析过敏性哮喘患者与正常人外周血淋巴细胞共有2971个差异表达的基因。KEGG通路富集分析发现有16个差异基因参与胰岛素信号通路调节。GO基因功能注释分析发现有191个基因参与无膜细胞器的构成。CDCA5基因参与无膜细胞器构成和细胞分裂的调控,并在过敏性鼻炎和CARAS患者升高。CDCA5高表达组患CARAS的概率明显高于CDCA5低表达组。结论 CDCA5在CARAS患者外周血淋巴细胞表达水平显著增高,并可能与哮喘疾病进展相关。

雷公藤内酯醇洗脱支架对小型猪冠状动脉内膜增生及细胞分裂周期基因2、基质金属蛋白酶2表达的影响

目的探讨雷公藤内酯醇药物洗脱支架抑制再狭窄的机制。方法 18只健康国内西藏小型猪随机分为不锈钢裸支架组(BMS)、雷帕霉素洗脱支架组(SES)、雷公藤内酯醇洗脱支架(TES)100μg组,每组各6只猪,术后7 d和28 d复查冠状动脉造影后放血处死动物,分离冠状动脉支架血管段固定。测定冠状动脉外弹力膜层横断面积、支架上平均内膜厚度、支架间平均内膜厚度,观察血管平滑肌细胞的移行、增殖及内膜厚度变化,计算血管损伤积分。用免疫组织化学方法检测冠状动脉组织中基质金属蛋白酶2(MMP2)和细胞分裂周期基因2(CDC2)的蛋白表达,并进行半定量分析。结果支架植入导致的冠状动脉血管损伤积分各组均差异无统计学意义(P=0.457)。支架植入后7 d,BMS组可见增生内膜几乎全部包绕支架撑杆,SES组、TES 100μg组支架撑杆两侧可见内膜增生,管腔面支架裸露。支架植入28 d后各组血管内膜完全内皮化,BMS组支架上内膜厚度、支架间内膜膜厚度均较TES 100μg、SES组厚,差异有统计学意义(P<0.01)。支架植入后7 d和28 d,免疫组织化学分析MMP-2、CDC2激酶在BMS组中强表达,TES 100μg和SES组弱表达,平均灰度值经统计学比较,差异有统计学意义(P<0.01)。结论:雷公藤内酯醇洗脱支架100μg组剂量能很好的抑制血管内膜过度增生,预防再狭窄。

膀胱移行细胞癌细胞周期相关基因的筛选

【目的】探讨人膀胱移行细胞癌细胞周期相关基因的表达变化。【方法】使用人肿瘤基因表达谱芯片检测11例膀胱移行细胞癌组织基因表达谱的变化,以寻找与细胞周期相关的差异表达基因。【结果】以正常膀胱黏膜组织为对照,11例膀胱肿瘤组织中有87个基因表达明显下调,102个基因表达明显上调。其中与细胞周期相关的差异表达基因有10个,其中明显上调基因7个,明显下调基因3个。【结论】膀胱肿瘤的发生与发展与多种细胞周期相关基因的异常表达有关。

细胞分裂周期蛋白2启动子报告基因载体的构建与鉴定

目的构建细胞分裂周期蛋白2(Cdc2)基因启动子荧光素酶报告基因载体pGL3-Cdc2-promoter,并检测其转录活性。方法根据UCSC软件查找的人基因组DNA的Cdc2启动子序列并设计两端引物,扩增人基因组DNA中的Cdc2启动子。用限制性内切酶SacⅠ和XhoⅠ双酶切质粒pGL3-Basic和Cdc2启动子后,将Cdc2基因启动子插入到pGL3-Basic报告基因载体上。重组质粒命名为pGL3-Cdc2-promoter。将其与内参质粒pRL-SV40瞬时共转染骨肉瘤细胞U2OS,检测双荧光素酶活性。结果成功构建Cdc2基因启动子荧光素酶报告基因载体pGL3-Cdc2-promoter,质粒酶切及测序结果完全正确。瞬时共转染pGL3-Cdc2-promoter/pRL-SV40组荧光素酶活性为1.591 5±0.199 8,高于转染pGL3-Basic/pRL-SV40组的荧光素酶活性值0.049 9±0.010 4。结论 pGL3-Cdc2-promoter在骨髓瘤细胞U2OS细胞中能被转录激活,为进一步将其用于抗肿瘤药物的筛选与评价奠定了基础。

缺血再灌注损伤对大鼠肝细胞周期G2／M期相关基因Gadd45a和Egr-1表达的影响

目的观察缺血再灌注损伤（IRI）对大鼠肝组织内细胞周期调控相关基因转录和表达的影响，探讨生长阻滞和DNA损伤修复基因（Gadd45a）和早期生长反应基因1（Egr-1）参与DNA损伤后修复的可能机制。方法按随机成组对照设计将大鼠平均分为正常对照组、缺血组、再灌注30min、1h、2h、3h及24h组，于相应时间点获取大鼠肝组织样本，将利用芯片实验筛选出的关键基因Gadd45a和Egr-1作为目的基因，并采用RNA印迹法和实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）验证基因芯片筛查的结果，采用荧光免疫组织化学染色检测冰冻新鲜肝组织样本Egr-1的表达，采用免疫组织化学染色检测肝组织样本Gadd45a的表达。结果RNA印迹检测结果显示，RT-PCR产物与待测的目标基因一致；表达谱芯片信号与RT-PCR的检测显示，目的基因的表达变化特征均为再灌注早期（1h）升高4倍以上，其中Egr-1的表达上调9．39倍，Gadd45a的表达上调8．28倍及热休克蛋白70—1a的表达上调10．8倍；再灌注后24h均降至正常水平，芯片初筛结果与RT-PCR的检测结果一致，是准确、可靠的。荧光免疫组织化学检测显示，再灌注1h组和2h组肝组织细胞核Egr-1的表达均为阳性；免疫组织化学检测显示，随着再灌注时间的增加，细胞核和细胞浆内Gadd45的表达逐渐升高。结论Gadd45a和Egr-1基因均是核因子κB调控通路的关键基因，在大鼠肝脏IRI中参与调控了细胞周期G2／M期的停滞和修复受损的DNA。

慢病毒导入的CDC25B2 siRNA对胰腺癌细胞CFPAC-1生物学行为的影响

目的利用已构建成功的、在人胰腺癌细胞株CFPAC-1中稳定抑制细胞分裂周期25同源体B（CDC2582）的重组慢病毒，建立CDC2582表达降低的细胞株，以研究该基因的作用。方法将产生CDC2582小干扰RNA（siRNA）分子的、携带绿色荧光蛋白的重组慢病毒感染CFPAC-1细胞后，用流式细胞仪筛选稳定表达的细胞株。应用RT—PCR和Westernblot分别对细胞中CDC2582的mRNA和蛋白表达水平进行分析。应用MTT法、流式细胞仪、平板克隆形成和Transwell小室法分别检测其对细胞增殖、周期、细胞克隆形成能力和迁移侵袭能力的影响。结果CDC2582 siRNA显著下调CFPAC-1细胞中CDC2582的表达，所构建的重组慢病毒导入的siRNA有较高的沉默效率，CFPAC-1细胞的增殖能力、克隆形成能力以及迁移侵袭能力显著增强，细胞周期无明显改变。结论CDC2582基因可显著影响胰腺癌CFPAC-1细胞的增殖、克隆形成和迁移能力，为利用CDC2582所介导的信号通路进行肿瘤基因治疗提供了实验依据。