基因Ⅶ型新城疫病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立

根据基因ⅤⅡ型新城疫病毒F基因裂解位点特征设计一对引物和TaqMan探针,建立一种敏感、特异、重复性良好的基因ⅤⅡ型毒株荧光定量RT-PCR鉴别检测方法。以体外转录法制备的cRNA标准品为标准阳性模板,构建标准曲线,并进行各项指标的检测。结果表明,建立的方法特异性良好,最低可检测到102拷贝·μL-1的模板RNA,敏感性比普通RT-PCR高100倍。本试验建立了基因ⅤⅡ型新城疫病毒荧光定量RT-PCR检测方法,且该方法能够鉴别检测常规方法不能区分的新城疫病毒基因ⅤⅡ型强毒株,表明本研究建立的方法可用于此种基因型毒株的快速鉴别检测。

反向遗传技术致弱的基因Ⅶ型新城疫病毒对SPF鸡的免疫效力评价

为评估致弱的基因Ⅶ型新城疫病毒(NDV)的免疫效力,本研究采用反向遗传技术构建的一株基因Ⅶ型NDV减毒疫苗株(MG7株),通过滴鼻点眼接种4周龄SPF鸡后,检测其体液免疫、细胞免疫以及攻毒后保护效率和排毒情况等指标,评价MG7株的免疫效果。结果表明:MG7株免疫3周后,能够诱导SPF鸡抗体的产生,且抗体水平(>6.08log_2)高于La Sota株免疫组(5.2log_2)。MG7株免疫1~3周内,PBMCs中CD8α+T淋巴细胞亚群比例呈逐渐上升趋势;MG7免疫后第3周,PBMCs中CD4^+T淋巴细胞亚群的比例明显增加(p<0.05);同时,MG7株免疫组的血清IFN-γ含量也呈递增趋势,与空白对照组存在极显著差异(p<0.01)。此外,以基因Ⅶ型NDV强毒株进行攻毒试验,在攻毒后第2 d^6 d,MG7株免疫组SPF鸡未检测出排毒;LaSota株免疫组则存在不同程度排毒现象,而空白对照组全部死亡。实验表明,与LaSota株免疫组相比,MG7株能够有效诱导NDV特异性抗体产生和T细胞免疫反应,提高SPF鸡的保护效率和有效阻止排毒。本研究对MG7株免疫效力的评估结果表明其具有作为新型基因Ⅶ型NDV疫苗株的潜力,有助于我国ND的防控和根除。

2014-2018年我国5株基因Ⅶ型新城疫病毒的基因组特性

为了解我国基因Ⅶ型新城疫病毒的分子生物学特性,对2014-2018年分离的5株基因Ⅶ型新城疫病毒代表株进行了基因组测序和生物信息学分析。序列分析显示:5株病毒F蛋白裂解位点为112RRQKR/F117或112RRRKR/F117,具有强毒株的典型特征;病毒基因组长度均为15 192 nt,其F蛋白融合肽、七肽重复区和跨膜区,以及HN蛋白跨膜区、中和抗原表位等功能区有多处氨基酸变异。病毒F基因遗传进化分析显示:2014-2015年分离的2株病毒属于基因Ⅶ.1.1亚型;2016-2018年分离的3株病毒属于基因Ⅶ.2亚型,暗示此亚型毒株可能已逐步取代基因Ⅶ.1.1亚型,成为家禽中的优势流行毒株。本研究进一步掌握了我国基因Ⅶ型新城疫病毒的遗传特性,从而为科学防控该病提供了参考。

番鸭源基因Ⅶ型新城疫病毒的生物学特性和免疫原性评价

为了解我国近年水禽主要流行的基因Ⅶ型新城疫病毒的生物学特性和免疫原性,通过攻毒试验和免疫保护试验测定了1株本实验室分离保存的番鸭源基因Ⅶ型新城疫病毒MDK/FS-SS/E/2007的致病指数、雏番鸭致病性和免疫保护性等特征。致病指数评价结果显示,该毒株符合新城疫病毒强毒株标准。雏鸭致病试验结果显示,攻毒组动物均出现沉郁、瘫痪和扭颈等神经症状,剖检可见脑部充血、出血,胰腺、脾脏和肝脏等器官出现变性坏死等典型新城疫临床特征。免疫保护试验结果显示,以该毒株制备的油乳灭活疫苗对雏番鸭进行3次免疫,免疫后42 d血清HI抗体几何平均滴度水平可达1∶238.9,能为番鸭提供有效保护。研究结果为水禽新城疫诊断与免疫防控研究提供了参考资料。

基因Ⅶ型新型疫苗的创制与我国新城疫的防控进展

基因Ⅶ型新型疫苗的研制历经数年,2011年进入临床实验,2014年获得国家一类新兽药证书,然后进行推广应用,该疫苗对我国家禽新城疫的防控起着很重要的推动作用。现在已经很难再分离到,从上个世纪九十年代以来一直是我们国家鸡群当中普遍存在的免疫鸡群极典型新城疫的流行基因型。本文将从新型疫苗创制背景与研究思路、新型疫苗主要技术发明点、新型疫苗应用成效和我国新城疫防控进展以及对我国新城疫的防控展望这几个方面进行讨论。

1株鸽源基因Ⅶ型新城疫强毒株的分离鉴定及全基因组分析

为进一步了解新城疫病毒(NDV)的遗传进化规律,从疑似NDV感染的鸽群中通过鸡胚接种分离出1株新城疫强毒株,将其命名为Pigeon/China/SHJD13/2017,经噬斑纯化后测定其鸡胚平均死亡时间(MDT)为57.2 h,1日龄雏鸡脑内致病指数(ICPI)为2,毒力指标属于强毒NDV。参考GenBank公布的NDV全基因组序列,共设计了11对引物,对其进行全基因组测序,序列测定结果显示:分离株属于基因Ⅶ型NDV,其基因组全长15192 bp,登录号为MK937786,F基因共包含553个aa,裂解位点的氨基酸残基为112 R-R-Q-K-R-F 117,符合NDV强毒株的分子特征。通过序列同源性比对分析,该分离株与鸡源强毒株Chicken/China/SDWF07/2011亲缘关系较近,表明该鸽源分离毒株可能来自于感染的鸡群。

新城疫LaSota活疫苗对基因Ⅶ型分离株的免疫保护性试验

从山东省发病鸡群分离鉴定了一株新城疫病毒（NDV），命名为SDLYOI。经蚀斑纯化后进行毒力测定和序列分析表明分离株SDLY01属于基因Ⅶ型NDV强毒。20只7日龄SPF鸡免疫新城疫活疫苗LaSota后14d{ff别用NDV标准强毒F48E8和分离株SDLYOI攻毒，同时设同日龄SPF鸡为对照组，未免疫任何疫苗。

基因Ⅶ型新城疫病毒母源抗体对雏鸡的免疫保护效果

为了解基因Ⅶ型新城疫病毒(NDV)母源抗体对雏鸡的免疫保护作用,对雏鸡母源抗体水平与种母鸡免疫抗体间的相关性、雏鸡母源抗体衰减规律以及不同母源抗体水平对雏鸡的免疫保护效果进行了研究。结果显示:雏鸡母源抗体水平与相应种母鸡的抗体水平基本一致,虽然1日龄雏鸡平均抗体滴度较相应种母鸡抗体滴度约低1.3 log2,但在其出生后最初几天内会稍有上升;雏鸡母源抗体半衰期为3.20 d;不同母源抗体水平雏鸡用基因Ⅶ型NDV强毒株攻毒后,死亡率与排毒率均随母源抗体滴度上升而呈下降趋势;母源抗体滴度达到7 log2时即对雏鸡产生95%以上的保护率,但各攻毒组均存在不同程度的排毒现象,即使其抗体滴度高达11 log2也不例外;母源抗体滴度为4 log2和5 log2的雏鸡可持续排毒至攻毒后27 d,个体排毒期为925 d,平均为15 d。

基因Ⅶ型新城疫病毒HN蛋白单克隆抗体的制备及特性研究

为制备基因Ⅶ型新城疫病毒(NDV)血凝素-神经氨酸酶蛋白(HN)的单克隆抗体(MAb),本研究利用JS/17病毒株的HN重组蛋白和活病毒分别免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)融合,并通过ELISA、间接免疫荧光和western blot方法筛选,制备了3株特异性识别HN蛋白的单克隆抗体(MAb)。其中,MAb1D4和4D9具有病毒中和活性(VN)及血凝抑制作用(HI),可以识别多种基因型的Ⅱ类NDV,但与Ⅰ类NDV病毒株无反应。MAb 2G8识别线性表位131DYIGGIGKE139,该表位在各病毒株中高度保守。获得的3株MAb可以用于NDV的鉴定及HN蛋白的功能研究。

一株基因Ⅶ型新城疫病毒的分离及分子鉴定

从一起新城疫暴发的病例中分离出 1株新城疫病毒 (NDV) ,命名为铜山分离株 (TS)。运用 RT- PCR技术 ,克隆了该分离株 F基因的重要功能片段 (约 0 .5 kb) ,并进行了序列测定。序列分析表明 ,TS分离株在 F蛋白裂解位点的氨基酸顺序为 1 1 2 - R- R- Q- K- R- F1 1 7,与 NDV强毒株特征相符 ,且具有 10 1处的 K(赖氨酸 )和 12 1处 V(缬氨酸 ) 2个特征性氨基酸 ,与基因 型

NDV基因Ⅶ型与基因Ⅱ型感染CEF后microRNA表达谱分析

本研究旨在探究新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)流行株HB株(基因Ⅶ型)与疫苗株La Sota株(基因Ⅱ型)在感染鸡胚成纤维细胞(Chicken embryo fibroblasts,CEF)36 h后宿主细胞microRNA(miRNA)表达谱变化情况。通过高通量测序技术分别对La Sota株与HB株感染CEF后36 h后的样本与参考鸡源基因组进行系统比对,筛选差异表达miRNA并对其靶基因进行GO功能注释以及KEGG通路富集。最后随机筛选5条miRNA通过实时荧光定量PCR(Real-time quantification PCR,RT-qPCR)进行验证。结果表明,La Sota与HB感染组中已知miRNA分别为56.9%和47.8%;La Sota与HB感染组通过差异性比较后共筛选出10条差异表达miRNA;通过对差异表达基因的靶基因进行GO与KEGG富集发现,其主要在细胞代谢、生物合成以及应激信号传导等通路上出现显著富集;RT-qPCR结果与RNA-seq结果趋势一致,证明了测序结果的可靠性。为进一步揭示不同NDV毒株感染CEF以及在感染过程中miRNA发挥的调控作用提供了研究基础。

基于F和HN蛋白的基因Ⅶ型新城疫病毒嵌合疫苗的构建及免疫效力评估

【目的】试验旨在构建一种基因Ⅶ型新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)嵌合疫苗,并对其免疫效力进行评估。【方法】利用反向遗传学技术,以含有禽偏禽腮腺炎病毒2型(Avian metaavulavirus-2,AMAV-2)Y2株基因组的重组质粒pT7-Y2为模板,将Y2株的F和HN蛋白的胞外区替换为基因Ⅶ型NDV HB0901株的F和HN蛋白的胞外区,将HB0901株的F蛋白裂解位点突变为LaSota弱毒株的F蛋白裂解位点,构建嵌合重组病毒rY2-FHNR株。对rY2-FHNR株的增殖特性、致病力及遗传稳定性等生物学特性进行检测,并通过接种2周龄SPF鸡评估rY2-FHNR株的免疫原性及其免疫血清与Y2株的交叉反应性,利用NDV NP蛋白的间接ELISA方法对免疫血清进行检测,验证其鉴别诊断效果。【结果】试验成功获得了嵌合重组病毒rY2-FHNR株,生物学特性检测结果显示,rY2-FHNR株在鸡胚中的增殖滴度和致病性符合弱毒特征,其鸡胚传代的遗传稳定性良好。rY2-FHNR株可诱导机体产生针对NDV的抗体,且免疫血清不与rY2株抗原发生交叉反应。通过NDV NP ELISA抗体检测方法可以实现区分疫苗免疫与野毒感染。【结论】本试验研发了一种基因Ⅶ型NDV嵌合候选疫苗,为基因Ⅶ型NDV的监测、防控和净化提供了技术支撑。

鸡新城疫基因Ⅶ型灭活标记疫苗(MG7株)最小有效免疫剂量的研究

为科学指导鸡新城疫基因Ⅶ型灭活标记疫苗(MG7株)的临床免疫剂量,通过测定免疫鸡HI抗体滴度和攻毒保护试验,进行了10日龄和30日龄SPF鸡最小有效免疫剂量的研究。动物实验使用10μL、20μL和40μL三种不同免疫剂量,免疫疫苗后21 d检测HI抗体效价,10日龄SPF鸡001批次疫苗HI抗体平均效价依次为4.8、6.2和6.5,攻毒保护率依次为80%、100%和100%,30日龄SPF鸡HI抗体平均效价依次为5.0、6.3和6.5,攻毒保护率依次为70%、100%和100%。结果表明,新城疫灭活标记疫苗(MG7株)HI抗体效价和保护效力呈正相关,免疫剂量与HI抗体效价和保护效力也呈正相关。用NDV基因Ⅶ型强毒G7株进行攻毒保护试验,两种日龄鸡在20μL的免疫剂量下,疫苗仍能达到良好的免疫保护效果。

基因Ⅶ型新城疫病毒分离鉴定及免疫原性研究

旨在分离筛选免疫原性好的新城疫病毒(NDV)流行毒株。从发病鸡组织中分离到4株病毒,经血凝和血凝抑制试验鉴定为NDV,进而完成致病指数测定、F基因高变区测序和遗传进化分析,并通过鸡胚交叉中和试验和攻毒试验研究PLK-N-06株对比La Sota疫苗株的抗原差异和免疫保护效力。结果显示,4个分离株的致病指数均属速发型NDV范围,且PLK-N-06株毒力最强;F蛋白裂解位点均为112R-R-Q-K-R-F117,符合强毒株特征。遗传进化分析表明,分离株均为Ⅶd亚型。交叉中和试验结果显示,PLK-N-06株和La Sota株存在显著的抗原性差异。用PLK-N-06株油乳剂灭活苗免疫接种SPF鸡后产生的HI抗体效价几何平均值为1∶338,显著高于La Sota疫苗(1∶69),且其对PLK-N-06株感染的排毒率为0/10,明显低于La Sota株油乳剂灭活苗的4/10,结果表明PLK-N-06株具有良好的免疫原性,为新城疫基因Ⅶ型新型疫苗的研发奠定了基础。

两种不同灭活剂对基因Ⅶ型新城疫病毒灭活效果的影响研究

本试验采用甲醛及β-丙内酯(BPL)对基因Ⅶ型新城疫病毒N07株进行不同时间的灭活处理,检验灭活效果,并将灭活后的病毒液乳化配苗,进行安全性和效力检验。结果表明:0.2%甲醛溶液37℃下作用16 h可将病毒液彻底灭活,血凝性降低;1∶2 000的β-丙内酯2~8℃下作用16~48 h可将病毒液彻底灭活,并保持良好的血凝性;将两种方法灭活的病毒液乳化配苗,接种SPF鸡,安全性良好,无不良反应;效力检验:新城疫HI抗体分别为1∶2^(8.0)和1∶2^(7.7),用N07毒株攻毒,均能100%保护。

基因Ⅶ型NDV强毒株F基因重要功能区的克隆与序列分析

运用一步法RT-PCR扩增两株高致病力NDV分离株的F基因重要功能区,并进行序列测定。序列分析表明其在F蛋白裂解位点氨基酸顺序均为112R-R-Q-K-R-F117,与NDV的强毒株特征相符,且具有101位的K(赖氨酸)和121位V(缬氨酸)两个特征性氨基酸,与基因Ⅶ型NDV的特征完全相符[1]。与疫苗株lasota进行序列比较,并构建了系统发育树,结果表明两株病毒核苷酸同源性达96.6%,与lasota同源性为63.7%,从分子水平揭示了这两个毒株抗原性与常用疫苗株Lasota差异较大的原因。

基因Ⅶ型新城疫新型疫苗的创制与应用

中国工程院院士、扬州大学教授刘秀梵领衔完成的项目“基因Ⅶ型新城疫新型疫苗的创制与应用”获2019年度国家技术发明奖二等奖。该项目有几大创新:发明了新城疫病毒遗传进化快速分析系统,首次明确了新城疫病毒流行株优势基因型及其致病机制,为新城疫的精准防控提供了科学依据;发明了基因Ⅶ型新城疫病毒疫苗株,解决了原有疫苗株与流行株之间基因型和抗原性不匹配问题;发明了国际上第一个注册的基因Ⅶ型新城疫灭活疫苗,解决了免疫鸡群非典型新城疫和鹅新城疫防控重大问题。

一株新城疫基因Ⅶ型病毒株的分子生物学鉴定

从鹤壁某患病鸡群中分离到一株病毒（ＨＢ９７），该病毒用单克隆抗体鉴定为新城疫强毒株。但其抗原性与新城疫Ｆ４８Ｅ８株有明显差异。经过对Ｆ基因的扩增、克隆、测序及与其他毒株的 Ｆ基因序列比较，表明该毒株为新城疫基因Ⅶ型。这为更好地控制和预防新城疫提供了依据。

重组基因Ⅶ型新城疫病毒疫苗候选株的构建

新城疫是我国必须控制和净化的传染病之一,疫苗免疫是防控疾病的重要手段。为获得抗原性匹配的疫苗株,以新城疫LaSota疫苗株为骨架,替换当前流行的基因Ⅶ型毒株GM株的主要抗原性相关基因F(Fusion)和HN(Hemagglutinin-neuraminidase),拯救获得重组病毒rLa-mGM。生物学特性测定表明,重组毒株的MDT为160 h,ICPI为0,EID_(50)为10^(-8.4)/0.2 mL。将rLa-mGM株繁殖后以10^(8.0) EID_(50)制备灭活疫苗,与商品化LaSota疫苗各免疫10只25日龄SPF鸡,0.2 mL/只。免疫后14天,其血清平均HI效价为7.6log2,商品化LaSota疫苗免疫鸡的血清平均HI效价为7.4log2。结果表明重组病毒免疫原性良好,可作为疫苗候选株。