表达基因Ⅶ型新城疫病毒F蛋白重组LaSota疫苗株的构建

基因Ⅶ型新城疫病毒(NDV)为我国NDV的主要流行病毒株,而经典疫苗株LaSota不能对鸡群起到有效的免疫保护。为研发针对NDV基因Ⅶ型流行病毒株的疫苗,本研究采用反向遗传操作技术,将LaSota的F基因编码区(CDS)替换为基因Ⅶ型流行病毒株CK/CH/LHLJ/1/06株的F基因CDS,并将替换后的F蛋白的裂解位点突变为LaSota的裂解位点,构建重组质粒pNDFLsp-mF。将pNDFLsp-mF与表达NP、P和L蛋白的辅助质粒共转染BSR-T7/5细胞,拯救获得表达基因Ⅶ型NDV F蛋白的重组病毒(rLaSota-mF)。生长曲线结果显示,与LaSota相似,rLaSota-mF能够在鸡胚中有效复制,病毒滴度EID50为109.375/0.1 mL。生物学特性测定结果显示rLaSota-mF的MDT为144.6 h,表明其为低毒力病毒株。将拯救获得的病毒连续传15代后所替换的基因及突变的位点能够在r LaSota-mF中稳定存在。本研究为研究与开发针对NDV不同基因型流行病毒株的疫苗奠定基础。

表面展示基因Ⅶ型新城疫病毒F蛋白胞外区细菌样颗粒的构建与鉴定

为了构建及鉴定表面展示新城疫病毒F蛋白胞外区细菌样颗粒。首先应用RT-RCR和PCR技术分别扩增F蛋白胞外区编码基因片段和乳酸乳球菌肽聚糖锚钩蛋白(protein anchor,PA)基因片段,通过融合技术将F蛋白胞外区编码基因与PA基因融合,然后利用pET-30a(+)质粒构建重组原核表达质粒,将其转化大肠杆菌BL-21(DE3),进行诱导表达,获得目的蛋白;用热酸处理乳酸乳球菌获得裸露的细菌样颗粒(BLPs),通过透射电镜进行鉴定;最后将复性后的F-PA蛋白与BLPs颗粒结合,经过SDS-PAGE、Western blot、细菌间接免疫荧光进行结合鉴定,并分析其结合效果灰度值判断其结合效率。结果显示,目的蛋白均能正确表达,成功制备出裸露的BLPs,目的蛋白复性后可与BLPs进行结合,其结合效率为1 U的BLPs与130 μg的F-PA蛋白结合。成功构建出表面展示基因Ⅶ新城疫病毒F蛋白胞外区BLPs,为后续研究新城疫亚单位黏膜疫苗奠定了基础。

表达基因Ⅶ型新城疫病毒F蛋白的重组鸡痘病毒的构建和筛选

为了构建并筛选表达新城疫病毒(NDV)F蛋白的重组鸡痘病毒(rFPV-F),通过PCR扩增F基因,克隆至pMD18-T Simple载体,进行DNA序列分析和遗传进化关系分析。将测序正确的F基因克隆至笔者所在实验室自行构建的新型鸡痘病毒穿梭载体pTS2GFPV150中,获得重组质粒pTS2GFPV150-F。然后将其与鸡痘病毒FPV282E4株共转染鸡胚成纤维细胞进行同源重组,挑取表达增强型绿色荧光蛋白的噬斑,经多轮筛选获得重组病毒rFPV-F,应用PCR、RT-PCR、Western-blot等方法对重组鸡痘病毒进行鉴定。结果显示,成功获得NDV F基因及重组F基因的鸡痘病毒rFPV-F,并证实F基因已被整合到鸡痘病毒基因组中,且在感染细胞内被成功表达。本研究成功获得了1株表达NDV F基因的重组鸡痘病毒,为下一步开展动物体内免疫研究奠定了基础。

一株基因Ⅶb亚型新城疫病毒F和HN基因的序列分析

为分析从某鹅病料样品中分离鉴定的一株新城疫病毒(NDV)(Goose/Foshan/2010)F和HN基因的序列特征,本研究采用RT-PCR方法扩增该病毒的F和HN基因的ORF序列,并进行序列测定。经序列比对、进化分析表明,Goose/Foshan/2010株属于基因Ⅶb亚型病毒株,F蛋白裂解位点序列为112RRQKRF117,HN蛋白由571个氨基酸残基组成,具有强毒株分子特征。对F和HN蛋白分析表明,其HN蛋白存在E347D和K495E两个点突变;此外,HN蛋白缺失了538位～540位的糖基化位点。该分离株为我国首次报道的鹅源基因Ⅶb亚型NDV分离株,与秘鲁及马来西亚早期基因Ⅶb亚型分离株进化关系密切,表明我国目前新城疫的流行情况十分复杂。

鸡基因Ⅶ型新城疫病毒HB-2株F基因真核表达载体的构建及表达

为了研究基因Ⅶ型新城疫病毒(NDV)基因疫苗,试验采用含有NDV HB-2株F基因的pBS-T载体,用核酸内切酶消化后克隆入真核表达质粒pcDNA3.1(+),构建真核表达质粒pcDNA3-F,用该重组质粒转染非洲绿猴肾细胞(Vero细胞),经间接免疫荧光检测证明F基因在Vero细胞中得到较高水平的表达,在荧光显微镜下能观察到较强的荧光。结果表明:体外表达的F蛋白具有良好的反应原性。

35株不同来源的新城疫病毒(NDV)分离株F-糖蛋白基因序列测定和基因型

采用病毒分离试验、鸡胚平均死亡时间毒力试验、RT- PCR和 F-糖蛋白基因序列测定及基因分析 ,对 1996～2 0 0 0年从国内不同地区多种禽类中分离到的新城疫病毒 (NDV)分离毒株进行了研究 ,绘制了基因树。毒力试验结果表明 ,其中有 32株为强毒株 ,有 3株为中等毒力株。DNA序列分析和基因树结果表明 ,这 35株 NDV分为 4个类群 ,其中 2 7株为基因 型 (主要流行毒株 ) ,3株为基因 型 ,4株为基因 型 ,1株为基因 型。结果提示 ,我国新城疫感染来源是一个值得关注的问题。

基因Ⅶ型新城疫病毒HN蛋白单克隆抗体的制备及特性研究

为制备基因Ⅶ型新城疫病毒(NDV)血凝素-神经氨酸酶蛋白(HN)的单克隆抗体(MAb),本研究利用JS/17病毒株的HN重组蛋白和活病毒分别免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)融合,并通过ELISA、间接免疫荧光和western blot方法筛选,制备了3株特异性识别HN蛋白的单克隆抗体(MAb)。其中,MAb1D4和4D9具有病毒中和活性(VN)及血凝抑制作用(HI),可以识别多种基因型的Ⅱ类NDV,但与Ⅰ类NDV病毒株无反应。MAb 2G8识别线性表位131DYIGGIGKE139,该表位在各病毒株中高度保守。获得的3株MAb可以用于NDV的鉴定及HN蛋白的功能研究。

一株基因Ⅶ型新城疫病毒的分离及分子鉴定

从一起新城疫暴发的病例中分离出 1株新城疫病毒 (NDV) ,命名为铜山分离株 (TS)。运用 RT- PCR技术 ,克隆了该分离株 F基因的重要功能片段 (约 0 .5 kb) ,并进行了序列测定。序列分析表明 ,TS分离株在 F蛋白裂解位点的氨基酸顺序为 1 1 2 - R- R- Q- K- R- F1 1 7,与 NDV强毒株特征相符 ,且具有 10 1处的 K(赖氨酸 )和 12 1处 V(缬氨酸 ) 2个特征性氨基酸 ,与基因 型

新城疫病毒(长春株)F蛋白基因的克隆和序列分析

新城疫病毒（ＮＤＶ）长春株在鸡胚增殖后纯化，提取ＲＮＡ，然后利用特异性引物，经ＲＴ－ＰＣＲ一次性扩增出了ＮＤＶ长春株的全长Ｆ基因。将该Ｆ基因插入ｐＫＳ（－）后，进行了序列测定。序列分析表明，该Ｆ基因核苷酸长度为１７５８ｂｐ，编码５５３个氨基酸，序列中有６个糖基化位点，１３个半胱氨酸残基，裂解位点区（１１２～１１７）氨基酸序列为Ｇｌｙ－Ａｒｇ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙ－Ａｒｇ－Ｌｅｕ，与所有弱毒株在这一区域的序列（Ｇｌｙ－Ａｒｇ／Ｌｙｓ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙ／Ｓｅｒ－Ａｒｇ－Ｌｅｕ）相符，证明长春株为弱毒株。同源性分析表明，长春株Ｆ基因与目前国外发表的其他ＮＤＶＦ基因相比，核苷酸序列同源性在８８％～９９％之间。

新城疫病毒(青岛株)F蛋白基因的克隆和序列分析

参考新城疫病毒 ( NDV)长春株的 F基因序列设计了 1对特异性引物 ,应用 RT-PCR对 NDV青岛株(野毒 )的 F基因进行了扩增 ,扩增产物克隆后测序。扩出的 F基因核苷酸长度为 792 bp,编码 2 6 1个氨基酸 ,包括完整的 F2片段和部分 F1片段。裂解位点区 ( 1 1 2～ 1 1 7aa)氨基酸序列为 Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Phe,与国外发表的强毒株序列相符 ,证明青岛株为强毒株。根据该基因推导的氨基酸序列 ,与国内外发表的 NDVF蛋白氨基酸序列相比 ,同源性为 88.1 %～ 94 .3%。

云南2株基因Ⅱ型新城疫病毒F基因变异特性分析

对云南省2个发病鸡场的组织病料进行病原分离，通过血凝、血凝抑制试验和RT-PCR检测，证明分离毒株为新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）。采用特异性引物经RT-PCR扩增F基因，纯化后克隆至pMD18-T载体，并对其进行测序。序列比对及系统发育分析结果表明，分离获得的云南省2株NDV毒株F基因核苷酸与La Sota株的核苷酸同源性为99．4％～99．6％，与国内外分离的流行毒株SP13和NDV027344核苷酸同源性均为99．7％～99．8％，与F48E9株的核苷酸同源性为89．0％～89．1％；F蛋白氨基酸与La Sota株的氨基酸同源性为99．3％～99．5％，与流行毒株SP13和NDV027344的氨基酸同源性均为99．5％～99．6％，与F48E9株的氨基酸同源性为91．8％～92．0％。系统发育分析结果表明，2株病毒均属于基因Ⅱ型，裂解位点氨基酸为G-R-Q-G-R L，属于弱毒株裂解位点氨基酸排列特征。

基因Ⅶ型新城疫病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立

根据基因ⅤⅡ型新城疫病毒F基因裂解位点特征设计一对引物和TaqMan探针,建立一种敏感、特异、重复性良好的基因ⅤⅡ型毒株荧光定量RT-PCR鉴别检测方法。以体外转录法制备的cRNA标准品为标准阳性模板,构建标准曲线,并进行各项指标的检测。结果表明,建立的方法特异性良好,最低可检测到102拷贝·μL-1的模板RNA,敏感性比普通RT-PCR高100倍。本试验建立了基因ⅤⅡ型新城疫病毒荧光定量RT-PCR检测方法,且该方法能够鉴别检测常规方法不能区分的新城疫病毒基因ⅤⅡ型强毒株,表明本研究建立的方法可用于此种基因型毒株的快速鉴别检测。

番鸭源新城疫病毒F蛋白基因的克隆及序列分析

利用RT-PCR技术对番鸭源新城疫病毒FP1/02株的F蛋白基因进行分段扩增、定向克隆到pMD 18-T SimpleVector质粒载体,然后测定其核苷酸序列,拼接出F基因全序列,并推导出其相应的氨基酸序列.FP1/02株的F蛋白基因全长1690 bp,编码553个氨基酸,其裂解位点的氨基酸序列为112R-R-Q-K-R-F117,具有强毒株特有的氨基酸序列结构特征.核苷酸序列分析结果表明,FP1/02株与其他不同源新城疫病毒毒株之间的核苷酸序列同源性为87.2%～93.3%.

2014-2018年我国5株基因Ⅶ型新城疫病毒的基因组特性

为了解我国基因Ⅶ型新城疫病毒的分子生物学特性,对2014-2018年分离的5株基因Ⅶ型新城疫病毒代表株进行了基因组测序和生物信息学分析。序列分析显示:5株病毒F蛋白裂解位点为112RRQKR/F117或112RRRKR/F117,具有强毒株的典型特征;病毒基因组长度均为15 192 nt,其F蛋白融合肽、七肽重复区和跨膜区,以及HN蛋白跨膜区、中和抗原表位等功能区有多处氨基酸变异。病毒F基因遗传进化分析显示:2014-2015年分离的2株病毒属于基因Ⅶ.1.1亚型;2016-2018年分离的3株病毒属于基因Ⅶ.2亚型,暗示此亚型毒株可能已逐步取代基因Ⅶ.1.1亚型,成为家禽中的优势流行毒株。本研究进一步掌握了我国基因Ⅶ型新城疫病毒的遗传特性,从而为科学防控该病提供了参考。

一株基因Ⅱ型新城疫病毒的检测及HN、F基因序列分析

为了掌握辽宁省新城疫病毒(NDV)的分布特点,试验采用新城疫荧光RT-PCR方法检测到1株新城疫病毒,通过接种鸡胚分离鉴定后将其命名为CK/YK1/2013,通过PCR扩增得到HN、F基因全长片段并测定了基因序列。结果表明:该毒株可以使接种鸡胚在38 h内死亡,具备强毒株的生物学特性。CK/YK1/2013的F基因在裂解位点的氨基酸序列为111GGRQGRL117,与弱毒株LaSota序列相同,与其他已知强毒株的裂解位点不同。CK/YK1/2013的HN、F基因与Ⅱ型LaSota毒株的同源性为99.6%,与F48E9及Ⅶ型的同源性分别为89.1%和83.0%,基因进化树分析表明该毒株属于Ⅱ型NDV。

番鸭源基因Ⅶ型新城疫病毒的生物学特性和免疫原性评价

为了解我国近年水禽主要流行的基因Ⅶ型新城疫病毒的生物学特性和免疫原性,通过攻毒试验和免疫保护试验测定了1株本实验室分离保存的番鸭源基因Ⅶ型新城疫病毒MDK/FS-SS/E/2007的致病指数、雏番鸭致病性和免疫保护性等特征。致病指数评价结果显示,该毒株符合新城疫病毒强毒株标准。雏鸭致病试验结果显示,攻毒组动物均出现沉郁、瘫痪和扭颈等神经症状,剖检可见脑部充血、出血,胰腺、脾脏和肝脏等器官出现变性坏死等典型新城疫临床特征。免疫保护试验结果显示,以该毒株制备的油乳灭活疫苗对雏番鸭进行3次免疫,免疫后42 d血清HI抗体几何平均滴度水平可达1∶238.9,能为番鸭提供有效保护。研究结果为水禽新城疫诊断与免疫防控研究提供了参考资料。

鸡新城疫病毒山东分离株F蛋白基因的克隆与鉴定

鸡新城疫病毒 (NDV)山东分离株在鸡胚增殖后纯化 ,利用特异性引物 ,经RT -PCR技术扩增出了F基因重要功能片段 ,将该基因克隆入pGEM -T载体后 ,对其进行酶切分析和序列测定 ,结果表明 ,山东分离株为强毒株。与多株已报道的NDV参考株相应片段进行序列比较 ,经遗传基因进化树分析 。

重组鸡白细胞介素18对不同基因型新城疫病毒HN基因表达蛋白免疫活性的影响

白细胞介素18（IL-18）是被广泛研究的细胞因子佐剂之一。研究选择了IL-18作为纯化蛋白多肽的佐剂，观察其对多肽疫苗的免疫应答作用，从而为研制新型的多肽疫苗奠定一定的理论基础。

基因Ⅶ型新城疫病毒母源抗体对雏鸡的免疫保护效果

为了解基因Ⅶ型新城疫病毒(NDV)母源抗体对雏鸡的免疫保护作用,对雏鸡母源抗体水平与种母鸡免疫抗体间的相关性、雏鸡母源抗体衰减规律以及不同母源抗体水平对雏鸡的免疫保护效果进行了研究。结果显示:雏鸡母源抗体水平与相应种母鸡的抗体水平基本一致,虽然1日龄雏鸡平均抗体滴度较相应种母鸡抗体滴度约低1.3 log2,但在其出生后最初几天内会稍有上升;雏鸡母源抗体半衰期为3.20 d;不同母源抗体水平雏鸡用基因Ⅶ型NDV强毒株攻毒后,死亡率与排毒率均随母源抗体滴度上升而呈下降趋势;母源抗体滴度达到7 log2时即对雏鸡产生95%以上的保护率,但各攻毒组均存在不同程度的排毒现象,即使其抗体滴度高达11 log2也不例外;母源抗体滴度为4 log2和5 log2的雏鸡可持续排毒至攻毒后27 d,个体排毒期为925 d,平均为15 d。

4株鹅源新城疫病毒融合蛋白基因的克隆及序列分析

测定了 4株鹅源新城疫病毒 (NDV)融合蛋白 (F)基因 5’端 1 70 0核苷酸片段的序列 ,并由此推导了F蛋白氨基酸序列 ,并对鹅源NDV的基因型分类地位进行探讨。结果表明 ,4株病毒F基因的同源性大于 97% ,与DNV标准强毒株F48E8F基因的同源性为 86 0 %～86 8% ,F基因转录起始序列及起始密码子位置与已知NDV完全相同 ;F蛋白具有和已知NDV相似的各种功能区 ,F蛋白前体F0裂解位点附近的氨基酸序列为112 RRQKRF117,符合NDV强毒株的特征。对F基因第 3 3 4～ 1 6 82位核苷酸之间 3种限制性内切酶HinfⅠ、BstoⅠ、RsaⅠ酶切图谱的分析表明 。