CRISPR/Cas系统在基因修饰植物及其产品检测应用中的原理和进展

转基因及基因编辑的基因修饰植物发展迅猛,相关的检测技术也面临更多挑战,尤其是对于无外源DNA引入的基因编辑产品,其检测难度更高,传统的检测技术已无法满足。基于CRISPR/Cas检测系统中不同Cas蛋白所具有的附属非特异切割活性被广泛应用于分子检测领域,它与LAMP和RPA等温扩增相结合可实现准确快速的现场检测,甚至是对单核苷酸突变的基因编辑产品识别和检测。但是,该检测系统在植物基因修饰产品检测中的应用才刚刚起步,本文对该检测系统的原理及其在基因修饰的植物及其产品中的应用进行了评述。

转基因番茄可食防龋疫苗免疫大鼠的实验研究

目的用表达变异链球菌表面蛋白PAcP和霍乱毒素B亚单位融合蛋白的转基因番茄免疫SD大鼠,检测其免疫原性,探索研制安全、有效的可食用防龋疫苗的可能性。方法选择雌性SD大鼠18只,建立龋齿模型,随机分成3组(n=6),分别为转基因番茄组(实验组)、变异链球菌灭活全菌免疫组(阳性对照组)、非转基因番茄组(阴性对照组),免疫方式为灌胃免疫,每周免疫1次,连续免疫4周。分别于首次免疫前1d和每次免疫1周后采集血液、唾液样品,用酶联免疫吸附实验法检测血清中免疫球蛋白G(IgG)、唾液中分泌型免疫球蛋白A(SIgA)抗体水平;鼠龄70d时处死动物,并取上下颌骨进行龋齿计分。结果免疫后,实验组和阳性对照组大鼠血清中IgG、唾液中SIgA抗体水平与阴性对照组比较差异有统计学意义(P<0.05);实验组和阴性对照组在Dx级外的各级差异有统计学意义(P<0.05)。结论转基因番茄防龋疫苗具有免疫原性,能够诱导实验动物产生有效的免疫应答,降低龋齿的发生。

转基因大豆的PCR-免疫层析筛查方法研究初探

目的建立转基因大豆的PCR-免疫层析(PCR-ICT)快速筛查新技术。方法利用转基因植物通常含有的CaMV35S启动子作为转基因成分的筛查标记,根据其序列设计特异性引物和探针,分别用生物素和地高辛标记,用胶体金免疫层析技术检测并鉴定PCR产物。结果用新建立的PCR-ICT方法可以检出含0.5%转基因大豆的标准品,对大豆样品的检测结果与琼脂糖凝胶电泳检测结果一致。结论PCR-ICT方法通过DNA杂交和金标显色来同时检测、鉴定PCR产物,可以简便、快速地筛查转基因产品。

细粒棘球绦虫转基因植物载体重组pBI—Eg95质粒构建及鉴定

目的构建并鉴定细粒棘球绦虫（Eg）转基因植物载体重组pBI—Eg95质粒。方法从细粒棘球蚴包囊中分离原头节，经超声粉碎后抽提总RNA，反转录成cDNA，设计合成引物，以cDNA为模板，通过PCR从cDNA中扩增出目的基因Eg95，经电泳及测序鉴定后。将该基因定向克隆到植物表达载体pBI121中构建pBI—Eg95重组质粒，电穿孔转化根癌农杆菌（At）LBA4404株；从转化的At阳性株中抽提质粒进行双酶切和以抽提的质粒为模板进行PCR鉴定。结果RT—PCR扩增出1条约471bp的特异性条带．DNA序列分析与GenBank已知的序列同源性为100％，从转化的At中抽提的质粒，双酶切及PCR测定的结果与预期相符。结论成功构建了细粒棘球绦虫转基因植物载体重组pBI—Eg95质粒，为进一步构建细粒棘球绦虫转基因植物疫苗奠定了基础。

转基因植物乙型肝炎疫苗的研究进展

自Mason等首次报道转基因烟草表达HBsAg以来,可表达抗原的范围和宿主植物的种类得到了快速扩展,HBsAg在多种植物中获得表达.植物合成的HBsAg可形成病毒样颗粒,与酵母及哺乳动物细胞来源的乙型肝炎（乙肝）疫苗具有相似的结构和免疫原性,经注射或口服接种可在动物和人体中诱导免疫应答.口服植物源性乙肝疫苗能诱导体液及黏膜免疫应答,作为黏膜疫苗可以扩大现行注射用重组疫苗保护性应答的范围,是安全、廉价和接种简便的新型候选乙肝疫苗.此文主要介绍乙肝疫苗在转基因植物中的表达及其免疫原性的研究进展.

细粒棘球绦虫转Eg95-EgA31融合基因苜蓿疫苗诱导小鼠脾细胞亚群的变化

目的 探讨细粒棘球绦虫（Eg）转Eg95-EgA31融合基因苜蓿疫苗免疫和Eg原头节攻击后小鼠脾CD4＋和CD8＋T淋巴细胞亚群的变化.方法 热絮凝法提取转基因苜蓿叶蛋白,用无菌双蒸水将叶蛋白提取液配成20 g/L,同时提取转空质粒（pBI121）苜蓿叶蛋白及正常苜蓿叶蛋白作对照.32只雌性Balb/c小鼠按体质量随机分为4组,每组8只.口服灌胃组：灌胃接种100 μl转基因苜蓿叶蛋白提取液 鼻腔黏膜接种组：滴鼻接种10 μl转基因苜蓿叶蛋白提取液 空质粒对照组：滴鼻接种10μl转空质粒苜蓿叶蛋白提取液 正常蛋白对照组：灌胃接种100μl正常苜蓿叶蛋白提取液.小鼠每3天免疫1次,连续免疫2个月.末次免疫后第8周,各组小鼠用Eg原头节腹腔注射攻击感染（50个/只）,感染后第24周剖杀小鼠,分离脾细胞,用流式细胞仪检测脾CD4＋和CD8＋T淋巴细胞亚群百分比.结果 口服灌胃组小鼠脾CD4＋T细胞亚群百分比（0.286±0.009）、CD8＋ T细胞亚群百分比（0.102±0.004）和CD4＋/CD8＋比值（2.814±0.014）均显著高于正常蛋白对照组（0.166±0.018、0.083±0.006、2.019±0.369,P〈0.01或〈0.05） 鼻腔黏膜接种组小鼠脾CD4＋T细胞亚群百分比（0.269±0.016）和CD4＋/CD8＋比值（2.955±0.986）与正常蛋白对照组比较明显升高（P均〈0.01） 口服灌胃组小鼠脾CD4＋T细胞亚群百分比高于鼻腔黏膜接种组（P〈0.05） 空质粒对照组小鼠脾CD4＋、CD8＋T细胞百分比和CD4＋/CD8＋比值（0.169±0.018、0.093±0.019、1.852±0.188）与正常蛋白对照组比较,差异无统计学意义（P均〉0.05）.结论 CD4＋T细胞亚群可能与细粒棘球绦虫转Eg95-Eg31融合基因苜蓿疫苗诱导的小鼠抗Eg原头节攻击感染的保护力有关.疫苗灌胃接种可能是一种较好的免疫途径.

植物制剂防治自身免疫性疾病研究进展

植物转基因技术是一种新兴的技术手段，它给低成本、大规模生产重组蛋白带来了广阔的前景。此文综述了目前该领域中应用的各种蛋白表达技术，并对植物疫苗在预防和治疗自身免疫病方面的研究进展，尤其对口服自身抗原诱导机体免疫耐受予以重点介绍。

分子农业：利用植物生产药物

随着分子农业（molecular pharming）研究领域的不断扩大，利用植物生产免疫球蛋白、酶、病毒样颗粒和疫苗的研究已成为主要焦点。2012年9月21日，由EuroSciCon主办的”分子农业——利用植物生产药物的最新进展”会议在英国召开。这次会涉及生物制药的各个研究热点，包括单克隆抗体、病毒样颗粒（如登革病毒和人乳头瘤病毒）在叶绿体表达系统瞬时表达、红花籽生产载脂蛋白、新型生产平台（如通过水培法使马铃薯根部分泌）等。此文对该研究领域中有启发性的研究报告进行了概述。

重组人凝血因子Ⅶ的研究进展

人凝血因子Ⅶ（human coagulation factorⅦ,hFⅦ）是参与血液凝血级联反应的蛋白之一,在凝血过程中发挥极其重要的作用.hFⅦ主要用于治疗和预防先天性或获得性血友病患者的出血,还可用于非血友病患者的创伤性大出血.通过基因工程技术制备hFⅦ不仅安全,而且还易于大规模生产.已有文献报道在利什曼原虫、昆虫细胞、多种哺乳动物细胞以及转基因兔乳腺中成功表达重组hFⅦ.因此,开发能高效表达重组hFⅦ的表达系统,将使大规模生产hFⅦ成为可能.