长距离PCR技术检测重型血友病甲Ⅷ因子基因倒位的进一步研究及推广应用

将已研究成功的长距离ＰＣＲ（ＬＤＰＣＲ） 技术［３］在热循环条件、模板ＤＮＡ用量及ｄＮＴＰ用量等方面进行了进一步优化和探索。应用优化后的ＬＤＰＣＲ技术检测了来自天津、江苏、北京、湖北、四川等省市１０８个重型血友病甲家系共１５７ 份ＤＮＡ（患者１０５人， 家属５２人）， 发现４７例患者（或家系） 有凝血因子Ⅷ（ＦⅧ） 基因倒位， 占重型患者的４４％ ； 查出基因倒位携带者３０ 余名。用ＬＤＰＣＲ检测ＦⅧ基因倒位的技术可以准确、简便、快速地直接进行重型血友病甲的基因诊断、携带者检测及产前诊断。

75例血友病A患者内含子22及1基因倒位情况分析

目的:观察血友病A(HA)患者凝血因子Ⅷ(FⅧ)基因内含子22倒位和内含子1倒位情况。方法:取75例HA患者静脉血,采用长距离PCR扩增技术(LD-PCR)检测内含子22和内含子1倒位情况,观察两种内含子倒位发生率,同时观察内含子22倒位在重型HA中的比例,比较有家族史和无家族史HA患者内含子22倒位发生率。结果:检出22号内含子倒位患者27例,检出率36%(27/75),全部为HA重型患者,占重型血友病A患者的57.4%(27/47);27例中有21例有家族史,有家族史患者内含子22号倒位的发生率高于无家族史患者(P<0.05);检出内含子1倒位1例,占1.3%(1/75)。结论:FⅧ基因内含子22倒位患者患重型HA的几率较高,内含子22倒位检测在重型HA的基因诊断中具有重要意义。

长距离PCR检测重型血友病A病人凝血因子Ⅷ基因倒位

为了筛查山东省重型血友病A(hemophiliaA ,HA)凝血因子Ⅷ基因倒位的患者并检出携带者 ,采用长距离DNA扩增 (LD PCR)方法 ,以 0 .6 %琼脂糖凝胶电泳技术 ,检测临床上确诊的 5 5例重型HA患者及其家系成员中是否存在凝血因子Ⅷ (FⅧ )基因倒位。电泳出现 11kb带 ,示凝血因子Ⅷ基因倒位 ;12kb带 ,示非倒位 ;这两条带同时出现者为凝血因子Ⅷ基因倒位携带者。结果表明 :5 5例无亲缘关系的重型HA患者中 ,发现 2 2例患者 (或家系成员 )有凝血因子Ⅷ基因倒位 ,占重型HA患者的 4 0 % ;15个家系中查出基因倒位携带者 5名。结论 :运用LD PCR技术可以准确、简便、快速地检测重型血友病A患者是否存在凝血因子Ⅷ基因倒位。

凝血因子Ⅷ基因倒位在重型血友病A遗传咨询中的意义

血友病A系凝血因子Ⅷ(FⅧ)缺陷所致的常见遗传性出血性疾病。该类病人及其亲属的遗传咨询——即如何鉴定患者家庭成员中的女性携带者或对胎儿作出产前诊断,仍是临床血液学经常面临的问题。有关血友病A携还者鉴定及产前诊断的研究及应用,近十余年来主要聚焦点在两个方面:①FⅧ基因内或基因附近的限制性片段长度多态性(RFLP)分析及与FⅧ基因相关的衔接重复序列可变数目检测——即基因追踪观测;

因子Ⅷ基因倒位的检测与血友病甲的分子诊断

应用Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交技术，分析了３６个无亲缘关系的血友病甲家系共９８名成员的凝血因子ＶＩＩＩ（ＦＶＩＩＩ）基因倒位。１２个（３３．３％）家系显示内含子２２倒位，其中１０个为远端倒位，２个为近端倒位。此１２例皆为重型患者，占全部２３例重型患者的５２．２％，证实ＦＶＩＩＩ基因倒位是中国人重型血友病甲最重要的分子缺陷。ＦＶＩＩＩ基因倒位分析既可以揭示血友病甲患者的分子缺陷，又可以直接用于血友病甲的分子诊断。

纳米孔测序技术在血友病A患者基因倒位检测的应用

目的探讨纳米孔测序技术在检测血友病A倒位的可行性。方法采集临床上已经明确为血友病A倒位携带者的外周血样,提取基因组DNA,应用纳米孔测序技术进行测序和生物信息学分析家系携带者的基因变异情况。结果纳米孔测序结果显示,家系1的先证者外甥女为血友病A Inv22携带者,家系2的先证者母亲为血友病A Inv1携带者,与临床诊断结果一致,且精确定位倒位的断裂位点。此外,对测序结果进行统计分析发现,携带者的基因组存在大量的结构变异如缺失、重复、插入、倒位和易位等。结论纳米孔测序技术可用于血友病A倒位的基因变异分析,并为基因倒位导致相关遗传疾病的诊断提供可选择的方法。

用长距离PCR技术检测江西籍重型血友病甲Ⅷ因子基因倒位基因

目的用长距离PCR(LD-PCR)技术检测江西籍重型血友病A(hemophiliaA,HA)有无Ⅷ因子基因倒位。方法用Bigg′s一期法检测血浆凝血因子FⅧ活性(FⅧ:C),LD-PCR方法,以0.6%琼脂糖凝胶电泳技术,检测55例江西籍重型HA进行凝血因子Ⅷ(FⅧ)倒位基因,电泳出现11kb带,示FⅧ基因倒位;12kb带,示非FⅧ倒位,这两条带同时出现者为FⅧ倒位基因携带者。结果检测30例无亲缘关系的重型HA患者中,发现11例患者(或家属成员)有FⅧ倒位基因,占重型HA患者的36.7%;9家系中查出基因倒位携带者4名。结论LD-PCR技术结合血浆FⅧ:C可快速、准确检测重型血友病FⅧ基因倒位。

FⅧ基因倒位与血友病甲

最近发现F Ⅷ基因的内含子22倒位是约半数重型血友病甲(HA)患者的共同分子缺陷。由F Ⅷ基因内含子22内的F ⅧA基因拷贝与F Ⅷ基因上游约500kb处的两个FⅧA基因拷贝之一发生同源重组在Xq28所引入的大片段。DNA倒位把F Ⅷ基因分成两半,从而导致重型HA。倒位可以通过Southern印迹杂交技术检测。这一发现明确了一类HA的分子机制,并且为这类HA的携带者检测和产前诊断提供了一个直接方法,具有重要的应用价值。

重型血友病A凝血因子Ⅷ第1号内含子倒位的研究进展

近年来发现凝血因子Ⅷ基因第1号内含子倒位是仅次于第22号内含子倒位、导致重型血友病A的常见原因。现就引起重型血友病A的凝血因子Ⅷ第1号内含子倒位的分子机制、检测方法及与抗体形成关系的研究进展作一综述。

重型血友病甲基因诊断新技术的研究及其应用

运用长距离ＤＮＡ扩增技术（ＬＤ－ＰＣＲ）成功地检测出凝血八因子ＦⅧ基因倒位缺陷患者，并检出该倒位的女性携带者。在建立并完善上述技术之后，对５３份ＨＡ患者及家系成员的ＤＮＡ标本进行了双盲试验，检出ＦⅧ倒位者２３份，野生型２７份，携带者３份。结果与用Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交技术检测的结果完全一致，说明运用本ＬＤ－ＰＣＲ技术检测ＦⅧ基因倒位的灵敏度与准确率均达到百分之百。运用这一新技术，完成了５个重型血友病甲家系的基因诊断。共检出３例基因倒位者，４位女性倒位基因的携带者。该技术较Ｓｏｕｔｈ－ｅｒｎ印迹杂交法简便、快速、高效直观、灵敏准确，便于推广应用，达到国际先进水平。

LD-PCR直接基因诊断重型血友病A的研究

目的:检测凝血因子VIII基因倒位,提高对重型血友病A患者及其携带者的诊断水平。方法:根据患者的出血症状及遗传史,采用国际通用的一期法检测患者血浆凝血因子VIII活性(FVIII:C),ELISA法检测血浆vWF:Ag浓度,确诊血友病A及其携带者;对38例重型HA患者及其母亲或姨母,采用长距离DNA扩增(LD-PCR)技术检测是否存在凝血因子VIII(FVIII)基因倒位,进行直接基因诊断。结果:38例无亲缘关系的重型血友病A患者中,发现15例患者(或家系)有FVIII基因倒位,占重型患者的41%;该15个家系中查出基因倒位携带者5名。结论:利用LD-PCR检测FVIII基因倒位技术可以准确、简便而快速地直接进行重型血友病A的基因诊断和携带者检测。

重型血友病A患者及其携带者直接基因诊断结果分析

目的进一步提高重型血友病A(HA)及其携带者的诊断水平。方法检测120例无亲缘关系的重型HA患者和HA家系中的18例女性(可能携带者)血浆凝血因子FⅧ(FⅧ:C)活性和血管性血友病因子(vWF)浓度;采用长链聚合酶链反应(LD-PCR)和双组PCR方法检测FⅧ基因内含子22倒位(IVS22)和内含子1倒位情况进行直接基因诊断。结果 120例HA患者中IVS22者46例(或家系),占38.3%;其中10个IVS22家系的18例女性检出FⅧ基因IVS22携带者7例,非IVS22的74例患者无内含子1倒位者。结论通过检测FⅧ基因内含子22倒位和内含子1倒位可对重型HA患者及其携带者进行准确、快速的直接基因诊断。

血友病A患者凝血因子Ⅷ基因内含子1及22倒位分析

目的 对血友病A（HA）患者及其家系携带者进行凝血因子Ⅷ（FⅧ）基因内含子1及22倒位分析，并探讨其与FⅧ抗体产生的相关性。方法对157例HA患者进行FⅧ活性（FⅧ：C）及FVH抗体检测；同时采用双管多重PCR及长距离PCR（LD—PCR）技术对其中81例HA患者进行FⅧ内含子1及内含子22倒位分析；并对其中6例患者进行家系调查。结果81例HA患者中3例为内含子1倒位，均为重型，占重型HA的4．6％（65例中3例）；内含子1倒位患者中1例为FⅧ抗体阳性。用该基因信息对1个内含子1倒位患者家系的2名女性进行了检测，1例为携带者，1例为非携带者。81例HA患者中25例为内含子22倒位，均为重型，占重型HA的38．5％（65例中25例），内含子22倒位患者中发现1例为FVI抗体阳性。用该基因信息对5个内含子22倒位患者家系的9名女性进行了检测，7例为携带者，2例为非携带者。结论内含子1倒位是继内含子22倒位外导致重型HA的另一重要分子发病机制。FⅧ内含子倒位检测不仅可用于血友病直接基因诊断、进行家系调查；同时还可纠正表型分型的偏差。FVH内含子1和内含子22倒位可能是抗体产生的高危因素之一。

倒位PCR技术在血友病A基因诊断中的应用及改进

目的对倒位PCR（I-PCR）技术进行改进并应用于血友病A凝血因子Ⅷ（FⅧ）基因倒位突变的检测，探讨其产前诊断价值。方法选取了8个无血缘关系的血友病A家系，应用已改进的I-PCR技术直接检测FⅧ基因第22内含子倒位。对2名孕妇分别于妊娠22及26周抽取胎儿脐静脉血，在检测脐血血浆FⅧ活性的同时应用I-PCR技术进行产前FⅧ基因突变检测。结果8个家系中检出4个家系为FⅧ基因倒位；根据FⅧ活性及基因突变检测结果，2名胎儿均诊断为正常胎儿，1名已出生，经随访与产前诊断结果相符合。结论应用I-PCR技术可以快速有效地进行血友病AFⅧ基因倒位突变的检测并可作为产前诊断的辅助手段。

重型血发病诊断获突破

日前，北京朝阳医院运用长距离基因片断扩增技术(LD-PCR)检测引起重型血友病甲的凝血八因子基因倒位获得成功。这项国内首创的检测技术不仅可“准确地检出血友病基因携带者，而且还可以对血友病家族中怀孕的女性携带者进行高危胎儿的产前基因诊断，以防止新患儿出生，从而阻断有害基因逐代传播，让她们也生个健康的宝宝。该检测技术在国际上处于领先地位。