草莓FaWRKY70基因克隆与表达模式分析

【目的】WRKY是植物特异性转录因子家族之一,参与植物多种生命活动,但在草莓中鲜见WRKY70相关报道。深入解析WRKY70同源基因在草莓响应胁迫过程中的作用,加快分子育种技术应用,培育新草莓种质资源。【方法】用同源克隆法从‘红颜’草莓果实中克隆得到FaWRKY70基因,用生物信息学分析其保守结构域、理化性质、蛋白质结构及进化关系等,并结合qRT-PCR数据进行表达模式分析。【结果】FaWRKY70基因全长1020 bp,编码339个氨基酸;同源基因比对发现,FaWRKY70与苹果、牡丹等同科物种氨基酸序列相似度较高,且同源基因多与植物对生物、非生物胁迫响应相关,暗示FaWRKY70可能参与草莓抵御胁迫的过程;FaWRKY70在草莓不同器官中均有表达,且差异显著,在花中表达量最高,在果实中最低;水杨酸处理后,FaWRKY70基因快速响应,表达量在3 h后达到最高,随后逐渐降低;茉莉酸甲酯处理后FaWRKY70基因受诱导响应程度小,整体呈下调趋势。【结论】FaWRKY70能通过不同响应方式参与草莓生命活动及激素信号转导过程。

荔枝蒂蛀虫海藻糖酶基因克隆及生物信息学分析

【目的】海藻糖酶(Trehalase,Tre)是昆虫体内海藻糖代谢的关键酶,通过专一性地将海藻糖分解为葡萄糖,在昆虫能量代谢和生长发育中发挥着重要的作用。旨在克隆荔枝蒂蛀虫(Conopomorpha sinensis Bradley)可溶型海藻糖酶基因(CsTre1)和膜结合型海藻糖酶基因(CsTre2),探讨其在荔枝蒂蛀虫不同发育阶段和不同组织中的表达模式,解析这2个基因及其酶蛋白的分子特征。【方法】利用荔枝蒂蛀虫转录组数据和RACE技术,克隆CsTre1和CsTre2的全长cDNA序列,并应用ORF Finder、ProtParam、SignalP 4.1、ProtScale、NetPhos2.0 Server和IQ-TREE等软件对其进行生物信息学分析;采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)分析CsTre1和CsTre2在荔枝蒂蛀虫不同发育阶段及成虫不同组织的mRNA表达模式。【结果】CsTre1的开放阅读框(ORF)长1701 bp,编码566个氨基酸,蛋白分子量为64.53 kD。CsTre2的ORF长1821 bp,编码606个氨基酸,蛋白分子量为69.08 kD。信号肽预测分析表明,CsTre1和CsTre2前端均有1个信号肽,其位置分别为1-16和1-17。蛋白二级结构分析结果显示,二者均主要由α-螺旋和无规则卷曲组成,CsTre1有24个Ser、15个Tyr、10个Thr可能成为蛋白激酶的结合位点,而CsTre2有27个Ser、10个Tyr、13个Thr可能成为蛋白激酶的结合位点。RT-qPCR结果显示,CsTre在荔枝蒂蛀虫的蛹和成虫期均有表达。在成虫期中,CsTre1的表达水平远高于CsTre2,且CsTre1在雄成虫第2 d和第5 d的表达水平陡然下降,在雌成虫中则保持稳定高表达。【结论】该研究成功克隆了荔枝蒂蛀虫的2个海藻糖酶基因,其分子特征及表达模式结果表明,CsTre1可能是荔枝蒂蛀虫主要调控海藻糖代谢的基因。研究结果可为阐明海藻糖酶基因的功能提供重要线索,为开展害虫防治策略的研究奠定基础。

丹参转录因子SmWRKY1基因克隆及遗传转化拟南芥

以丹参为试材,提取总RNA和合成cDNA,采用PCR扩增获得丹参转录因子SmWRKY1基因序列,通过生物信息软件及在线工具检测基因编码蛋白质的理化性质及氨基酸多序列比对,构建过表达载体并使用花序侵染法转入拟南芥,研究了转SmWRKY1基因对拟南芥生长性状和生理指标的影响,以期初步探究丹参SmWRKY1转录调控因子的生物学功能。结果表明:SmWRKY1基因全长1041 bp,编码346个氨基酸,NCBI数据库保守区BLAST分析显示具有典型的“WRKY”DNA结合保守结构域和C2H2型锌指结构。编码蛋白分子量为37310.4 Da,等电点pI为9.77,GRAVY为-0.571,ProtParam分析SmWRKY1属于亲水性蛋白。构建过表达载体pCAMBIA-SmWRKY1,并使用花序侵染法转入拟南芥,经鉴定获得11株转SmWRKY1基因的阳性苗,转基因植株可以使叶片和莲座直径显著变大,叶绿素和可溶性糖含量增加,MDA和脯氨酸含量减少,因此推测丹参SmWRKY1可能是一个与植物基础防御有关的负调控因子,参与植物非生物胁迫反应。

枳PtrPP2C51基因克隆与非生物胁迫表达分析

克隆枳PP2C基因家族的PtrPP2C51基因,分析其在低温、高温和干旱等胁迫下的表达规律,探究其在非生物胁迫中的功能。以1年生枳苗为试材,从嫩叶克隆到PtrPP2C51基因cDNA序列,采用生物信息学方法对其进行分析,利用实时荧光定量PCR仪(qRT-PCR)检测枳苗在低温、高温和干旱(15%PEG-6000)处理下的PtrPP2C51基因表达模式。克隆获得PtrPP2C51基因编码区CDS序列长度为879 bp,编码292个氨基酸,其蛋白分子量为31.36 ku,理论等电点4.9,脂肪系数79.52,不稳定系数39.57,亲水性平均值-0.279。PtrPP2C51蛋白的二级结构中α-螺旋、β-转角、延伸链和无规则卷曲占比分别为40.07%、7.88%、18.15%和33.90%。PtrPP2C51蛋白与克里曼丁橘的PP2C蛋白在同一小分支上,亲缘关系最近。经低温(0℃)、高温(38℃)和干旱(15%PEG-6000)3种不同胁迫处理,PtrPP2C51基因的相对表达量均表现持续上调趋势,并且均在处理12 h时表达量达到最高值。PtrPP2C51基因可能参与枳的抗逆胁迫调控机制。

梅花鹿DLX5基因克隆及表达分析

为研究梅花鹿(Cervus nippon)DLX5基因的结构和功能,进一步探究其与梅花鹿茸角骨化机制间的关系,采用RT-PCR技术对梅花鹿DLX5基因进行克隆,获得包含全部编码区的c DNA序列,对该基因的氨基酸序列进行生物信息学分析并构建系统进化树,通过KEGG富集分析其信号通路,运用实时荧光定量RT-PCR检测该基因在鹿茸生长不同时期的表达情况。结果表明:梅花鹿DLX5基因编码区长为870 bp,共编码289个氨基酸。DLX5蛋白为可溶性的不稳定蛋白,有2个保守结构域,主要定位于细胞核。梅花鹿DLX5蛋白与许多不同物种来源的DLX5蛋白氨基酸序列有较高相似度,比较保守。DLX5蛋白二级结构中无规则卷曲占比最大(78.89%),其后依次是α-螺旋、延伸链,占比分别为16.96%和4.15%。DLX5基因主要的作用通路为TGFβ信号通路、MAPK信号通路和Wnt信号通路等。实时荧光定量RT-PCR结果表明,DLX5基因在鹿茸生长后期(三杈茸)表达量显著增高,这种上调表达暗示了其在鹿茸骨化过程中发挥重要作用,说明其可能是鹿茸骨化相关候选基因。

双孢蘑菇中一种4R型MYB转录因子的基因克隆和生物信息学分析

MYB转录因子广泛存在于真核生物中,在植物的生长发育、逆境胁迫等过程中发挥重要作用。与植物相比,对食用菌中MYB转录因子的研究有限。为探究MYB转录因子在食用菌中的生物学功能,对前期转录组发现的一个编码双孢蘑菇(Agaricus bisporus)MYB转录因子的基因进行克隆和生物信息学分析。结果表明,该基因编码区长1209 bp,翻译402个氨基酸;编码的蛋白分子量为45.95 kDa,等电点9.17,是一种不存在跨膜结构、不含信号肽的亲水性蛋白,具有4个高度保守的SANT结构域,属于4R型MYB转录因子,与白环蘑(Leucoagaricus)中的4RMYB转录因子亲缘关系最近;二级结构预测显示以无规则卷曲和α-螺旋结构为主;亚细胞定位分析显示该转录因子位于细胞核中;此外启动子序列分析表明,该基因启动子区域含有多个与生物抗逆应答、激素响应等相关的顺式作用元件。

钩藤UrTSA基因克隆及组织表达特异性分析

【目的】克隆钩藤碱的合成关键酶即色氨酸合成酶α链基因(UrTSA),并分析其组织表达特异性,为探究该基因的钩藤碱生物合成机制提供理论参考。【方法】从生物项目数据库(BioProject)筛选得到钩藤碱的生物合成相关酶基因UrTSA,以钩藤的根、叶、茎钩和蒴果的cDNA为模板,PCR克隆UrTSA基因的开放阅读框(ORF),并进行生物信息学分析,结合实时荧光定量PCR检测UrTSA基因在钩藤不同组织中的表达模式。【结果】UrTSA基因的ORF为963bp,编码320个氨基酸残基,相对分子量为33924.49Da,理论等电点(pI)为9.11,不稳定指数Ⅰ为33.50,脂溶指数为102.12,总平均亲水性指数为0.117,说明UrTSA蛋白为稳定、脂溶性好的疏水蛋白。UrTSA蛋白亚细胞定位于叶绿体,不含信号肽和跨膜区,为非分泌型蛋白;不具有潜在的糖基化位点,有30个潜在的磷酸化位点,包括16个丝氨酸(Ser)、13个苏氨酸(Thr)和1个酪氨酸(Tyr);二级结构由α-螺旋(43.44%)、无规则卷曲(31.87%)、延伸链(15.94%)和β-折叠(8.75%)组成。UrTSA蛋白与其他11个植物物种的TSA蛋白具有较高的氨基酸序列相似性(69.78%~92.77%),其中与阿拉比卡咖啡(Coffeearabica)和欧基尼奥伊德斯种咖啡(Coffeaeugenioides)TSA蛋白的亲缘关系较近。UrTSA基因在钩藤的根、叶、茎钩和蒴果中均有表达,其中在蒴果、根和叶中相对表达量均极显著高于茎钩中的相对表达量(P<0.01),分别是茎钩的2.17、1.58和1.20倍。【结论】UrTSA基因具有组织表达特异性,主要在蒴果钩藤碱合成中发挥调控作用,为后续研究钩藤碱在钩藤中不同部位的累积及其生物合成途径提供思路和线索。

草地早熟禾PpSWEET1b基因克隆及功能研究

SWEETs糖转运蛋白是一类在真核生物和原核生物中均存在的促进糖通过细胞膜流动的转运蛋白之一,参与调控植物的生长发育和胁迫响应过程。以草地早熟禾品种蓝月为材料,以叶片cDNA为模板克隆PpSWEET1b基因,采用花序侵染法转化拟南芥,获得了PpSWEET1b拟南芥过表达株系,并研究干旱和低温胁迫对转基因和野生型拟南芥生长、生理及基因表达的影响。结果表明:干旱和低温胁迫下,PpSWEET1b过表达植株生长状态均优于野生型,叶片MDA含量显著低于野生型,但葡萄糖含量较野生型显著增加,抗旱性和抗寒性明显增强;PpSWEET1b过表达植株可能协同SWEET2和SWEET3共同参与了对低温的响应。此外,以叶片DNA为模板克隆了PpSWEET1b基因的启动子序列,顺式作用元件预测发现,其含有多个与胁迫和激素响应、光响应相关的元件。综合以上结果表明,草地早熟禾PpSWEET1b基因在耐旱和耐寒方面发挥着重要作用,可为草坪草抵抗非生物胁迫生物育种提供新的优异基因资源。

灰毡毛忍冬MADS-box基因家族鉴定与CMB1基因克隆

目的鉴定灰毡毛忍冬Lonicera macranthoides MADS-box家族基因并进行生物信息学分析与表达模式验证,克隆湘蕾型和野生型灰毡毛忍冬MADS-box家族成员CMB1全长。方法基于转录组数据,利用在线工具对灰毡毛忍冬MADS-box进行生物信息学分析,并利用qRT-PCR验证MADS-box基因在不同品种中的表达模式,通过RT-PCR、RACE技术克隆湘蕾型和野生型灰毡毛忍冬CMB1基因全长。结果28个灰毡毛忍冬MADS-box蛋白长度为89~359 aa,碱性蛋白占比85.7%,不稳定蛋白占比96.4%,亲水性蛋白占比96.4%,均定位于细胞核,均为无跨膜结构的非分泌蛋白。转录组显示,与野生型比较,湘蕾型中28个MADS-box基因有17.86%表达下调,MIKCC型基因中有18.75%表达下调。克隆得到在两个品种的灰毡毛忍冬花中高度特异性表达的CMB1基因全长,均包含一个738 bp的ORF,编码245个氨基酸。CMB1基因在两个品种的花中表达量存在显著差异(P<0.01),且与茎、叶相比,在花中高度特异性表达(P<0.01)。结论基于灰毡毛忍冬转录组数据,鉴定了28个MADS-box家族基因,克隆得到湘蕾型与野生型灰毡毛忍冬CMB1基因全长,为进一步研究灰毡毛忍冬花发育、优良表型形成的分子机制提供研究基础与理论依据。

牦牛FABP3基因克隆及组织表达谱分析

【目的】分析牦牛心肌脂肪酸结合蛋白3(FABP3)基因的结构和功能,并检测其在成年牦牛和胎牛中的表达水平,为探究该基因在牦牛育种中的生物学功能提供理论参考。【方法】以美仁牦牛的心脏组织为试验材料,PCR扩增FABP3基因,对得到的编码区序列(CDS)进行生物信息学分析;利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR),检测FABP3基因在成年牦牛和胎牛心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏及肌肉组织的表达水平。【结果】牦牛FABP3基因编码区序列长度为402 bp,编码133个氨基酸;蛋白质的高级结构主要是β-转角和延伸链;牦牛FABP3蛋白不存在跨膜区域和信号肽,属于具有一定亲水性的稳定蛋白;牦牛FABP3基因CDS区核苷酸及其编码氨基酸序列的同源性分析显示,FABP3基因在牛属动物中具有一定的保守性;系统进化树分析表明,牦牛与野牦牛和瘤牛的亲缘关系最近,与鸡的亲缘关系最远。RT-qPCR结果显示,FABP3基因在成年牦牛和胎牛的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏及肌肉组织中均有表达,但在胎牛肝脏、脾脏、肾脏和肌肉中的表达水平显著或极显著高于成年牦牛,在成年牦牛肺脏中的表达水平极显著高于胎牛。【结论】克隆了牦牛FABP3基因,探究了FABP3基因在牦牛中的组织表达规律,为进一步研究该基因在牦牛脂肪沉积中的作用提供了基础数据。

陆川猪MyoD1基因克隆及组织表达分析

为探究陆川猪骨骼肌生长发育过程中MyoD1基因所起作用,对陆川猪成肌细胞决定基因1(MyoD1)进行克隆,展开生物信息学分析,对其在陆川猪不同组织中的表达进行分析,以NCBI上已公布的野猪MyoD1基因序列为模板,进行特异性引物设计,克隆陆川猪MyoD1基因CDS区,并与NCBI已公布的野猪、牛、绵羊、人、小鼠、大鼠基因序列进行相似性比对,由此构建系统进化树,通过在线软件开展生物信息学分析,而后使用实时荧光定量PCR检测在陆川猪不同组织中MyoD1基因的相对表达量。陆川猪MyoD1基因CDS区全长960 bp,共编码319个氨基酸,碱基突变共存在5处,与野猪、牛、绵羊、人类、小鼠、大鼠的MyoD1基因CDS序列相似性分别为99.2%,93.0%,92.3%,90.0%,84.3%,84.0%,其中与野猪相似性最高,表明二者亲缘关系最为接近;陆川猪MyoD1基因原子总数为4680,蛋白的分子质量为33.99 ku,分子式为C_(1457)H_(2296)N_(442)O_(471)S_(14);不稳定系数为63.87,表明其缺乏稳定性;等电点为5.63,属于酸性蛋白;不存在跨膜结构,存在35处磷酸化位点及1处糖基化位点;蛋白二级结构以无规则卷曲为主,占比60.69%。陆川猪MyoD1基因在背最长肌中的表达量最高,且显著高于其他组织,表达量最低的组织为肾脏。陆川猪各组织中均有MyoD1基因表达,且主要在背最长肌中表达,由此推测,MyoD1基因在陆川猪肌肉生长发育过程中可能起到至关重要的作用。

河虾过敏原原肌球蛋白的基因克隆与原核表达

为了探寻天然原肌球蛋白的可替代物作为诊断和治疗虾类过敏的基础材料,本研究从河虾中提取总RNA,利用cDNA末端快速扩增技术克隆河虾过敏原原肌球蛋白基因的全长序列。以此序列设计表达引物,构建表达载体,最后通过异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导表达重组原肌球蛋白。结果显示,河虾的原肌球蛋白基因cDNA序列全长1658 bp,开放阅读框855 bp,编码284个氨基酸,预测蛋白等电点4.70,预测分子质量32.8 kDa。河虾原肌球蛋白cDNA序列已上传至GenBank数据库,登录号为OP974621。本研究成功构建河虾原肌球蛋白重组表达质粒pET-30a-TM,并用IPTG进行体外诱导表达,最佳诱导条件为IPTG浓度1 mmol/L、37℃诱导4 h。可溶性分析结果表明重组原肌球蛋白主要以可溶性形式存在于细胞破碎液的上清液中,分子质量约38 kDa。

木薯MebZIP2基因克隆及其功能分析

【目的】bZIP转录因子在植物生长发育、淀粉合成和非生物胁迫等方面发挥重要作用。克隆木薯MebZIP2基因并进行亚细胞定位、表达分析和酵母单杂交分析,为进一步研究MebZIP2基因的功能提供参考。【方法】从木薯SC205中扩增MebZIP2基因编码区(CDS)序列,对其进行生物信息学分析,并构建pNC-GreenSubN融合表达载体,通过农杆菌介导转染烟草表皮细胞,观察荧光信号以确定MebZIP2蛋白的亚细胞定位情况。在木薯不同组织和块根不同发育阶段分析MebZIP2基因表达特征,利用酵母单杂交研究其与淀粉合成基因启动子的互作情况。【结果】MebZIP2基因CDS序列长度为465 bp,编码154个氨基酸,蛋白分子量为17891.35 Da,理论等电点为5.23,属于不稳定亲水性蛋白。MebZIP2含有bZIP保守结构域,其氨基酸序列与橡胶树bZIP蛋白的相似性最高,为74.22%。MebZIP2基因启动子区域含有光响应元件,赤霉素、水杨酸和茉莉酸等激素响应元件,以及胚乳表达和胁迫响应元件。MebZIP2蛋白亚细胞定位于细胞核和细胞膜。MebZIP2基因在根尖分生组织、须根、茎和块根发育前期的表达量较高。MebZIP2与淀粉合成基因MeAPL5a、MeGBSS1和MeISA1共表达,而且MebZIP2蛋白可以与它们的启动子互作。【结论】MebZIP2基因属于bZIP基因家族成员,其表达具有组织特异性和块根发育阶段性,MebZIP2蛋白可以与淀粉合成基因MeAPL5a、MeGBSS1和MeISA1的启动子互作,可能参与了木薯块根发育和淀粉合成。

灰毡毛忍冬花器官发育相关LmSOC1基因克隆及表达分析

【目的】克隆灰毡毛忍冬MADS-box家族基因SOC1(SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CO1),对其进行生物信息学和表达模式分析,为探究灰毡毛忍冬花冠不开放机制奠定理论基础。【方法】基于花蕾型灰毡毛忍冬转录组数据,筛选到开花调控基因LmSOC1的Unigene序列并克隆全长cDNA序列,通过生物信息学分析和实时荧光定量PCR技术分析编码蛋白特性和不同品种中LmSOC1基因的表达特异性,最后将LmSOC1基因插入到原核表达质粒载体pTOPO-D1中,并在表达宿主BL21(DE3)中进行蛋白表达。【结果】LmSOC1基因包含645bp的ORF区,LmSOC1蛋白不含信号肽、无跨膜区,为稳定的亲水性蛋白。系统进化树分析表明,LmSOC1蛋白与黄花蒿、榴莲、可可等的SOC1蛋白亲缘关系更近。实时荧光定量PCR分析表明,在2个花蕾型灰毡毛忍冬品种的花蕾和叶片中均检测到LmSOC1基因的表达,而叶片中表达量明显高于花蕾。同时,在早期花蕾中LmSOC1基因的表达量高于晚期花蕾,在‘金翠蕾’品种中这一表达差异极显著(P<0.01)。最后成功在大肠杆菌BL21(DE3)中表达出重组蛋白。【结论】通过对LmSOC1基因的克隆和表达分析发现,该基因可能在灰毡毛忍冬花器官发育过程中发挥重要作用,为进一步研究该基因在植物花发育中的生物学功能奠定了基础。

烟粉虱MED隐种14-3-3基因克隆及时空表达谱分析

【目的】真核生物中,14-3-3蛋白是一类可与多种蛋白互作的调节蛋白,能够参与信号转导、免疫反应、生长发育和胁迫响应等。本研究旨在克隆烟粉虱Bemisia tabaci MED隐种的14-3-3基因的全长cDNA序列,了解该基因编码的蛋白特征和该基因的时空表达模式。【方法】使用RT-PCR技术克隆烟粉虱MED隐种的14-3-3基因全长cDNA序列,通过生物信息学软件和在线网站分析14-3-3基因的生物学特性;使用RT-qPCR测定14-3-3基因在烟粉虱MED隐种不同发育阶段(卵、1-4龄若虫和成虫)、雌雄成虫以及雌成虫头、胸和腹中的表达量。【结果】克隆并鉴定了烟粉虱MED隐种14-3-3基因的两个亚型:Bt14-3-3 epsilon(GenBank登录号:XM_019046102.1)和Bt14-3-3 zeta(GenBank登录号:XM_019057395.1),开放阅读框(ORFs)分别长771和744 bp,分别编码256和247个氨基酸,编码的蛋白是无跨膜螺旋区和信号肽的亲水性蛋白,其二级结构主要由α旋螺旋组成。系统发育树分析表明,Bt14-3-3 epsilon与褐飞虱Nilaparvata lugens、温带臭虫Cimex lectularius和茶翅蝽Halyomorpha halys的14-3-3 epsilon聚为一支,同源性较高;Bt14-3-3 zeta与褐飞虱的14-3-3 zeta的亲缘关系更近。RT-qPCR结果表明,Bt14-3-3 epsilon和Bt14-3-3 zeta在烟粉虱MED隐种的卵、雌成虫和雌成虫腹部中的表达量较高。【结论】明确了烟粉虱MED隐种14-3-3基因的两个亚型的全长序列、编码蛋白特征及时空表达特点,为后续研究14-3-3蛋白的分子功能奠定了基础。

蓝莓不同硬度果实VcPLs基因克隆和功能研究

【目的】探究果胶裂解酶基因在蓝莓硬肉品种和软肉品种果实硬度差异中的作用,为选育高硬度蓝莓品种提供参考。【方法】以蓝莓硬肉品种Star和软肉品种O’Neal不同发育时期的果实为材料,测定果实硬度、细胞壁物质含量和果胶裂解酶活力,分析比较果肉细胞解剖结构,克隆果胶裂解酶基因并研究其表达模式,转化番茄验证VcPL的功能。【结果】S4(膨大期)到S6(红果期)时期是果实硬度快速下降关键时期,果肉细胞在发育初期细胞壁轮廓清晰,Star果肉细胞出现结构破损的时期晚于O’Neal,果实硬度与可溶性果胶含量、果胶裂解酶活力均呈极显著负相关,VcPL41和VcPL65编码区序列长度分别为1230 bp和1209 bp,Star和O’Neal中VcPL65氨基酸序列完全相同,VcPL41的序列在品种间有4个氨基酸差异。2个基因在Star中快速上调表达的时期晚于O’Neal。超表达VcPL41和VcPL65的番茄果实硬度显著小于对照组,可溶性果胶含量显著高于对照组。【结论】蓝莓硬肉品种Star和软肉品种O’Neal果实硬度差异受果胶裂解酶活力和可溶性果胶含量影响,VcPL41和VcPL65能够加速果实成熟软化进程。

茶花鸡2号IFN-α基因克隆及生物信息学分析

本研究旨在克隆茶花鸡2号α干扰素基因(IFN-α)CDS区序列并进行生物信息学分析,为后续研究IFN-α基因对茶花鸡2号免疫功能的影响提供参考。以茶花鸡2号为实验对象设计IFN-α引物,提取总RNA,反转录PCR扩增并克隆其编码区序列,进行生物信息学分析。结果显示茶花鸡2号IFN-α基因CDS序列全长582 bp,IFN-α蛋白等电点5.05,平均疏水指数-0.514,为酸性亲水蛋白,且存在信号肽和1个跨膜区,主要定位于细胞核。IFN-α蛋白被4个N糖基化位点、5个O糖基化位点和20个磷酸化位点修饰,主要由α-螺旋与无规卷曲构成。茶花鸡2号与固始鸡、海兰鸡、惠阳胡须鸡、罗曼鸡和乌骨鸡的氨基酸同源性分别为95.9%、97.9%、97.9%、97.9%和95.9%。IFN-α蛋白与IRF7、IFNAR1、IFNAR2和IFNK等蛋白存在互作关系。本研究结果可为进一步探讨IFN-α基因在茶花鸡2号病毒疾病防治中的作用提供理论依据。

蒲公英TmRAV1基因克隆及其响应脱落酸信号表达分析

根据脱落酸处理的蒲公英(Taraxacum mongolicum Hand.-Mazz.)的转录组数据,在蒲公英中克隆获得1个编码RAV转录因子的基因序列,命名为TmRAV1。TmRAV1的开放阅读框(ORF)长度为1026 bp,编码342个氨基酸。TmRAV1的理论相对分子质量为38229,理论等电点为pI 9.20。TmRAV1为不稳定蛋白,具有亲水性,没有跨膜结构域和信号肽,含有44个磷酸化位点。氨基酸序列比对结果显示:TmRAV1与莴苣(Lactuca sativa Linn.)LsRAV1氨基酸序列的同源性最高(一致性为85.88%),具有高度保守的AP2和B3结构域。系统发育分析结果表明TmRAV1与其他5种植物的RAV转录因子聚在一起。TmRAV1在蒲公英叶中的相对表达量显著(P<0.05)高于根和花。TmRAV1受100μmol·L^(-1)脱落酸和250 mmol·L^(-1)NaCl的显著诱导。TmRAV1能够显著上调脱落酸敏感型转录因子基因TmAREB1的表达。TmRAV1是核定位转录因子,与脱落酸信号核心蛋白家族成员TmSnRK2.6互作。综上所述,蒲公英TmRAV1响应脱落酸等多种信号,其编码蛋白与TmSnRK2.6互作,并调控TmAREB1的表达。

刺葡萄STS基因克隆及其在不同光质下的表达水平

【目的】研究刺葡萄芪合酶(STS)基因的序列特征及其在不同光质处理下的表达水平,旨在为进一步解析STS基因通过响应光信号调控刺葡萄愈伤组织中白藜芦醇合成的分子机制提供依据。【方法】以刺葡萄愈伤组织为材料,利用逆转录PCR(RT-PCR)技术成功克隆获得了4个STS基因,对这些基因及其编码蛋白进行了生物信息学分析,并利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测其在不同光质下和不同培养阶段的表达水平。【结果】成功地从刺葡萄愈伤组织中克隆获得了VdSTS5、VdSTS6、VdSTS20、VdSTS21共4个基因,均含1179 bp完整开放阅读框(ORF),编码392个氨基酸残基,预测其编码的是亲水性、无信号肽的细胞质定位蛋白,磷酸化修饰主要发生在苏氨酸和丝氨酸位点上,蛋白质的二级结构主要由α-螺旋、无规则卷曲和延伸链组成,STS与查尔酮合成酶(CHS)的蛋白质序列具有高度同源性。4个VdSTS的蛋白质序列在系统进化树上处于3个不同的大分支中,其中,VdSTS5与VdSTS21处在不同的分支中,而VdSTS6与VdSTS20聚在同一分支中,葡萄属不同种之间的STS蛋白质序列相似度高,推测其可能具有相同的功能。启动子顺式作用元件预测发现,4个VdSTS启动子含有多个光响应元件,还含有转录因子识别和作用元件、激素作用元件等。光质显著影响4个VdSTS的表达,在白光、红光、黄光和黑暗处理下,VdSTS的总体表达水平较高,而在绿光和紫光处理下,VdSTS的总体表达水平较低;同时,VdSTS对不同光质的响应不仅存在着基因间的差异,还存在不同培养阶段的差异,VdSTS5在培养后期强烈响应黄光的调控,VdSTS6、VdSTS20在培养中期对黑暗和红光的响应最强,VdSTS21则在培养中期强烈响应红光的调控,这些基因表达水平的变化影响着刺葡萄愈伤组织中白藜芦醇的合成。【结论】4个VdSTS对光质的响应存在差异,可能在响应不同光质调控中对刺葡萄愈伤组织白藜芦醇的合成起到重要作用。

欧洲葡萄NF-YB3基因克隆与表达分析

为探究VvNF-YB3基因在葡萄生长发育和响应非生物胁迫过程中的功能,以无核白为试材,克隆得到了VvNF-YB3基因编码区序列,全长为624 bp,编码207个氨基酸,蛋白质等电点6.31,不稳定指数27.66,总平均疏水指数-0.738,为一酸性、稳定的亲水蛋白。通过生物信息学分析发现,VvNF-YB3基因位于10号染色体,含有1个内含子,编码蛋白质存在1个CBFD_NFYB_HMF结构域,与河岸葡萄NF-YB3相似性最高。VvNF-YB3的二级结构中α-螺旋和无规则卷曲占比较高,三级结构为单体的螺旋-卷曲-螺旋,启动子中包含响应激素和胁迫的多个顺式作用元件。VvNF-YB3基因在葡萄的叶片、卷须、花、幼果和茎中均表达,且在成熟的叶片中表达量最高。PEG模拟的干旱、低温和高温胁迫均可影响VvNF-YB3基因的表达,VvNF-YB3为一胁迫响应基因。VvNF-YB3的互作蛋白大多是核因子Y家族的亚基,ERF、bHLH、ARF等27个转录因子可能调控VvNF-YB3基因的表达。由此推测,VvNF-YB3基因可能通过受到上游转录因子的调控并与其他NF-Y蛋白互作响应各种环境胁迫。