转基因植物选择标记基因删除技术

本文系统地介绍了4种转基因植物选择标记基因删除技术——(共转化法(co-transformation)、转座子法(transposable element)、位点特异性重组法(site-specific recombination)、染色体内同源重组法(intrachromosomal recombination)的基本原理和操作过程,并分析了各自的特点和实际应用情况,比较了它们的优缺点,展望了删除技术的前景。删除技术的发展,无论是对于转基因作物的安全性和商业化,还是转基因技术的发展和完善都有积极的作用。

一种利用Cre/loxP系统进行标记基因删除与靶基因置换的细胞模型研究(英文)

Cre/lox系统可以介导DNA的定点插入和定点删除,可利用其实现转基因动物中'友好位点'的重复利用及标记基因的有效删除.为直观地评估该系统介导的以上两种重组反应的效果,通过标记基因并利用大鼠乳腺癌细胞系SHZ-88进行了模型研究.首先构建了两个载体:a.整合载体pTE-lox2272-DsRed-loxP-GFP-loxP,含有红色荧光标记基因DsRed和绿色荧光标记基因GFP;b.置换载体pT-lox2272-neo-loxP,含有筛选标记基因neo,用以置换DsRed基因.然后,用整合载体转染SHZ-88细胞,并随机挑取了3个同时表达DsRed和GFP的稳定整合细胞克隆.随后用置换载体和Cre表达载体PBS185对以上每个克隆分别进行了3次共转染,通过G418筛选并扩增培养后,总共获得1070个克隆.通过分析标记基因DsRed和GFP在这些克隆中的表达情况:Cre介导的删除效率为91.1%,定点置换效率为29.3%.最后对部分克隆进行了PCR和DNA印迹鉴定,分子鉴定结果与发光的表型状况一致.这一方法为Cre/lox系统在转基因家畜生产中的进一步应用提供了实验依据.

ipt基因促进矮牵牛遗传转化效率及热激启动子驱动基因删除

本研究主要探讨ipt基因对矮牵牛遗传转化不定芽诱导影响及拟南芥热激启动子hsp18.2驱动重组酶基因flp的热诱导外源基因删除表达载体在矮牵牛中的基因删除效果。本研究中将植物表达载体pBin-hsp18.2:flp-35S:ipt及对照载体pBin-hsp18.2:flp遗传转化矮牵牛,以获得转基因植株,分析比较不定芽的诱导和转基因植株进行的热激基因删除。研究结果表明,ipt基因可促进矮牵牛遗传转化过程中不定芽的诱导,其不定芽诱导率为21.5%,显著高于对照的8.7%。在44℃,6h,热激6次的条件下,转基因矮牵牛植株表型恢复正常,经GUS蛋白表达分析及PCR、RT-PCR检测,证明外源基因已经被删除。转基因矮牵牛基因删除效率最高可达43.8%。本研究为ipt基因在一些遗传转化困难植物转基因中的应用奠定了基础。

酵母菌Y12667 ERG11基因删除及验证研究

采用同源重组的方法删除酵母菌Y12667内源ERG11基因,并用PCR、Western、细胞计数和GC-MS的方法分别在基因水平、蛋白水平、细胞水平和功能代谢水平进行验证.结果表明,本研究成功删除了酵母菌Y12667内源ERG11基因,该基因删除菌能稳定表达外源性白念珠菌ERG11基因的同源蛋白.因此,该基因删除菌可作为下一步靶酶蛋白功能研究的基因工程表达操作菌.

一个新的重组酶系统在转基因植物外源基因删除中的应用

为了解决转基因植物可能带来的生物安全性问题,设计了一个新的位点特异性重组酶系统pLFHFGN,该系统中重组酶FLP基因由热激蛋白Hsp18.2基因的启动子控制,所有外源基因(包括重组酶基因FLP、GUS报告基因和NPTII筛选标记基因)都置于两个融合识别位点loxFRT之间.将上述重组酶系统通过根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导转化烟草,获得的再生植株分别通过GUS组织染色和PCR分析等方法进行鉴定.然后在37℃下热激处理转基因植株,利用GUS组织染色检测重组酶系统在转基因植株T1代幼苗中删除外源基因的效率,结果显示,该系统删除效率达到了48.2%～84.9%,说明通过重组酶系统pLFHFGN能够有效地删除转基因植物中的外源基因,这为解决转基因植物潜在的安全性问题提供了一条新的途径.

表皮葡萄球菌基因删除突变株构建方法的研究

目的 探讨高效的表皮葡萄球菌基因删除突变株构建方法。方法 分别应用2种不同的穿梭质粒pMAD和pBT2,连接目的基因表皮葡萄球菌双组分信号转导系统arlS、saeRS和lytS的上下游片段,构建重组质粒,电转入金黄色葡萄球菌RN4220后转入表皮葡萄球菌1457,利用抗性和生物标志筛选出针对特定目的基因的突变株SE1457-ΔarlS、SE1457-ΔsaeRS和SE1457-ΔlytS,比较2种方法的优、缺点。结果 利用pMAD和pBT2分别构建基因删除同源重组质粒pMAD-ΔsaeRS、pBT2-ΔarlS和pBT2-ΔlytS,并均获得相应的表皮葡萄球菌基因删除突变株。在筛选过程中,以pMAD为载体构建基因删除突变株,仅需1轮抗性/蓝白斑筛选过程即获突变株;而以pBT2为载体构建基因删除突变株筛选方法,需经过5～10轮的筛选才可获得突变株。基因删除突变株经聚合酶链反应（PCR）和测序等鉴定确认。与野生株相比,SE1457-ΔarlS突变株的生物膜形成能力降低90.96%,而SE1457-ΔsaeRS和SE1457-ΔlytS株的生物膜形成能力略有增加。结论 以pMAD载体构建表皮葡萄球菌突变株比较快速和简便。

两种不同的水稻标记基因删除技术的比较

Cre/loxP位点特异性重组系统是一种利用cre重组酶的瞬时表达来调控位于两个loxP位点之间DNA序列的删除系统。以反义LOX-3基因作为目的基因,以bar为选择标记基因,应用热激启动子驱动的Cre/loxP系统构建标记基因诱导删除型载体,得到转基因植株后,对比两种不同的热激方法中选择标记基因bar的删除效率,发现以生长到四叶期的转基因水稻植株为热激材料,标记基因删除效率较高,达到83.3%,因此,确定此方案为水稻标记基因删除的最佳方案。

利用Cre/loxP系统和rd29A启动子构建诱导型植物标记基因删除载体

出于对转基因作物中标记基因的安全性考虑,植物转基因育种中标记基因的删除将成为未来研究的热点之一。位点特异性重组系统之一Cre/loxP系统是目前在植物遗传转化中应用较多,较成熟的一个标记基因删除系统。为了利用Cre/loxP系统构建一种可调控的标记基因删除系统,本研究首先从拟南芥中克隆了逆境诱导型的启动子rd29A,同时从质粒pCre上克隆了Cre基因,构建了含有rd29A:Cre:Tnos表达元件的中间载体,将这一表达元件插入到另一植物双元表达载体pKsb中,最终构建了含有loxP-Pnos-nptⅡ-Tocs-rd29A-Cre-Tnos-loxP的可诱导型删除标记基因nptⅡ的植物双元表达载体。

PARP抑制剂诱导外源整合基因删除的作用特点

构建能表达 Lac Z基因和 c-Ha-T2 4 ras基因的两种真核表达重组质粒 A1 3.4和 B1 2 .7(两基因相对位置不同 ) ,并将其转染 NIH3T3细胞和 He La细胞 ,经 G4 1 8筛选 ,分别建立了四种稳定转化细胞系 A1 3.4 -NIH3T3、B1 2 .7-NIH3T3、A1 3.4 -He La及 B1 2 .7-He La.用聚 ADP核糖聚合酶 (PARP)的 NAD位点抑制剂苯甲酰胺(BA)分别处理四种转化细胞后 ,检测细胞中整合的外源 Lac Z基因与 c-Ha-T2 4 ras基因的删除情况 ,结果如下 :BA诱导的基因删除可发生于 NIH3T3转化细胞系 ,但不能发生于 He La转化细胞系 ;位于同一外源表达载体上的 Lac Z基因与 c-Ha-T2 4 ras基因的删除过程是同步的 ;外源整合 DNA片段的转录强度可能直接影响其被

基于Red重组系统和Xer重组系统的大肠杆菌多基因删除方法

快速、高效删除大肠杆菌染色体DNA的目的基因是大肠杆菌代谢工程研究的前提和基础。利用Red重组系统结合Xer重组系统删除了野生型大肠杆菌CICIM B0013的ackA-pta基因和pps基因。实验证明了可重复应用dif位点实现大肠杆菌染色体上多基因突变的叠加,同时,在染色体上并未留下抗生素标记,借此能够高效地实现多基因缺失突变株的构建。此外,本方法重组效率高,实验步骤较简便。

螺旋霉素3-O-酰基转移酶基因的删除和主要产生螺旋霉素组分Ⅰ菌株的获得

螺旋霉素(SP)为16元环大环内酯类抗生素,含有螺旋霉素Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ个组分,其结构的差异为16元内酯环的C3上分别连接羟基(SPⅠ)、乙酰基(SPⅡ)和丙酰基(SPⅢ);SPⅡ和SPⅢ是在相同的3-O-酰基转移酶催化下SPⅠ进一步酰化的产物。SPⅠ、SPⅡ和SPⅢ在生物学活性方面无大差异。为简化螺旋霉素组分,便于今后对其结构进行进一步改造,根据碳霉素和麦迪霉素生物合成中的3-O-酰基转移酶序列,设计了简并性PCR引物,并采用SON-PCR(single oligonucleotide nested PCR)方法,从螺旋霉素产生菌S.spiramyceticus F21中进行特异性扩增,获得了螺旋霉素3-O-酰基转移酶基因(sspA)及其侧翼序列,共约4.3kb(其中的3457nt DNA序列已被Genbank收录,DQ642742)。采用DNA同源双交换技术对S.spiramyceticus F21中的sspA进行了删除。对螺旋霉素原株和sspA缺失变株进行发酵产物提取和HPLC分析表明:原株中SPⅠ、SPⅡ和SPⅢ的相对含量分别为7.8%、67%和25%,变株中则分别为72%、18%和9.6%;变株主要组分为SPⅠ。螺旋霉素sspA缺失变株的获得为螺旋霉素组分简化及其衍生物的结构改造奠定了基础。

热诱导FLP重组酶删除转基因烟草外源基因

利用热激启动子Hsp18．2、nP重组酶基因及其专一识别位点构建了重组酶删除系统的植物表达载体转化烟草。热激处理后转基因植株中FLP重组酶表达并识别两个同向lox P-frt重组酶识别位点，使两位点间的DNA插入片段（包含kn1、gus、nptⅡ基因）从转基因烟草基因组中删除，由kn1基因引起的转基因烟草特殊表型及gus基因产生的蓝色表型消失。

应用Cre/loxP系统在转化细胞水平上高效删除转基因水稻的标记基因

研究了Cre/loxP系统在转化细胞水平上删除转基因水稻中抗性标记基因的可行性和效率。采用农杆菌介导法将Cre/loxP标记基因剪切系统载体pNCG导入水稻细胞,用G418筛选法获得水稻抗性愈伤组织后,在组织培养不同阶段的培养基中添加25μmol/L雌激素进行Cre基因的诱导表达和标记基因的剪切,PCR检测T0植株中标记基因nptⅡ、重组酶基因Cre和目标基因gusA的整合情况。将扩增结果为gusA(+)/nptⅡ(-)/Cre(-)的转基因植株统计为标记基因剪切成功的植株。结果表明,在抗性愈伤组织培养的预分化前、预分化和分化阶段添加雌激素诱导表达重组酶Cre均能成功切除标记基因序列,标记基因剪切成功率为6.82%～46.43%。在预分化前采用液体培养基添加雌激素诱导处理愈伤组织3d,T0植株中标记基因的剪切效率高达173.33%,主要原因是雌激素处理提高了愈伤组织绿苗分化率。直接在分化培养基中添加雌激素诱导处理,T0植株中标记基因剪切成功率达46.43%,剪切效率(144.44%)也较高。表明雌激素诱导的Cre/loxP系统能在水稻抗性愈伤组织水平上实现对标记基因序列高效快速删除。

热带假丝酵母肉毒碱乙酰基转移酶基因的删除及功能鉴定

缺乏高效基因删除技术是限制热带假丝酵母菌株代谢工程育种的重要因素。论文发展了一种新型的基因删除技术并利用该技术成功删除了肉毒碱乙酰基转移酶的两个等位基因。首先PCR扩增标记基因(URA3)的3'端324 bp序列作为基因删除辅助序列(gda序列),同向插入到URA3基因的5'端,在此基础上构建两端含有CAT基因同源臂序列的基因删除突变盒,转化宿主菌XZX,获得CAT基因单拷贝和双拷贝敲除的突变株。PCR鉴定和DNA测序结果表明,获得的URA3基因弹出后的突变株,仅在基因组重组位点上残留一个gda序列。进一步鉴定了突变株的生理性能,单拷贝敲除菌株CAT活性较亲本下降80%,但在葡萄糖或烷烃上的生长性能并不受显著影响。双拷贝缺失菌株CAT活性完全丧失,不能利用烷烃生长,同时在葡萄糖培养基中的生长受到显著影响,最终生物量达到7.56(OD600),仅为出发菌株的57.8%。

Cre/Loxp系统在转基因拟南芥杂交后代中的删除效率分析

在位点特异性重组酶系统Cre/Loxp中,重组酶Cre可以识别两个同向Loxp位点,并删除Loxp位点之间的所有外源基因,最终只留下一个识别位点.基于这一原理,以拟南芥为材料,构建带有同向Loxp位点的植物双元表达载体pCA-Loxp以及携带Cre基因的植物载体pCXSN-nlsCre,利用花序浸染法将二者分别转化野生型拟南芥.经逐步筛选得到各自的单拷贝纯合植株,分别以转基因纯合pCXSN-nlsCre和pCA-Loxp为父本或母本进行杂交,收集杂交后代种子.经萌发后对幼苗进行GUS组织化学染色、DNA检测以及测序分析等,最终证实该系统能成功删除拟南芥杂交子代中的外源基因,其基因删除效率高达82.2%.

植物转基因删除技术研究进展

植物转基因删除系统是以删除外源基因、选择标记基因、报告基因等为基础发展起来的分子育种技术,因其独特的技术特点,迅速在分子育种上得到了广泛的应用和发展。本研究介绍了5种基因删除技术,包括位点特异重组系统(FLP/FRT重组系统,Cre/loxP重组系统,R/RS重组系统)、共转化系统、转座子系统、染色体内同源重组4种传统的基因删除技术,以及由CRISPR/Cas9基因编辑系统介导的基因删除技术;并分析了这5种基因删除技术的基本原理、自身的优缺点及目前的实际应用研究现状。本研究挖掘了这些技术作为基因删除以外的应用潜力,探讨了它们各自作为基因开关的应用前景。

高效删除标记基因的Bhlea2植物表达载体的构建

为培育去除选择标记基因的耐旱转基因植物,同时利用Cre/Lox和FLP/frt系统,构建一个能够高效删除标记基因的Bhlea2基因植物表达载体。拟南芥rd29A启动子是在低温、干旱、高盐胁迫下的快速应答启动子,玉米ubiquitin启动子可有效驱动外源基因的转录,拟南芥pAB5启动子是花粉及胚胎等发育早期特异表达的启动子,利用上述启动子构建了表达Bhlea2基因并能够删除标记基因的植物表达载体。该表达载体包括重组酶表达元件pAB5-FLP、Bhlea2抗旱基因表达元件rd29A-Bhlea2和bar标记基因表达元件ubiquitin-bar。

Cre/loxP系统介导删除酿酒酵母ALD_4基因研究

设计与酿酒酵母编码乙醛脱氢酶ALD4基因ORF两侧序列同源的删除组件引物,以质粒pUG6为模板进行PCR构建带有Kanr选择标记的删除组件。通过醋酸锂转化法将删除组件导入酿酒酵母菌,采用G418筛选阳性克隆子,将质粒pSH65转入阳性克隆子。半乳糖诱导pSH65表达Cre酶切除Kanr基因,在ALD4基因ORF处留下1个loxP位点,通过2次的转化筛选验证获得ALD4双倍体基因缺陷型突变株Y01-ALD4。

Cre/loxp重组系统在转基因植物中删除标记基因的应用

在植物遗传转化中,标记基因是必须的,但标记基因的存在引起人们对转基因食品安全性的关注。Cre/loxp重组系统可用于删除转基因植物中的标记基因,可以通过杂交或二次转化,或瞬时表达、诱导表达、组织特异表达重组酶来获得无标记基因的转基因植株。

植物安全转基因技术研究现状与展望

转基因技术是进行基因功能研究和作物遗传改良的重要工具。根癌农杆菌介导转化法和基因枪轰击法是两种主要的遗传转化方法。从1996年首例转基因作物商业化种植以来,2012年全球有28个国家和地区种植转基因作物,种植面积已达1.7亿公顷。随着全球转基因作物的大面积商业化种植,转基因植物的安全性越来越多地受到公众关注。安全转基因技术的研发对于转基因植物的商业化生产具有重要意义。文章详细介绍了目前已报道的安全转基因技术原理及其应用现状。按其作用原理和目的将其分为4类:安全选择标记、标记基因删除及基因叠加、基因漂移防控法和基因定点编辑整合技术。其中,安全选择标记按其筛选原理分为糖代谢相关标记、氨基酸代谢相关标记、激素相关标记和抗逆相关标记。与抗生素和除草剂抗性标记相比,这类标记基因及其表达产物对人和其他生物更安全。标记基因删除及基因叠加技术包括共转化法、位点特异性重组法、转座子法、同源重组法以及基于位点特异性重组的基因叠加技术,其中共转化法又包括农杆菌介导的共转化法和基因枪介导的表达盒共转化法。基因叠加技术为复合性状转基因植物研发奠定了基础,有望成为未来多性状转基因植物研发的重要技术之一。基因漂流防控法包括叶绿体转化法和基因拆分法。基因定点编辑和整合技术包括锌指核酸酶、TALEN和CRISPR/Cas9系统介导的基因定点编辑和整合技术。其中,TALEN和CRISPR/Cas9技术,设计简单,成本低,易操作,靶点分布广泛,有望成为安全转基因研发和应用的重要技术。文章对这些技术原理及其应用现状进行了综述,讨论了其优缺点,并展望了安全转基因技术研发重点和发展趋势。