泛肿瘤基因突变检测高通量测序基因包的开发及临床验证

目的:本研究旨在开发高通量测序基因包(panel)以实现个性化的泛肿瘤突变基因的检测,同时验证其临床适用性。方法:通过公开数据库选择并设计223个肿瘤相关基因的引物组成panel,并以菁良公司的不同百分比结构变异福尔马林固定石蜡包埋(formalin-fixed paraffin-embedded,FFPE)标准品、野生型标准品、泛肿瘤800标准品、Horizon Discovery公司的游离DNA标准品为样本完成本panel准确性、重复性和检测限的实验室验证,并利用10例组织样本和2例游离DNA样本进行临床验证。结果:在准确性上,本panel阳性和阴性检出符合率达到100%。在重复性上,利用5%结构变异FFPE标准品具有良好的重复性,而游离DNA标准品重复性一般。在最低检测限上,2.5%结构变异FFPE标准品可稳定检出,最低可检出1%结构变异标准品;游离DNA标准品的最低检测限为0.25%。利用本panel检测临床样本表现出与对照方法良好的一致性。结论:成功开发靶向针对223个肿瘤相关基因的高通量测序panel并完成了分析性能和临床适用性验证,该方法具有协助临床诊断与治疗的潜力。

病毒融合基因包膜糖蛋白通过抑制NF-κB活性诱导HL-60细胞死亡

目的探讨猿猴白血病病毒融合基因包膜糖蛋白(GALV-FMG)诱导白血病HL-60细胞的死亡效应与NF-κB的关系。方法将HL-60细胞分为pcDNA3.1(+)-GALV-FMG质粒转染(A)组、pcDNA3.1(+)空载体对照(B)组和空白对照(C)组。脂质体转染后,应用乳酸脱氢酶释放实验检测GALV-FMG引起HL-60细胞的死亡效应,免疫荧光和凝胶电迁移检验分析GALV-FMG在诱导HL-60细胞死亡中NF-κB的活性。结果与B、C组相比,A组细胞中NF-κB的活性受到了明显的抑制,细胞死亡的发生显著增加(P<0.05)。结论 GALV-FMG的表达可诱导HL-60细胞发生死亡;其机制可能与NF-κB的活性抑制有关。

HIV-1包膜基因变异的体外研究

采用亚型测定、核苷酸和氨基酸序列测定和同源性分析等方法 ,观察了HIV 1ⅢB毒株在实验室长期传代过程中包膜基因变异的情况。研究的毒株包括 :经过实验室 8年多连续使用而获得的毒株、在MT4细胞长期连续传代而获得的每间隔 10代的毒株样品及多次更换宿主细胞传代而获得的毒株。主要结果有 :(1)各种毒株包膜基因变异均不显著 ,核苷酸序列同源性均大于 92 % ,变异距离均小于 7.5 % ,且随着传代数增加核苷酸趋于稳定 ,代间同源性由 92 %上升至 99% ,而变异距离由 7.5 %下降为 0 .6 %。 (2 )在传代过程中HIV 1亚型保持稳定 ,各种毒株均为HIV 1B3亚型。结果显示HIV在体外长期传代培养的过程中变异不大 ,遗传性状稳定 ,可能是体外生长的环境十分稳定 ,缺乏机体免疫学压力。结果也提示体外长期传代HIV毒株仍然适用于各种HIV的应用研究 ,用长期传代的方法发展HIV

慢性1b型丙型肝炎病毒感染者包膜2基因正选择位点分析及功能意义

目的:纵向分析自然免疫压力下慢性1b型HCV感染者E2基因的系统进化模式及正选择位点,初步探讨E2基因正选择位点的分布与已知功能区之间的关系。方法:未抗病毒治疗的3例慢性1b型HCV感染者及其系列血清样本均来自中国人HCV感染患者系列标本库(CQueen cohort)。对每例感染者3个连续时间点的血清样本进行HCV5′端6000bp基因组的扩增、克隆,每个时间点随机挑选25～33个克隆对E2基因测序,用MEGA软件构建系统进化树,用固定效应似然法检测HCV E2基因的正选择位点。结果:3例HCV慢性感染者的9份血清样本均获清晰、无杂带的6030bp的目的片段。慢性HCV感染者体内病毒准种的复杂程度并非随着感染时间的延长而进行性增加,在某个时间点上准种变异株的序列可能会趋于一致。准种优势变异株在间隔半年时间以上已发生更替。对每位患者动态的准种变异株进行正选择位点的分析,共检测到5个氨基酸(aa)位点:aa384、aa399、aa410、aa475和aa522,分布于HCV E2基因HVR1区、HVR2区及HCV E2-CD81分子结合区。结论:基于动态变化的HCV准种优势株的相关研究,可考虑选择间隔半年以上时间点的血清样本作为研究对象。慢性HCV感染过程中,HCV E2基因位于重要功能区的aa位点受到了宿主强烈的免疫压力,aa384、aa399及aa410位点的变异可能导致HCV发生体液免疫逃逸;而aa475和aa522位点的变异则可能通过影响HVR2区的功能或HCV E2-CD81分子的亲和力或改变CD81分子的结构而导致HCV发生先天免疫逃逸。该研究为分析HCV C-NS3基因片段的正选择位点奠定了良好的基础。

北京市同性恋HIV-1感染者的包膜基因C2-V3区序列测定和亚型分析

目的 了解北京市同性恋HIV-1感染者HIV-1的亚型类型及传播来源和流行时间。方法 应用套式聚合酶链式反应（PCR）对12份1993～2001年北京市HIV-1阳性同性恋者外周血单个核细胞（PBMC）的核酸样品进行扩增,并对其包膜区的C2-V3段的306个核酸序列进行测定和分析。结果12份样品全部是B亚型的HIV-1毒株序列,其亚型内的基因离散率为 10.35± 2.06,与国际 A-E亚型共享序列比较后发现其与 A、C、D、E亚型的共享序列的基因离散率均大于 25％,而与国际 B亚型共享序列的基因离散率仅为11.25±3.60。系统树分析显示,12个毒株与B亚型共享序列聚在一起并远离其它国际亚型,并且12个毒株与SF162紧密相连,而与国际B亚型共享序列和泰国B亚型代表株TH14可以分开。对gp120中最重要的中和抗体决定簇V3环序列进行对比分析发现,12毒株在V3环中变化较大,其中4毒株带有GPGR这一欧美B亚型V3环顶端四肽序列特征,占33.33％,1个毒株带有GLGR,占8.33％,而其它7个毒株为GWGR,占58.34％。结论HIV-1在北京市同性恋人群中流行的为B亚型,流行来源为欧美,流行时间10年左右,V3环顶端四肽序列特征以GWGR为主。

HBV包膜-核心蛋白融合基因DNA疫苗诱导小鼠持久的细胞免疫应答

构建编码HBV包膜 核心蛋白融合基因的DNA疫苗pSC、pSS1S2C和编码HBV包膜蛋白或核心蛋白基因的DNA疫苗 pHBs、pHBc ,分别肌肉注射免疫BALB/c小鼠 ,检测小鼠的血清抗体、T细胞增殖和细胞毒性T淋巴细胞反应 ,比较融合基因DNA疫苗与单基因DNA疫苗诱生免疫应答的强度 ,发现融合基因DNA疫苗诱生抗体的效率明显不及单基因DNA疫苗 ,但其能诱导更强、更持久的细胞免疫应答 ,表明HBV包膜 核心蛋白融合基因DNA疫苗对于治疗慢性乙型肝炎可能比单基因DNA疫苗更为有效 .

灭活前后HIV-1包膜基因变异的研究

目的 深入了解HIV在灭活因素作用下包膜基因变异。方法 对HIV - 1B3亚型毒株在S/D法及低pH法灭活作用前后的样品 ,套式PCR扩增其包膜基因C2～C3区 5 6 4bp的核酸片段 ,进行核苷酸序列测定和分析。结果 两种方法灭活前后 ,包膜基因变异均不显著 ,核苷酸同源性均为 98%。结论 S/D法及低 pH法灭活作用前后HIV包膜基因变异不显著。

人类疱疹病毒8型包膜糖蛋白编码基因K8.1的分离、克隆及在大肠杆菌中的表达

目的:分离、克隆人类疱疹病毒8型(HHV-8)包膜糖蛋白K8.1编码基因,并置于大肠杆菌中作融合表达。方法:设计一对PCR引物,在引物的5'端分别引入BamHⅠ、XhoⅠ酶切位点,以佛波酯(TPA)刺激的原发性渗出性淋巴瘤(PEL)细胞系BCBL-1细胞总DNA为模板,PCR扩增出K8.1编码基因,克隆至原核表达载体pGEX-6p-1中,构建含K8.1基因重组质粒。重组质粒转化大肠杆菌(E.coli)BL21感受态细胞,以异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达融合蛋白。结果:分离、克隆的411bp序列与基因数据库中所登记的HHV-8K8.1序列呈现100%同源性。IPTG诱导后的菌体,经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE),显示有一个41ku的融合表达蛋白产生。结论:HHV-8K8.1编码基因在E.coli中初步获得正确表达。

KSHV包膜糖蛋白编码基因K8.1、K8.1A和gL的克隆及真核表达

目的:克隆并在293T细胞中表达卡波济肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)包膜糖蛋白编码基因K8.1、K8.1A与gL。方法:以BCBL-1细胞总DNA为模板,用PCR方法扩增出K8.1和gL基因;以BCBL-1细胞的总RNA为模板,通过RT-PCR的方法扩增出K8.1A基因。将PCR产物克隆进真核载体pcDNA3.1(+)内,分别构建含K8.1、K8.1A和gL基因的重组真核表达质粒。重组质粒转染293T细胞,用Westernblot的方法检测K8.1和K8.1A在293T细胞中的表达;RT-PCR方法检测gL基因在293T细胞中的转录。结果:核酸序列分析的结果表明,克隆的K8.1、K8.1A和gL基因与GenBank中已登记的KSHVK8.1、K8.1A和gL基因序列100%同源。Westernblot结果显示,在约35ku位置有目的条带,与预期的重组K8.1和K8.1A蛋白大小一致。RT-PCR结果显示约在500bp位置检测到特异性条带。结论:KSHVK8.1、K8.1A和gL编码基因在293T细胞中获得正确表达。

体外传代HIV-1包膜基因高变区变异性研究

目的 了解体外传代HIV -1包膜基因高变区的变异性 ,以深入了解HIV -1在自然状态下的生物学性状 ,为艾滋病的预防和治疗提供基础资料。 方法 经MT4细胞连续传代、反复冻融传代、反复更换宿主细胞传代、施加灭活因素 (酸性条件及S/D)传代等多种不同方式体外传代培养HIV。套式PCR扩增其包膜基因 ,克隆测序并分析不同高变区氨基酸的变异性。 结果 各种方式传代HIV -1包膜基因各高变区变异均不显著 ,V3区变异不高于其它V区。不存在变异显著V区。 结论 传代HIV包膜基因稳定 ,不存在变异显著V区。

羊棘球蚴(包虫)病基因工程亚单位疫苗的效果监测

为了解羊棘球蚴（包虫）病基因工程亚单位疫苗对包虫病防控的效果，我们在新疆某地区进行了持续的疫苗使用情况监测。试验结果显示：疫苗免疫后ELISA抗体检测呈阳性，2011年该地区羊棘球蚴患病率高迭57％，2012～2014年患病率分别为26．0％、8．53％、4．63％；2011～2014年犬粪中棘球蚴虫卵的检出率从14．1％下降至7．4％。说明该疫苗对羊包虫病的传播起到了明显的抑制作用。

人类8型疱疹病毒K8.1N基因编码包膜糖蛋白的原核表达及其抗原特异性分析

目的:制备人类8型疱疹病毒(HHV-8)K8.1N基因编码包膜糖蛋白的原核表达融合蛋白,并鉴定其抗原特异性。方法:将重组质粒pET41a-K8.1N转化大肠杆菌BL21感受态细胞,异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达谷胱甘肽S转移酶(GST)/K8.1N融合蛋白,经Glutathione Sepharose4B亲和层析柱纯化。采用Western blot法观察GST/K8.1N融合蛋白(作为抗原)与新疆地区、法国卡波西肉瘤(KS)患者血清以及四川健康儿童血清的血清学反应。结果:IPTG诱导后的菌体裂解蛋白,经12%聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)后,显示有一个46kD的融合蛋白表达,经Westernblot法鉴定此融合蛋白能被KS患者血清特异性地识别,新疆地区KS患者血清检出率为78.6%,法国KS为12.0%,四川健康儿童血清无一例与GST/K8.1N融合蛋白发生反应。结论:HHV-8包膜糖蛋白编码基因在大肠杆菌BL21中获得正确表达,并与KS患者血清具有特异识别性。

西藏羊免疫羊棘球蚴(包虫)病基因工程疫苗(Eg95)的效果研究

为了评价羊棘球蚴(包虫)病基因工程亚单位疫苗对川西北高原牧区西藏羊的免疫效果,本试验将西藏羊随机均分为免疫组和对照组,免疫组羊按免疫剂量接种包虫病疫苗,28 d后加强免疫,对照组羊不接种。在加强免疫30 d后采集血液制备血清,用间接ELISA法检测血清中的特异性抗体,同时剖解部分试验羊,检查肺脏和肝脏中的包囊数量,统计保护率。结果显示:免疫组羊首免28 d后抗体阳性率为77.9%,加强免疫30 d后抗体阳性率为95.4%,与免疫前和对照组比较差异显著(P<0.05);剖检部分试验羊统计包囊数量,得出保护率达到了75.0%。本试验表明,羊棘球蚴(包虫)病基因工程亚单位疫苗对阿坝地区西藏羊的棘球蚴病具有预防控制作用。

添加剂对CaO基钢包渣系性能影响的脱磷研究

为改善CaO基钢包渣性能以控制钢包中钢液回磷和进行钢液炉外脱磷 ,分别以Li2 O、Na2 O、K2 O、BaO作添加剂替代模拟的CaO基钢包渣系中等质量分数的CaO ,研究添加剂对该渣系的熔点、粘度、脱磷及控制钢液回磷能力的影响 结果表明 :该 4种添加剂均可有效地降低渣系的熔点和粘度 ,其中Li2 O效果最明显 ;加入添加剂使CaO基钢包渣系的脱磷及控制钢液回磷能力大幅度提高 。

羊棘球蚴(包虫)基因工程亚单位疫苗与口蹄疫灭活疫苗及小反刍兽疫活疫苗联合使用的免疫效果分析

为分析羊棘球蚴(包虫)基因工程亚单位疫苗(GESV)与羊口蹄疫灭活疫苗(IFMDV)及小反刍兽疫活疫苗(LPPRV)联合使用的免疫效果。本试验采用羊棘球蚴基因工程亚单位疫苗与口蹄疫O型、A型二价灭活疫苗及小反刍兽疫活疫苗联合免疫绵羊,观察绵羊不良反应。采用间接ELISA法和液相阻断ELISA法分别测定绵羊血清中抗羊棘球蚴主要保护性抗原Eg95蛋白的抗体和口蹄疫抗体及小反刍兽疫抗体水平。结果显示GESV(皮下)和IFMDV(肌肉)及LPPRV(皮下)联合免疫绵羊后,仅个别羊出现一过性体温升高的免疫反应现象,未见明显的不良反应;同时,绵羊血清中抗羊棘球蚴主要保护性抗原Eg95蛋白的抗体水平明显高于单独免疫GESV组(P<0.05),且不影响口蹄疫抗体及小反刍兽疫抗体水平(P>0.05)。表示GESV与IFMDV及LPPRV联合使用具有良好的安全性,且可提高GESV的免疫效果。

羊棘球蚴病基因工程亚单位疫苗免疫效果检测

使用羊棘球蚴(包虫)病基因工程亚单位疫苗对绵羔羊进行一免、二免,中间间隔1个月时间。一免后60天抗体阳性率维持在75%,有保护力的抗体占15%;二免后抗体水平较高,持续时间较长,有效保护力在6个月以上,并且有保护力的抗体占45%以上。根据此实验结果我们制定了合理的免疫程序用于生产中。

丙型肝炎病毒包膜基因变异与急性丙型肝炎疾病转归的动态研究

目的 探讨HCV包膜基因变异与急性丙型肝炎疾病转归的关系。方法 前瞻性收集到5例HCV急性感染者的系列血清标本，其中2例一过性感染，3例持续性感染。采用高精确度DNA聚合酶，较长PCR扩增HCV基因组结构区（包括C区C端、E1和E2区N端）1kb产物并进行克隆，每份标本挑选33个克隆，以异源双链和单链构象多态分析筛查的代表性克隆型DNA进行测序，并对HCV的E1、HVR1及HVR1除外的E2区核酸序列的非同义碱基替换率、同义碱基替换率以及氨基酸序列的理化特征进行分析。结果 HCV持续性感染者急性期与慢性期的标本比较，HVR1基因差异性明显大于E1（0．0322±0．0068 vs-0．0020±0．0014，P〈0．05）和HVR1以外的E2区（0．0322±0．0068VS0．0017±0．0011，P〈0．05），而一过性感染者感染初期与病毒清除前标本比较，HVR1、E1和HVRl以外E2基因差异性则无明显改变。＂HCV持续性感染者的E1（0．23×10^-3±0．15×10^-3）、HVR1（2．76×10^-3±1．51×10^-3）和HVR1以外E2区（0．50×10^-3±0．10×10^-3）的非同义碱基替换率比较，HVR1非同义碱基替换率呈明显增高趋势。相反，一过性感染者E1、HVR1和HVR1以外E2区的同义碱基替换率和非同义碱基替换率则无明显改变。E1、E2区所有半胱氨酸及潜在的糖基化天冬酰胺均高度保守，HVR1第11、25、27位置保持碱性氨基酸。结论 HCV持续感染与宿主免疫反应对HVR1的阳性选择相关，HVR1区特异位置保守的碱性氨基酸可供研制HCV疫苗时参考。

羊棘球蚴病疫苗免疫山羊后的抗体水平检测

棘球蚴病又叫包虫病,是人和动物感染细粒棘球绦虫及多房棘球绦虫幼虫所致的疾病。本试验采用不同的免疫程序分两次免疫羊包虫病疫苗,并于免疫后4、8、12、20、28、42周分别采集血清用间接ELISA法检测抗体水平。结果显示:首次免疫后4周抗体水平达到最高并维持一定时间,第28周抗体水平处于临界值;两次免疫的羊在42周时的抗体阳性率仍达到88.9%。