X连锁迟发性脊椎骨骺发育不良家系TRAPPC2基因缺失突变的高通量测序分析

目的·研究一个X连锁迟发性脊椎骨骺发育不良(spondyloepiphyseal dysplasia tarda,SEDT)家系的致病基因及突变类型。方法·提取一个SEDT家系6名成员外周血基因组DNA。应用Clearseq遗传性疾病试剂盒靶向捕获先证者基因组样本中与罕见遗传性疾病相关的致病区域,并进行高通量测序,过滤去除高频突变。采用外显子组隐马尔科夫模型(exome hidden Markov model,XHMM)分析拷贝数变异(copy number variant,CNV),并进一步对6名家系成员基因缺失片段的拷贝数进行实时定量PCR分析。结果·高通量测序分析结果显示,先证者X染色体存在2.5 kb缺失(chrX:13732385~13734927),该区域覆盖转运蛋白复合体亚单位2(transport protein particle complex subunit 2,TRAPPC2)基因的第4~6个外显子。定量PCR结果证实先证者及其表哥均存在该缺失,先证者母亲为杂合缺失,先证者父亲、姐姐和表型正常的舅舅拷贝数均正常。结论·TRAPPC2基因第4~6个外显子片段的缺失为SEDT的致病性突变;同时高通量测序分析中运用XHMM算法可检测到致病基因多个外显子的缺失。

种猪繁育与育肥场猪瘟E2基因工程疫苗免疫效果的调查与研究

为探究猪瘟E2基因工程亚单位疫苗相比于传统猪瘟C株弱毒疫苗(脾淋源)在免疫与生产上的优势,本文以汉中某一地方品种种猪场和代养场为调查对象,选择一批繁育母猪和育肥仔猪分别免疫猪瘟E2基因工程亚单位疫苗和猪瘟活苗,对比结果发现,母猪免疫猪瘟E2亚单位疫苗后哺乳仔猪断奶成活率平均提高了16.3%;且接种的两种猪瘟疫苗对育肥仔猪的免疫效果差异极显著(P<0.01),其中E2亚单位疫苗相比于猪瘟活疫苗能够明显提高育肥仔猪抗体阻断率和降低离散度,有助于育肥仔猪的健康生长,这为规模化猪场在选择猪瘟疫苗时提供重要参考依据。

基因工程疫苗在畜禽疫病防制中的应用

随着现代生物科技的发展,基因工程疫苗在畜禽疫病防制领域发挥着重要的意义。与传统疫苗相比,基因工程疫苗具有更高的安全性、稳定性和免疫效果好的特性,被广泛应用于畜禽疫病防制中。本文主要论述基因工程亚单位疫苗、重组活载体疫苗、基因缺失疫苗和核酸(DNA)疫苗在疫病防制中的具体应用,以期为我国畜牧业的健康发展提供有益的参考和借鉴。

新城疫3组基因亚单位疫苗的免疫原性试验

将 3个融合表达重组菌 p GHN/ DE3、p GF/ DE3和 p GF/ E.coli复苏后进行酶切鉴定 ,确认无误后均经 1m mol/L 的 IPTG诱导 ,然后分组 3次免疫鸡。试验鸡血清经血球凝集抑制试验 (HI)和微量细胞中和试验 (SN)来检测 HI抗体和 SN抗体。结果表明 :重组菌 p GHN/ DE3所生产的亚单位苗免疫鸡后 ,可激发较高的 HI抗体 ,但激发的中和抗体较弱。与 系 NDV常规疫苗相比 ,3个重组大肠杆菌基因工程苗所诱发的中和抗体效价较弱。对各组中起关键作用的中和抗体进行方差分析表明 ,3个基因工程菌所诱发的中和抗体与常规疫苗免疫组和基础免疫对照相比 ,差异显著。因此 ,尽管 3种基因工程苗产生了中和抗体 ,但中和抗体效价上升缓慢 ,HI抗体效价上升较快。

大肠杆菌F107菌毛A亚单位基因的克隆与鉴定

用 PCR技术 ,从水肿病大肠杆菌临床分离株中扩增出 F1 0 7A亚单位基因 ( fed A)的 51 0 bp的全序列 .将该 PCR扩增产物在 Bam H 和 Eco R 位点克隆进 p UC1 8质粒载体 ,并转化大肠杆菌 TG1,再根据限制性内切酶酶切分析筛选出含有 fed A的重组质粒 pf1 0 7G.将重组质粒进行序列测定 ,结果表明 :此重组质粒中的插入序列与发表的 fed A是一致的 ,证明该重组质粒就是含有 fed

A组牛轮状病毒基因工程亚单位疫苗的初步研究

目的构建轮状病毒外膜蛋白VP4、VP7基因与大肠杆菌LTB蛋白基因的重组表达载体,研究重组表达蛋白的免疫原性,为研制犊牛腹泻基因工程亚单位疫苗奠定基础。方法克隆A组牛轮状病毒临床分离株CHLY的VP4、VP7基因和大肠杆菌LTB基因,插入pET32a中构建了4个原核表达载体pET32a/VP7、pET32a/VP4、pET32a/VP7-LTB、pET32a/VP4-LTB,转化到BL21(DE3)中进行表达纯化,纯化蛋白与弗氏佐剂混合免疫10 w龄雌鼠,在实验期间对雌鼠进行交配,对其所产乳鼠用150μL10-6.5/0.1 mL TCID50的轮状病毒进行攻毒以研究重组蛋白免疫原性和攻毒保护性。结果重组蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中以包涵体的形式存在,Bandscan扫描分析结果显示,它们分别占菌体总蛋白的35%、20%、30%、18%,利用Ni-NTA Agarose在变性条件下成功纯化得到高纯度重组蛋白。10 w龄雌鼠免疫试验表明rVP4-LTB组激发了最强的免疫反应,rVP4组次之,rVP7-LTB组略高于rVP7,各个免疫组间的差异性不显著(P>0.05),各实验组IgG抗体水平显著高于空质粒对照组(P<0.01)。雌鼠所产乳鼠的攻毒实验表明,免疫组雌鼠所产乳鼠腹泻率为13.35%～23.8%,腹泻持续时间为48h～72h,较空质粒对照组明显降低,腹泻症状较轻且症状持续时间明显缩短。四个重组蛋白组攻毒保护率为76.2%～86.7%,rVP7-LTBr、VP4-LTB两组略高于rVP7r、VP4组,但相互间差异不显著(P>0.05)。结论重组蛋白具有较好的免疫原性,被免疫雌鼠体内产生的中和性抗体可以经被动免疫过程传递至子代,并为仔鼠提供保护。本研究为犊牛轮状病毒基因工程疫苗的研究奠定了一定的基础。

G蛋白β3亚单位基因多态性与奥氮平所致体重增加的相关性

目的探讨G蛋白β3亚单位(G-proteinβ3 subunit,GNB3)基因C825T多态性与精神分裂症患者使用奥氮平治疗过程中体重增加的关系。方法对90例首次住院的精神分裂症患者予奥氮平治疗12周,监测治疗前后的体重、体重指数(body mass index,BMI)变化,并检测患者GNB3基因C825T多态性,分析基因多态性与体重变化的相关性。结果治疗后患者体重、BMI增加有统计学意义(均P<0.01)。TT基因型者治疗后的增重率(weight gain rate,WGR)及BMI增加较CC基因型者更明显(均P<0.01),携T等位基因(TT型+CT型)者治疗后的WGR及BMI增加较非携T等位基因(CC型)者更明显(均P<0.01)。治疗后WGR≥7%者GNB3基因C825T基因型分布(CC型15.69%,CT型54.90%,TT型29.41%)与WGR<7%者(CC型38.46%,CT型43.59%,TT型17.95%)差异有统计学意义(P<0.05),WGR≥7%者T等位基因频率(63.33%)高于WGR<7%者(39.74%)(P<0.05)。多因素线性回归显示TT基因型(以CC型为参照)影响奥氮平治疗后的体重变化(β=1.83,标准化β=0.29,P<0.01)。结论 GNB3基因C825T多态性与奥氮平所致的体重增加有关。

大肠杆菌F18菌毛A亚单位基因(fedA)的克隆与序列测定

利用PCR技术 ,分别从产F18ab菌毛的猪水肿病大肠杆菌分离株G及产F18ac菌毛的大肠杆菌 8813株中扩增出 5 10bp左右的F18菌毛A亚单位基因 (fedA)。将这 2个PCR扩增产物按预定阅读框架克隆入pGEX 6p 1载体的谷胱甘肽S 转移酶 (GST)基因的下游 ,筛选获得阳性重组质粒 ,并对质粒中的插入序列进行测定。序列分析表明 :F18ab与F18ac的fedA基因的核苷酸序列同源性为 97.6 % ,推导的氨基酸序列同源性为 94.7% ,两者的主要区别在于F18acfedA基因的第 36 3bp处比F18ab多 3个核苷酸 ,并出现一个新的酶切位点 (NgoMI)

原发性高血压患者G蛋白β_3亚单位基因C825T多态性的研究

目的 :研究中国大陆高血压人群中G蛋白 β3 亚单位 (GNB3)基因C82 5T多态性的分布及与血浆肾素 血管紧张素系统 (RAS)活性的关系。方法 :确诊原发性高血压的患者 4 0 8例作为试验组 ,14 0例健康成年人作为正常对照组 ,6 1例有高血压家族史的健康成年人作为高血压家族史阳性正常对照组。C/T多态性测定采用PCR -RFLP方法。结果 :各组GNB382 5T等位基因频率为 4 5 .6 %～ 5 6 .4 % ,各基因型在原发性高血压患者与正常人间分布差异无显著性。TT型高血压患者有较高的醛固酮水平和较低的血浆血管紧张素转换酶活性。结论 :G蛋白β3 亚单位 82 5TT基因型的中国大陆人群原发性高血压患者有较高的醛固酮水平和较低的血浆血管紧张素转换酶活性。

棘球蚴基因工程亚单位疫苗免疫绵羊的效果研究

采用羊棘球蚴基因工程亚单位疫苗对2 315只3~20月龄藏系绵羊进行3次免疫试验,并用间接ELISA对免疫后的抗体进行动态监测。检测结果显示,首免前、首免1周后、二免1周后、二免1年后、三免1周后、三免后6个月的血清抗体阳性率依次为0%、98.75%、94.94%、40.74%、98.72%、50%。同时,对同龄、同群、同草场放牧的羊三免1年后进行剖检,免疫组59只、对照组60只。结果显示,对照组感染率、感染强度为86.67%和3.43,免疫组感染率、感染强度为45.76%和0.86,免疫保护率(减囊率)为69.38%。

人端粒酶催化亚单位基因单核苷酸多态性与胃癌的关系

目的探讨人端粒酶催化亚单位基因（human telomerase catalytic subunit，hTERT）Ex2-659A／G位点单核苷酸多态性与胃癌患者发病风险的关系。方法对甘肃西部三家医院外科手术切除168例胃癌患者（病例组）和同期在上述医院查体的健康人群156例（对照组）进行病例对照研究；采用聚合酶链反应和限制性片段长度多态性技术（PCR—RFLP）对2组进行基因型分析，比较各基因型分布频率和发病风险的关系。结果病例组hTERT Ex2-659A／G位点AA、AG、GG基因型的频率与对照组相比无显著差异。病例组A、G等位基因频率分别为44．74％和55．26％，对照组为43．42％和56．58％，2组A、G等位基因型频率比较有显著性差异（χ^2=5．3734，P=0．0204）。与G／G基因型相比，A／G和A／A2种基因型的个体患胃癌的危险度（OR）分别为0．519（95％CI：0．310—0．870，P=0．013）、0．550（95％CI：0．255～1．188，P=0．128）。结论hTERT Ex2-659A／G单核苷酸多态性可能为胃癌的保护因素。

牛新孢子虫NcSAG1基因工程亚单位疫苗的免疫试验

为了解新孢子虫NcSAG1表面蛋白基因工程亚单位疫苗对实验动物的免疫效果,本试验提取延边黄牛新孢子虫野毒株基因组DNA,用PCR技术扩增新孢子虫NcSAG1表面蛋白基因,并在大肠杆菌中进行原核表达,将Western-blot鉴定具有免疫活性的重组蛋白与弗氏佐剂混合制备NcSAG1基因工程亚单位疫苗,免疫BALB/c小鼠,应用间接ELISA方法测定体液免疫水平,应用流式细胞技术测定细胞免疫水平,以此评价疫苗对实验动物的免疫应答反应。结果显示,制备的NcSAG1基因工程亚单位疫苗免疫BALB/c小鼠后,在三免后第3天时,检测抗体的OD450nm值达0.688;CD4+/CD8+值达3.650,均显著高于重组蛋白免疫组和PBS对照组,说明制备的基因工程亚单位疫苗能够提高实验动物的体液免疫和细胞免疫水平。本试验为牛新孢子虫NcSAG1表面蛋白基因工程亚单位疫苗的深入研究奠定了基础。

人类T型钙通道α_(1H)亚单位基因在细胞增殖中的功能研究

将人类T型钙通道α1H 亚单位基因 (CACNA1H)cDNA转染到HEK 2 93(humanembroyonickidney)细胞系得到稳定过量表达的细胞株 ,以此为体外模型来研究T型钙通道在细胞增殖中的直接作用。RT -PCR和标准全细胞膜片钳记录分别从mRNA转录水平和T型钙通道蛋白功能水平验证了α1H 亚单位的过量表达。生长曲线结果表明 ,T型钙通道α1H 亚单位基因的过量表达能显著促进HEK - 2 93细胞增殖 ,将细胞群体倍增时间从对照细胞的 2 2 1± 1.1h缩短到稳定转染细胞的 14 0± 0 .4h ,细胞群体倍增时间缩短了约 8h ;流式细胞分析结果表明 ,在稳定转染细胞处于S期的细胞百分率比对照细胞高 ,相反地处于G1 期的百分率比对照细胞低 ,以上结果证明了过量表达T型钙通道亚单位α1H 基因能促进细胞增殖。Western印迹结果提示 ,T型钙通道α1H 亚单位基因表达产物是通过某种信号途径 ,提高了与细胞周期有关基因 (CDK2、cyclinA和cyclinE)的蛋白质表达水平 ,从而刺激了细胞周期的进程。

猪水肿病毒素A亚单位基因的克隆及表达的尝试

以聚合酶链式反应 ( PCR)技术从大肠杆菌 TB1中扩增出猪水肿病毒素 ( SLT- IIe)的 A亚单位基因的 960 bp。将此 PCR扩增产物 ( slt- IIe A)在 Eco RI和 Bam HI位点间克隆进质粒p UC1 8中 ,获得了重组质粒 p1 8slt- IIe A,经 Micro Genic computer program分析证明在其整个序列中含有与已发表的 slt- IIe序列相同的序列 ,说明质粒 p1 8slt- IIe A是含有 slt- IIe A的重组质粒。切割重组质粒 p1 8slt- IIe A,将 slt- IIe A基因插入到表达性质粒载体 p GEX- 6p- 1中处于谷胱苷肽转移酶 ( GST)基因的下游 ,构建成重组质粒 ppslt- IIe A,并证明其中含有 slt- IIe A基因。然而 ,与原初预计结果相反 ,受到质粒 ppslt- IIe A转染的大肠杆菌 BL2 1 (名为重组质粒 PPSLT- IIe A)在不同温度条件、不同培养时间和不同 IPTG浓度下 ,却未表达预期的融合蛋白 GST- SLT- IIe A。本文对未能表达一事的可能原因进行了讨论。

重庆市部分脑卒中病人G蛋白β3亚单位基因多态性研究

目的 观察重庆市脑卒中病人G蛋白 β3亚单位基因 (GNB3)C82 5T多态性 ,探讨脑卒中发生的遗传学机制。 方法 急性缺血性脑卒中患者 72例 ,并按性别、年龄配对设对照组。取血标本提取白细胞DNA ,用PCR方法扩增目的基因 ,用限制性内切酶 (BseDI)酶切PCR产物用于基因分型 ,同时观察高血压病 (EH)等疾病家族史。结果 脑卒中组GNB3C82 5T基因型分布 (基因型频率CC =0 .32 ,CT =0 .5 8,TT =0 .10 )与对照组有显著差别 (基因型频率CC =0 .6 5 ,CT =0 .32 ,TT =0 .0 3;χ2 =14 .6 ,P <0 .0 1) ,但在脑卒中病人中有或无EH亚组之间基因型分布无差别。Logistic回归分析显示 ,82 5T等位基因和EH家族史与脑卒中有关联 ,82 5T等位基因携带者与CC纯合子比较有较高的患脑卒中的风险 (OR =4 .17,95 %CI 1.71 10 .15 ,P <0 .0 1)。结论 GNB3基因C82 5T多态性的T等位基因是重庆市缺血性脑卒中发病的遗传危险因子 ,遗传造成EH易感性的同时也造成了脑卒中的易感性。

Dravet综合征患儿临床表型与神经元钠离子通道α1亚单位基因突变的相关性分析

目的探讨神经元钠离子通道α1亚单位(SCN1A)基因突变阳性的Dravet综合征患儿的临床表型特点,从而了解Dravet综合征患儿的病变程度与SCN1A基因突变的相关性。方法回顾性分析2014年1月至2017年1月在海南省农垦三亚医院小儿门诊就诊的43例Dravet综合征患儿及其家系成员的临床资料和SCN1A基因检测结果,以及患儿的心电图、脑电图及核磁共振检查结果。结果 31例Dravet综合征患儿发现SCN1A基因突变阳性,突变类型包括错义突变,移码突变、大片段缺失。SCN1A^+组患儿发病年龄为(4.32±0.84)月,小于SCN1A^-组(t=2.354;P<0.05)。1岁前月发作频率SCN1A^+组为3.24±1.13,而SCN1A^-组为1.77±0.45(t=2.435;P<0.05)。SCN1A^+组患儿1年内发生癫痫持续状态次数明显高于SCN1A^-组(t=2.311;P<0.05)。SCN1A^+组中19例患儿出现不同程度的智力减退,而SCN1A^-组中3例患儿出现智力减退(P<0.05)。SCN1A^+组中16例患儿EEG出现背景弥漫性慢波活动,21例为多棘慢波。SCN1A^-组中,2例患儿EEG出现背景弥漫性慢波活动,3例为多棘慢波,两组差异有统计学意义(P<0.05)。结论本研究表明,相比于SCN1A^-组,SCN1A^+组Dravet综合征患儿发病年龄小,1月前发病次数及平均每年发生癫痫持续状态次数多,智力减退患儿比例大,以及脑电图出现背景弥漫性慢波活动、多棘慢波等异常活动比例大。

GABA_A和GABA_C受体各亚单位基因在鲫鱼视网膜内的分布──原位杂交组织化学法研究

应用原位杂交组织化学技术，利用同位素［￣（３５）Ｓ］－ｄＡＴＰ标记的寡核苷酸探针，在鲫鱼视网膜观察了含ＧＡＢＡＡ受体α１、α３、α４、α６，β１－３，γ１－２及ＧＡＢＡＣ受体ρ１亚单位ｍＲＮＡ的神经元分布。在外核层，所有测试的亚单位均无表达；而在内核层和神经节细胞层，除α４和γ２亚单位外，均有不同程度的表达。在不同区域标记神经元的数量和标记强度各不相同，α１亚单位广泛分布在内核层的远端、中部及神经节细胞层，呈强阳性；α３亚单位相对稀少，主要分布在内核层近端和神经节细胞层，呈中等阳性；α４和α６亚单位几乎无阳性表达，仅α６亚单位在神经节细胞层呈弱阳性。β１和β２亚单位在内核层及神经节细胞层呈中等阳性；β３亚单位主要分布在内核层，在神经节细胞层标记细胞较少，呈弱阳性。γ１亚单位分布在整个内核层，在神经节细胞层有零星阳性表达。ＧＡＢＡＣ受体主要分布在内核层，ρ１亚单位主要分布在内核层的远端及中间部分，呈强阳性，而在神经节细胞层表达相对较弱。这种独特的表达型式与其功能密切相关。

CAV基因工程亚单位苗与IBDV二联灭活疫苗的研究

IBDV为自行分离的 VVIBDV COB-C1组织毒 ,毒价为 CEL D50 1 0 5.6 / 0 .2 m L ,CAV为 VP1和 VP2基因克隆进家蚕杆状病毒转基因载体质粒中 ,后经重组 ,筛选后获得的重组VP1和 VP2基因产物。IBDV经甲醛灭活后与CAV按适当比例混合。 1∶ 4与白油佐剂研制成油包水型乳化剂二联疫苗 ,经安全试验、免疫保护试验证明该二联灭活疫苗安全有效 ,免疫种鸡群后可使其后代产生 IBDV和 CAV抗体 。

产气荚膜梭菌α蛋白的高效可溶性表达与基因工程亚单位疫苗的制备

通过优化α蛋白的密码子、去除蛋白信号肽、选择亲水性与抗原性较好的序列、优化表达条件等方法,在大肠杆菌表达系统中获得了高效表达的产气荚膜梭菌可溶性重组α蛋白,用该蛋白免疫小鼠,再用间接ELISA方法测定血清抗体水平。结果表明:针对A型、B型、C型和D型产气荚膜梭菌的保护率分别为100%、90%、85%和90%,小鼠三免后7~14 d抗体效价达到峰值。该研究表达的α蛋白具有较好的免疫原性,可进一步用于研制预防产气荚膜梭菌的基因工程亚单位疫苗。

G蛋白β_3亚单位基因C825T多态性与2型糖尿病的关系

目的 观察合肥地区 2型糖尿病患者G蛋白 β3 亚单位C82 5T (GNβ3 C82 5T)多态性 ,探讨其与 2型糖尿病(T2DM)的关系。方法 采用聚合酶链式反应和限制性片段长度多态技术 (PCR RFLP)来检测单纯T2DM患者 191例 ,T2DM合并高血压患者 (HT) 10 2例和对照人群 70例的GNβ3 C82 5T基因型 ,并进行病例对照统计分析。结果 对照组基因型频率CC、CT、TT为 34 3%、5 0 %、15 7% ,等位基因频率C、T分别为 5 9%、4 1% ;T2DM组基因型频率CC、CT、TT为 32 5 %、4 9 7%、17 8% ,等位基因频率C、T分别为 5 7%、4 3% ;T2DM +HT组CC、CT、TT为 2 6 5 %、5 0 %、2 3 5 % ,等位基因频率C、T分别为 5 1%、4 9% ;三组间基因型频率比较 χ2 =2 6 88,P =0 6 11;三组间等位基因频率比较 χ2 =2 5 86 ,P =0 2 74 ,C82 5T多态性与对照组比较差异无显著性。结论 在本人群中GNβ3 C82 5T多态性与T2DM无关系。