活化TLR9的牛种布氏菌基因外重复回文序列筛选及活性检测

目的筛选具有活化Toll样受体9(TLR9)的牛种布氏菌基因外重复回文序列(Repetitive Extragenic Palindrome Squence,REPs)并检测其活性,为布氏菌病的治疗提供新思路。方法基于Brucella abortus A13334基因组序列,利用生物信息学技术识别其REPs后,合成序列。将合成的天然骨架的脱氧寡核苷酸(ODNs)转染小鼠单核巨噬细胞株RAW264.7,以ELISA检测IFN-α的分泌水平。采用TLR9-siRNA沉默RAW264.7中的TLR9,将上述诱导IFN-α分泌增加的阳性ODN序列转染RAW264.7,ELISA方法检测IFN-α的分泌变化。结果筛选出1 857条牛种布氏菌REPs,选择2级茎环结构较好的5条ODNs序列进行合成,ELISA方法检测显示ODNs M4、M5介导IFN-α分泌量显著高于阴性对照(P<0.05),且阳性ODN M5所介导的IFN-α分泌可以被TLR9-siRNA显著抑制。结论布氏菌基因组中存在可以活化TLR9信号通路的REPs,此结果有助于对布氏菌致病和免疫机制的认识。

副溶血性弧菌重复序列-PCR分型研究

利用基因外重复回文序列-PCR(REP-PCR)和肠细菌基因间共有重复序列-PCR(ERIC-PCR)技术,对副溶血性弧菌进行了分子分型研究和亲缘关系的探讨,并使用Hunter和Gaston方法计算分辨力指数。结果显示40株副溶血性弧菌分离株均可扩增产生可重复的DNA指纹图谱,并且不同菌株基因组DNA的扩增条带具有多态性。根据SPSS10.0软件得出的树状图结果,REP-PCR可以把40株菌分为21个型,分辨力指数可达到0.953,优势菌型为G1型;ERIC-PCR可将40株菌分成4个型,分辨力指数为0.5。研究显示重复序列-PCR方法可以用于该菌分型分析,REP-PCR具有较好的分型能力。在两种PCR的DNA指纹图谱中,血清型O1群与O3群主条带均非常相似,表明它们之间亲缘关系密切。

羊种布氏杆菌基因外重复回文序列经Toll样受体9诱导IFN-α表达的研究

目的 筛选具有活化Toll样受体9（TLR9）活性的羊种布氏杆菌DNA中基因外重复回文序列（REPs）,检测其经TLR9诱导的干扰素-α（IFN-α）表达,为羊种布氏杆菌病的防治提供新思路.方法 针对羊种布氏杆菌Brucella melitensis NI基因组序列,利用生物信息学技术识别其REPs后,合成序列.将合成的天然骨架脱氧寡核苷酸（ODNs）转染小鼠单核巨噬细胞株RAW264.7,酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测IFN-α的分泌水平.采用TLR9-siRNA沉默RAW264.7中的TLR9,将上述诱导IFN-α分泌增加的阳性ODN序列转染RAW264.7,ELISA方法检测IFN-α的分泌变化.结果 筛选获得2 200个羊种布氏杆菌基因组REPs,选择二级茎环结构较好的12条ODNs序列进行合成,ELISA结果显示,ODNs M2、M3、M4、M5、M6、M7、M9、M12介导IFN-α分泌量分别为（26.944±1.868）、（46.461±2.562）、（34.980±2.055）、（43.016±2.162）、（62.533±4.031）、（67.125±5.069）、（18.908±1.633）、（39.572±2.465）pg/ml,显著高于阴性对照组的（12.594±1.338）pg/ml,差异有统计学意义（t=10.817、20.295、15.812、20.724、20.365、18.016、5.180、16.660,均P＜0.05）,且阳性ODN M6所介导的IFN-α分泌可以被TLR9-siRNA显著抑制.结论 羊种布氏杆菌基因组REPs可经TLR9信号通路引起炎性因子IFN-α分泌增加,参与介导羊种布氏杆菌早期感染后的固有免疫应答.

3种基因分型方法在鲍曼不动杆菌中的应用评价

目的比较3种基因分型方法在鲍曼不动杆菌中的应用。方法采用琼脂稀释法检测重症监护室（ICU）分离的30株鲍曼不动杆菌的最小抑菌浓度（MIC）;分别以肠杆菌科基因间重复一致性序列（ERIC）、基因外回文重复序列（REP）及随机多态性核苷酸序列（RAPD）为引物进行PCR扩增,利用电泳指纹图谱进行基因分型,并进行聚类分析。结果 30株鲍曼不动杆菌仅对头孢哌酮/舒巴坦有较低的耐药率;ERIC-PCR基因分型法的扩增条带最为丰富,能扩增出4∽7个条带,RAPD和REP-PCR扩增条带较少,分别扩增出1∽5和1∽4个条带;3种方法分别将30株鲍曼不动杆菌分为4、4、3个群。结论头孢哌酮/舒巴坦对于多重耐药鲍曼不动杆菌依然有较好的敏感性;本试验初步证实3种方法均可作为鲍曼不动杆菌基因分型的可选方法,ERIC-PCR较另外两种方法扩增条带更丰富,分辨率更好。

骨科医院多重耐药鲍曼不动杆菌耐药性与基因同源性分析

目的：分析骨科医院多重耐药鲍曼不动杆菌（MDR-AB）的耐药情况及基因分型。方法对2016年1月～7月临床检出的34株 MDR-AB进行药敏分析，水煮法提取菌落DNA；以基因外回文重复序列（repetitive extragenic palindromic， REP）为引物进行PCR扩增（REP-PCR），对凝胶电泳条带进行分型分析。结果34株MDR-AB对17种抗生素中的15种药物耐药率在70％以上，对复方新诺明耐药率稍低为62％，对左旋氧氟沙星耐药率最低为15％。REP-PCR 将34株MDR-AB分为Ⅰ，Ⅱ和Ⅲ三个基因型，其中Ⅰ型为主要的流行型别。结论骨科医院 MDR-AB感染情况严重，且主要由同一种基因型构成，临床应合理使用抗菌药物，定期监测耐药性变迁，避免院内传播。

老年人根面菌斑内氏放线菌临床分离株基因型多样性分析

目的分析老年人根面菌斑中内氏放线菌临床株的基因型多样性,探讨内氏放线菌基因型与根面龋的关系。方法选择老年根面龋患者20例设为根面龋组,无根面龋老年人20例设为无龋组。根面龋组以暴露的无龋根面和根面龋损部位为取样位点,无龋组以暴露的根面为取样位点,刮取菌斑进行临床株的分离鉴定,并利用基因外重复回文序列聚合酶链反应(REP-PCR)分析内氏放线菌基因型的多样性。结果 2组共分离出内氏放线菌299株,选择156株进行REP-PCR分析,分离出61个不同的基因型。根面龋组无龋根面分离的57株内氏放线菌有25个基因型,根面龋损部位分离的34株有25个基因型,无龋组分离的65株有26个基因型:内氏放线菌基因型存在多样性。单个取样位点的基因型数目存在差异(P<0.05)。结论多种基因型的内氏放线菌参与了根面龋的发生。

耐阿米卡星铜绿假单胞菌氨基糖苷类耐药基因及其基因型研究

目的了解耐阿米卡星(AMK)铜绿假单胞菌(Pa)的氨基糖苷类修饰酶基因和氨基糖苷耐药基因的存在情况及其基因型。方法对临床分离的72株多重耐药Pa(其中对AMK耐药Pa组和对AMK敏感Pa组各36株)分别用聚合酶链反应(PCR)测定9种主要的氨基糖苷类修饰酶基因和2种氨基糖苷耐药基因,用基因外重复回文序列(REP)-PCR进行基因型研究。结果在分组研究中AMK耐药Pa组表现为aac(6′)-Ⅰ和aac(3)-Ⅱ基因同时阳性的占42.4%,aac(6′)-Ⅰ和ant(2″)-Ⅰ基因同时阳性的占36.4%,是耐药组的主要修饰酶基因;AMK敏感Pa组表现为aac(6′)-Ⅰ基因阳性的占50.0%,aac(3)-Ⅱ基因阳性的占33.2%,是敏感组的主要修饰酶基因。2种氨基糖苷耐药基因(RmtA和RmtD)均为阴性。REP-PCR显示耐药菌株可分为A～G 7型,其中AMK耐药Pa组的主要分型为F型(其中尤以F1型为多);AMK敏感Pa组以E型为多见。结论通过2种或多种氨基糖苷类修饰酶同时作用于AMK是Pa对AMK耐药的重要途径之一。

新疆维吾尔族肠道中高产胞外多糖双歧杆菌的筛选及其抗氧化活性

使用Wilkins-Chalgren厌氧菌琼脂和BSM培养基作为筛选平板,结合重复基因外回文序列-聚合酶链式反应和16S rRNA序列分析,对新疆维吾尔族婴儿及其母亲粪便中的双歧杆菌(Bifidobacterium)进行分离鉴定,并筛选出高产胞外多糖的双歧杆菌,测定其多糖的抗氧化活性以及菌株的耐受性和黏附性。结果显示,20份粪便样品中共分离出52株双歧杆菌,其中假小链双歧杆菌(B.pseudocatenulatum)14株,假长双歧杆菌(B.pseudolongum)8株,两歧双歧杆菌(B.bifidum)9株,短双歧杆菌(B.breve)7株,长双歧杆菌婴儿亚种(B.longum subsp.infantis)5株,动物双歧杆菌乳亚种(B.animal subsp.lactis)6株以及长双歧杆菌(B.longum)3株。经过表型初筛和苯酚-硫酸法复筛,共筛选出7株高产胞外多糖的双歧杆菌,37℃发酵36 h后胞外多糖产量均可达400 mg/L以上。抗氧化活性实验结果表明7株双歧杆菌所产的胞外多糖对过氧化氢自由基、超氧阴离子自由基、羟自由基和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基均有一定的清除能力。此外,菌株BF66-16相较于其他几株双歧杆菌具有较强的胃肠液耐受性以及黏附性,因此来源于婴儿粪便的BF66-16可以作为潜在的抗氧化菌株应用于制药和食品工业中。

REP-PCR及ERIC-PCR法对分离自海产品副溶血性弧菌分型分析

目的:采用细菌基因外重复回文序列扩增(REP-PCR)和肠道细菌基因间重复序列扩增(ERIC-PCR)两种方法对副溶血性弧菌2株标准株,13株实验室保存菌株和73株分离菌株共88株进行分子分型。方法:通过REP和ERIC-PCR指纹图谱扩增,利用NTsys-pc软件采用Dice系数对指纹图谱进行聚类结果分析。结果:所有供试菌株可通过此两种方法进行分型得到清晰的指纹图谱,并反映出副溶血性弧菌具有丰富的遗传多样性,REP-PCR扩增出5～9条分布在609～4200bp之间的条带,可将副溶血性弧菌分为5个群12类型,分辨指数达0.93,其中tdh+株在相似系数0.86时可聚类在第Ⅰ群;ERIC-PCR扩增出5～11条分布在400～7593bp之间的条带,将副溶血性弧菌分为7个群11个类型,分辨指数为0.94,其中tdh+株在相似系数0.76时可聚类在第Ⅰ群。结论:两种方法均显现出很好的分型能力,能够很好地将环境分离tdh+菌株和标准菌株聚类在一起,其中REP-PCR较ERIC-PCR重复性更好。

25株耐碳青霉烯类抗生素鲍曼不动杆菌的耐药机制研究

目的:了解临床分离的耐碳青霉烯类抗生素鲍曼不动杆菌的耐药谱特征、同源性及碳青霉烯酶的产生状况。方法:采用PHOENIX100自动化细菌鉴定药敏系统及纸片扩散法进行药敏试验;基因外重复回文序列PCR(REP-PCR)法分析其基因同源性;聚合酶链反应(PCR)检测β内酰胺酶基因,并对扩增出的碳青霉烯酶基因进行序列分析;对整合子基因进行PCR检测。等电聚焦电泳测定β内酰胺酶的等电点。碱裂解法提取质粒。结果:2003年1月～2005年12月我院共分离到30株碳青霉烯类中介或耐药的鲍曼不动杆菌,其中儿科ICU病房9株,外科ICU病房12株。菌株表现为多重耐药,但儿科ICU与其他病房分离株的耐药谱有差异。对存活的非重复的25株菌进行检测,REP-PCR图谱分为A、B、C、D4个基因型,A型7株集中在儿科ICU,16株属于B型,C型和D型各1株。PCR检出10株菌携带OXA-23基因,其中包括7株儿科ICU的碳青霉烯类耐药菌,而外科ICU分离的耐药菌株不具有OXA-23基因。所有菌株均未能检出OXA-24、IMP及VIM基因。有20株携带PER-1型酶基因。22株细菌检测出Ⅰ型整合子基因结构(大小约180～3500bp)。结论:本院碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌流行主要为医院感染所致,儿科ICU分离的菌株对碳青霉烯类耐药的主要机制为产生OXA-23型酶,外科ICU分离的菌株对碳青霉烯类耐药的主要机制则可能为膜通透性降低的原因。

沙尘天气气载耐甲氧西林葡萄球菌监测及其REP-PCR指纹图谱分析

目的了解沙尘天气时空气中葡萄球菌浓度及气载MRSA的遗传多样性,为临床葡萄球菌病的防控提供科学依据。方法用LWC-1型离心式空气微生物采样器采集火车站、学校、公园、广场等场所空气并分离鉴定其中的葡萄球菌,采用REP-PCR扩增不同源MRSA的基因组DNA形成聚类图谱,分析不同源MRSA的相似性。结果气载金黄色葡萄球菌和凝固酶阴性葡萄球菌浓度沙尘天气时浓度均明显增高,与正常天气时的浓度差异有统计学意义(P<0.05);在火车站中最高,浓度分别为116.7CFU/m^3和162.0CFU/m^3。从空气中共分离得到金黄色葡萄球菌111株,其中MRSA20株;凝固酶阴性葡萄球菌179株,其中MRCNS共11株。20株气载MRSA图谱显示菌株相似性在48%~100%之间;气载MRSA与医院临床MRSA分离株之间的相似性在50%~100%之间;与动物源MRSA之间的相似性在40%~100%之间。结论沙尘天气空气中存在着多种葡萄球菌,而且空气中的部分MRSA株与医院临床分离株及动物源的MRSA有着较高的遗传相似性,应加强空气中葡萄球菌尤其是耐药葡萄球菌的监测及防控。

副溶血性弧菌重复序列-PCR分型研究

目的利用REP-PCR技术对副溶血性弧菌进行分子分型研究和亲缘关系的探讨。方法以基因外重复回文序列(REP)为引物,对20株副溶血性弧菌基因组DNA进行扩增,得到DNA指纹图谱,并利用SPSS 11.5统计软件对DNA扩增图谱进行分析,做出聚类图,并与血清型进行比较分析。结果 REP-PCR可以把20株菌分为7个型,优势菌型为A型和B型,分辨力指数为0.932。结论 REP-PCR方法可以用于副溶血性弧菌分型分析,具有较好的分型能力,如果能将分子分型和血清分型两种方法联用,分辨率会更高。研究推断血清型O1群与O3群菌株之间亲缘关系密切。