非小细胞肺癌A549细胞基因组不稳定性和MYC基因突变在吉西他滨耐药中的作用

目的:探讨非小细胞肺癌(NSCLC)A549细胞基因不稳定性和MYC基因突变在吉西他滨耐药中的作用,并阐明其作用机制。方法:采用2mg·L^(-1)吉西他滨持续作用A549细胞(A549组),构建耐药细胞株A549R(A549R组),并将si-NC和si-MYC转染至A549R细胞,作为si-NC A549R组和si-MYC A549R组。采用CCK-8法检测不同浓度(0、1、2、4、8、16和32 mg·L^(-1))吉西他滨对各组细胞的抑制率,流式细胞术检测各组细胞凋亡率。转录组测序技术(RNA-seq)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)信号通路富集分析A549组及A549R组细胞中的差异表达基因,实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测A549组和A549R组细胞中基因组不稳定性相关基因错配修复基因2(MSH2)、错配修复基因6(MSH6)和DNA修复蛋白RAD50(RAD50)的表达水平,Western blotting法检测基因组不稳定性相关蛋白MYC原癌基因(MYC)和磷酸化组蛋白(γH2AX)的表达水平,染色质免疫共沉淀(ChIP)法检测RNA polⅡ和γH2AX在MYC基因上的富集程度,PCR法扩增并检测A549R细胞MYC基因突变情况。结果:与A549组比较,2、4、8、16和32 mg·L^(-1)吉西他滨作用后A549R组细胞抑制率降低(P<0.05),8mg·L^(-1)吉西他滨作用后细胞凋亡率降低(P<0.05)。与A549组比较,A549R组细胞中有234个mRNAs表达水平升高,205个mRNAs表达水平降低,其中错配修复相关基因(MSH2和MSH6)、RAD50和MYC表达水平明显升高(P<0.05)。KEGG信号通路富集分析,表达水平升高基因主要参与非同源末端连接、mRNA监测途径和DNA复制等信号通路。与A549组比较,A549R组细胞中MYC和γH2AX蛋白表达水平升高(P<0.05)。ChIP法检测,RNA polⅡ和γH2AX在MYC转录起始位点及exon 2上富集程度增加,MYC exon 2上存在G254A基因突变。与si-NC A549R组比较,si-MYC A549R组细胞中MYC mRNA和蛋白表达水平降低(P<0.05),2、4、8、16和32 mg·L^(-1)吉西他滨作用后si-MYC A549R组细胞抑制率升高(P<0.05),细胞凋亡率增加(P<0.05)。结论:对吉西他滨耐药的NSCLC细胞中A549R基因组不稳定性增加,MYC基因发生突变和扩增,而敲减MYC可以恢复A549R细胞对吉西他滨的敏感性。

9种大豆制品中转基因成分定性PCR检测

本研究从豆粕、豆粉、豆腐等9种大豆产品中提取到高质量的DNA,在对内标准基因Lectin进行扩增的基础上,设计相应的特异性引物,建立了稳定的定性PCR反应体系,对35S启动子基因、外源目的基因Cp4-epsps基因进行了扩增,发现豆粕、豆奶粉、豆腐、豆皮、豆豉中含有转基因成分,而其它产品中未发现转基因成分存在。

欧洲黑杨转基因稳定性及对土壤微生物的影响

利用PCR分析技术 ,分析了田间试验已达 7a的转Bt基因欧洲黑杨的基因稳定性 ,并对其林地和非转基因林地的土壤微生物进行了类群数量分析。PCR分析表明Bt基因仍然存在于转基因植株中 ,转基因植株与对照杂交后代Bt基因分离呈 1∶1比例 ,符合孟德尔遗传分离规律 ,表明基因仍稳定存在。计数结果表明转基因林地中转基因植株与非转基因植株间根系土壤 3大类微生物 (细菌、放线菌和霉菌 )数量无显著差异 ,转基因林地与非转基因林地 (邻近杨树林地和健杨林地 )间的土壤 3大类微生物 (细菌、放线菌和霉菌 )数量无显著差异 ,说明转基因欧洲黑杨对土壤微生物系统尚没有明显的影响。

流行性乙型脑炎减毒活疫苗SA_(14)-14-2E基因的稳定性

分别对SA14 - 14- 2 (PHK8代 )疫苗株及其原野毒株SA14 和另 2个疫苗传代株 [SA14 - 14- 2 (PHK17代 )和SA14 - 14- 2 (鼠脑 1代 ) ]的E区基因进行了序列测定。结果表明 ,乙脑病毒减毒活疫苗SA14 - 14- 2在PHK细胞上连传至 17代时 ,发现 2个氨基酸突变 (E - 331、E - 398) ,但不是回复突变。虽然在毒力最容易返祖的乳鼠脑内传 1代后发生E - 10 7个氨基酸回复 ,但与野毒株毒力相比仍然相差很大 ,无毒力返祖现象。在疫苗的实际质控工作中 ,对上述与毒力相关的基因进行监测 ,可能有助于发现减毒活疫苗的毒力水平 ,为疫苗安全性提供更可靠的检测手段。

同源重组修复基因RAD51可提高PTEN缺失细胞基因组稳定性

目的:研究同源重组修复基因RAD51对PTEN缺失小鼠胚胎成纤维细胞基因组稳定性的影响。方法:应用免疫荧光和中性单细胞电泳技术观察PTEN缺失后自发性和辐射诱导DNA双链断裂情况;并构建PTEN缺失细胞稳定转染RAD51的细胞系,γ射线照射后检测细胞存活率。结果:PTEN缺失导致细胞自发性和辐射诱导DNA双链断裂增多;转染RAD51后细胞存活率增高,辐射诱导的DNA双链断裂减少。结论:同源重组修复基因RAD51可以提高PTEN缺失细胞基因组稳定性。

DNA损伤检验点与损伤修复及基因组稳定性(英文)

生物有机体基因组DNA经常会受到内源或外源因素的影响而导致结构发生变化,产生损伤;在长期进化过程中,有机体也相应形成了一系列应对与修复损伤DNA,并维持染色体基因组正常结构功能的机制。其中DNA损伤检验点(DNA damage checkpoint)就是在感应DNA损伤的基础上,对损伤感应信号进行转导,或引起细胞周期的暂停, 从而使细胞有足够的时间对损伤DNA进行修复,或最终导致细胞发生凋亡。DNA损伤检验点信号转导途径是一个高度保守的信号感应过程,整个途径大致可以分为损伤感应、信号传递及信号效应3个组成部分。其中3-磷脂酰肌醇激酶家族类成员ATM (ataxia-telangiectasia mutated) 和ATR (ataxia-telangiectasia and Rad3-related) 活性的增加构成整个途径活化的第一步。它们通过激活下游的效应激酶,Chk2/Chk1,通过协同作用许多其他调控细胞周期、DNA复制、DNA损伤修复及细胞凋亡等过程的蛋白质因子来实现细胞对DNA损伤的高度协调反应。近十几年,随着此领域研究的不断深入,人们逐步揭示了DNA损伤检验点途径发生过程中,各种核心组分通过与不同调节因子、效应因子及DNA损伤修复蛋白间的复杂相互作用,以实现监测感应异常DNA结构并实施相应反应的机制;其中,检验点衔接因子(mediators)以及染色质结构,尤其是核小体组蛋白的共价修饰在调控ATM/ATR活性,促进ATM/ATR与底物间的相互作用以及介导DNA损伤位点周围染色质区域上多蛋白复合物在时间与空间上的动态形成发挥着重要的作用。同时,人们也开始发现DNA损伤检验点途径与DNA损伤修复、基因组稳定性以及肿瘤发生等过程之间某些内在的联系。该反应途径在通过协调细胞针对DNA损伤做出各种反应的基础上,直接或间接地参与或调控DNA损伤修复过程,并与DNA损伤修复途径协同作用最终保证染色体基因组结构的完整性,而检验点途径的改变,则会引起基因组不稳定的发生,包括从突变频率的提高到大范围的染色体重排,以及染色体数量的畸变。如:突变发生在肿瘤形成早期,会大大增加肿瘤发生的几率。文章将对DNA损伤检验点途径机制及其对DNA损伤修复、基因组稳定性影响的最新进展进行综述。

流行性乙型脑炎减毒活疫苗生产毒种(SA14-14-2株)及其疫苗的表型和E基因稳定性研究

目的 对乙脑减毒活疫苗SA14 14 2株生产毒种及其疫苗病毒滴度、脑内毒力和E区核苷酸序列进行回顾性测定。方法 应用乳金黄地鼠肾传代细胞 (BHK 2 1)结晶紫蚀斑法进行病毒滴度的测定 ,小鼠脑内法检测疫苗脑内毒力。应用RT PCR方法扩增SA14 14 2生产毒种和疫苗E区的核苷酸 ,经凝胶层析纯化的PCR产物直接用于测序或克隆到pGEM T载体中 ,经酶切和PCR鉴定后进行测序。结果 疫苗在 - 2 0℃保存长达 10多年 ,疫苗病毒滴度下降不超过 0 5lg;脑内毒力未见毒力回升。病毒蚀斑形态仍保持较SA14野毒株形态小的特性 ;以不同批次疫苗和生产毒种提取的病毒RNA作为模板进行RT PCR扩增 ,扩增的基因片段与预期大小一致 ;E区基因序列与野毒株差异的 8个氨基酸没有一个发生回复突变。结论 SA14 14

毛白杨杂种外源基因稳定性及其对土壤微生物的影响

转基因植物外源基因的稳定性、对土壤微生物种群数量的影响以及外源基因是否水平转移到土壤微生物中,是评估转基因植物生态安全性的重要组成部分。本研究利用PCR技术,分析了种植于山东省东营市试验林达3年的转AhDREB1基因毛白杨杂种(毛新杨×毛白杨)的外源基因稳定性,表明AhDREB1基因仍然存在于转基因植株中。采用平板稀释法对转基因与非转基因植株的根系土壤微生物进行种群数量分析,计数结果表明转基因植株与非转基因植株间根系土壤3大类微生物(细菌、放线菌和真菌)数量无显著差异。利用AhDREB1基因特异引物对土壤总DNA以及菌株DNA进行PCR扩增,均未检测到外源基因扩增产物。研究结果表明该转基因毛白杨杂种对土壤微生物系统尚无明显的影响。

乙型脑炎病毒SA_(14)-14-2减毒疫苗株的生物学和基因稳定性

目的研究乙型脑炎病毒(JEV)SA14-14-2减毒疫苗株传代过程中的生物学和基因稳定性,为疫苗的安全性和免疫原性提供依据。方法将JEVSA14-14-2减毒疫苗株PHKC7代病毒在原代地鼠肾细胞(PHKC)上连续传代,检测各代次病毒的培养特性以及第8、12、17和22代病毒的安全性及免疫原性;对起止代次病毒(PHKC8和22代)进行全基因组序列测定,对中间代次病毒(PHKC12和17代)的结构蛋白基因进行测序,并与基因库乙脑病毒SA14-14-2株(D90195)比较。结果各代次病毒产生的细胞病变基本一致,病毒滴度在17代前较稳定;在BHK21细胞上形成的蚀斑形态一致;小鼠脑内的致病力未发生变化,乳鼠传代返祖试验高代次病毒毒力有升高趋势。8、12、17和22代病毒免疫小鼠后,对P3强毒攻击均具有保护作用。E蛋白核苷酸和氨基酸序列,PHKC8代与D90195完全一致;而PHKC12、17和22代出现单个碱基(第2142或2143位)突变,导致E389氨基酸改变(D→N或D→A),但并非回复突变。4个代次病毒的PrM-C区结构蛋白基因均未发生变化。PHKC8、22代病毒的其他核苷酸突变发生在基因组非结构蛋白区和3′端非编码区;全序列PHKC8和22代与D90195比较,发现7～8个核苷酸不同,导致3～4个氨基酸的差异,核苷酸和氨基酸的同源性分别大于99.93%和99.88%,且以上突变不存在于明确的相关减毒位点上。结论JEVSA14-14-2减毒疫苗株在PHKC上连续传15代,仍保持高度的生物学和基因稳定性,疫苗生产用病毒控制在10代以内较为安全。

R环的形成及对基因组稳定性的影响

R-环是由一个RNA:DNA杂交体和一条单链状态的DNA分子共同组成的三链核酸结构。其中,RNA:DNA杂交体的形成起因于基因转录所合成的RNA分子不能与模板分开,或RNA分子重新与一段双链DNA分子中的一条链杂交。在基因转录过程中,当转录泡遇到富含G碱基的非模板链区或位于某些与人类疾病有关的三核苷酸卫星DNA时,转录泡后方累积的负超螺旋可促进R环形成。同时,新生RNA分子未被及时加工、成熟或未被快速转运到细胞质等因素也会催生R环。研究表明,细胞拥有多种管理R环的方法,可以有效地管理R环的形成和处理已经形成的R环,以尽量避免R环对DNA复制、基因突变和同源重组产生不利影响。文章重点分析了R-环的形成机制及R环对DNA复制、基因突变和同源重组的影响,并针对R-环诱导的DNA复制在某些三核苷酸重复扩增有关的神经肌肉退行性疾病发生过程中的作用进行了分析和讨论。

DNA修复障碍、基因组不稳定性与癌症

全文介绍DNA修复机制,并指出未修复的DNA损伤在细胞中的生物学终点和由DNA修复障碍所引起的基因组不稳定性增加,以及遗传性疾病,其中大部分有发生不同类型癌症的倾向。随着DNA修复系统及其与癌症关系研究的深入,其发病机理将得到阐明,并为防治这类疾病提供线索。

低剂量辐射诱导的基因组不稳定性与DNA甲基化相关性研究

低剂量辐射(low dose radiation,LDR)以远后效应形式危害人类健康,其中辐射诱导的基因组不稳定性(radiation-induced genomic instability,RIGI)是辐射致癌的主要原因。这其中涉及的机制仍未完全阐明。近年研究表明RIGI与表观遗传学密切相关,包括DNA甲基化、组蛋白修饰、非编码RNA等。文章就RIGI与DNA甲基化的关系作一综述。

鼻咽癌的基因不稳定性

目的：探讨鼻咽癌基因不稳定性对预后的意义。方法：运用单一重复序列间多聚酶链反应（inter-SSRPCR）对38位鼻咽癌患者基因不稳定性进行评估;运用测序和巢式PCR对不同肿瘤的突变片段进行检测。结果：38位患者中有31位（81.6%）显示了基因组失稳,其失稳指数范围为0%～16.2%。6个肿瘤的6q27染色体上证实有获得性基因损害。低于5年生存期患者其基因失稳程度显著高于超过5年生存期的患者（P〈0.05）。结论：基因组失稳可作为鼻咽癌发生的早期标志,并且基因组失稳程度加重提示肿瘤预后不良。

不同剂量γ射线照射诱发CHL细胞基因组不稳定性的研究

采用单细胞凝胶电泳技术和微核检测技术对60Coγ射线照射诱发中国仓鼠肺细胞(CHL细胞)产生的直接效应、基因组不稳定性进行了初步探讨。将对数生长期的细胞分成不同的剂量组,经γ射线照射后,对受照存活细胞进行单细胞凝胶电泳(SCGE)和微核发生率(MF)的测定。同时,将一部分受照存活细胞继续传代培养,待其传至33代时,再给予2 Gy的照射剂量进行二次照射,然后再进行单细胞凝胶电泳和MF的测定。结果表明,首次照射剂量与子代二次照射后的损伤程度存在剂量-效应关系。本实验为探讨辐射诱发基因组不稳定性的研究提供了实验基础。

PML与基因组稳定性

基因组稳定性同肿瘤的发生、发展密切相关,维护基因组稳定性对于细胞行使正常的生理功能是至关重要的.早幼粒细胞白血病蛋白PML(promyelocyticleukemia)主要借助分子中RBCC结构,同近50种有重要功能的蛋白相互作用而形成PMLNBs(PMLnuclearbodies).PMLNBs是与核基质结合的、动态的、亚核多蛋白复合物,它作为区室化核结构(compartmentalizednucleararchitecture)———染色质间区室(interchromatincompartment)的功能单位,满足了真核基因高层次表达调控模式的时空要求.最新的研究证明:PML是基因组稳定性“守门人”———p53分子的搭档分子,同样在基因组稳定性调控中发挥着重要的功能作用.它协同p53参与了DNA损伤反应所诱发的细胞凋亡,还可组织多种DNA修复分子参与DNA损伤修复,在DNA损伤反应中具有重要作用;此外,PML还通过调控auroraA的活性参与中心体复制检查点调控,借助调控survivin的表达参与有丝分裂纺锤体组装检查点调控,在染色体复制和细胞分裂中均显示了重要的调控作用.而当PML表达缺失或不足时则与多种肿瘤的发生、发展相关联,因此PML分子在维护基因组稳定性中具有重要功能作用,本文仅就相关的最新研究进展予以概述.

叶酸、核黄素缺乏及MTHFR A1298C多态性对人淋巴细胞基因组遗传稳定性的影响

背景与目的：叶酸代谢涉及DNA合成及甲基化等重要生化过程,对维持人类遗传稳定性意义重大。亚甲基四氢叶酸还原酶（methylene tetrahydrofolate reductase,MTHFR）对上述两个生化过程之间的分支走向发挥着关键作用,核黄素作为MTHFR的重要辅助成分,亦可能干涉MTHFR的功能,进而影响到遗传稳定性。本研究拟探讨叶酸、核黄素缺乏以及MTHFR基因1298位点多态性对人类淋巴细胞基因组稳定性的综合影响。材料与方法：采用胞质分裂阻断微核分析法研究叶酸（20、200nmol/L,即LF、HF）和核黄素（1、500nmol/L,即LR、HR）不同浓度组合以及MTHFRA1298C多态性对培养9d的人类淋巴细胞基因组稳定性的影响。结果：各MTHFR基因型淋巴细胞在低叶酸高核黄素组合培养条件下的遗传损伤程度均高于所有其它组合,而高叶酸低核黄素组达最低（P〈0.01）,各基因型淋巴细胞在高叶酸条件下的微核化双核细胞（MNed BNC）、核质桥（NPB）和核芽（BUD）频率分别为低叶酸条件的46.5%、22%和42.3%;而高核黄素条件下的相应指标则比低核黄素高约6.3%~12.4%;MTHFR1298AA型遗传稳定性显著高于突变纯合子MTHFR1298CC（P〈0.01）;叶酸对MNed BNC、NPB、BUD的变异贡献率分别达到91.61%、73.72%和78.07%（P〈0.01）;核黄素及MTHFRA1298C多态性对遗传损伤的变异贡献虽接近或达到显著水平,但均不及叶酸;叶酸、核黄素和MTHFR基因型之间的交互作用对上述遗传损伤标记没有显著影响。结论：叶酸、核黄素和MTHFRA1298C多态性都在一定程度上对基因组稳定性有影响,但相比之下,叶酸在我们的研究中是影响基因组稳定性的主导因素。

GADD45α参与维持基因组稳定性并发挥肿瘤抑制效应的多样性分子机制

哺乳动物细胞在遭受应激损伤因素刺激时会启动一系列信号传导通路,从而引发细胞周期阻滞、DNA修复或细胞凋亡等效应,这些机制的异常与肿瘤的发生发展密切相关。GADD45α作为生长阻滞及DNA损伤诱导基因编码家族的一员,参与维持基因组稳定性、调控细胞周期行进、DNA损伤修复、细胞衰老及细胞凋亡等多种生物学过程,在肿瘤发生发展和肿瘤抑制反应中具有重要作用。我们简要综述了GADD45α参与维持基因组稳定性并发挥肿瘤抑制效应的分子机制。

流行性乙型脑炎病毒减毒株SA14-14-2E基因稳定性研究

为研究乙脑病毒减毒株SA14-14-2 E蛋白基因稳定性,将乙脑病毒减毒株SA14-14-2在原代地鼠肾细胞(PHK)上传至18代,应用RT-PCR分别扩增PHK6代、PHK7代、PHK8代、PHK13代、PHK18代E蛋白基因并测序后,与Genebank中乙脑病毒减毒株SA14-14-2(D90195)进行比较分析。PHK6、PHK7、PHK8代病毒与D90195 E蛋白核苷酸和氨基酸序列完全相同。PHK13、PHK18代病毒与D90195E蛋白核苷酸序列同源性分别为99.8%、99.7%,与D90195E蛋白氨基酸序列同源性分别为99.6%、99.4%。各代次病毒E蛋白与减毒相关氨基酸未发生改变,同时所有突变的氨基酸均非SA14原有的,故不是恢复性突变。结果表明乙脑病毒减毒株SA14-14-2的遗传学特性稳定,从分子水平证明乙脑病毒减毒株SA14-14-2及其生产的疫苗具有安全性。

交叉接种后固氮放线菌基因稳定性研究

放线菌Frankia与放线菌根植物在根瘤中共生的现象发生在8科24属被子植物上.系统发育分析表明:Frankia可分为4个族,其菌株对寄主植物有明显的偏好性.用大理旱冬瓜根瘤接种昆明和武定旱冬瓜幼苗,收集幼苗上的根瘤,再对幼苗接种数次.用武定旱冬瓜和川滇桤木幼苗做同样实验,最后对Frankia的16SrRNA基因进行ARDRA分析,发现接种幼苗根瘤中Frankia与接种根瘤中Frankia产生相同的16SrRNA基因ARDRA带型.

DNA修复——基因组稳定性护卫机制的原创与发现之旅

基因组DNA是遗传的物质基础,编码的信息指导生物种系的复制延续、生命体的生长发育和代谢活动。无论是在外环境因素的应激压力下还是处于正常状态,DNA损伤时刻在发生,由此,DNA损伤修复作为重要的细胞内在机制,在维护基因组稳定性、降低癌症等人类系列重大疾病风险中发挥了不可替代作用。三位科学家汤姆·林达尔(Tomas Lindahl)、阿齐兹·桑贾尔(Aziz Sancar)、保罗·莫德里奇(Paul Modrich)因发现和揭示DNA修复及其机制的杰出贡献,获得2015年诺贝尔化学奖。本文综述了三位获奖者分别在DNA损伤的碱基切除修复、核苷酸切除修复和错配修复研究中的原创发现,以及相应的修复通路机制的描绘。此3种修复通路,主要是针对紫外线和化学物所致DNA的碱基损伤、嘧啶二聚体及加合物或者DNA复制过程中发生的碱基错误配对的修复。恰巧,2015年拉斯克基础医学研究奖授予的两位科学家,也因他们揭示了DNA损伤应答现象和机制研究的重大贡献而获奖,本文也呈现了获奖者的关键性科学发现。最后,简要展望了中国DNA损伤修复领域的发展。