海南省类鼻疽伯克霍尔德菌临床分离株的基因岛特征和毒力因子分析

目的分析类鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderia pseudomallei)临床分离株的基因岛(genomic island,GI)特征和毒力因子差异,为类鼻疽病的诊疗研究提供依据。方法收集B.pseudomallei临床分离株,PCR检测和测序分析毒力相关GI,在Islandviewr 4平台上提交全基因组序列注释格式文件,整合SIGI-HMM与IslandPath-DIMOB两种算法预测GI,通过序列比对分析GI独特性和毒力因子差异。结果共收集到52株B.pseudomallei临床分离株,结果显示,52个基因组按进化距离分为3个分枝,其中82.69%(43/52)菌株集中在分枝1。52个B.pseudomallei基因组共识别出828个GI,按序列相似性聚类为157个GI cluster。GI在基因组中占比达2.05%~6.38%。GI cluster1和2存在全部菌株中,但84个(53.50%)GI cluster只聚类到单个基因组。10个GI cluster很可能是特有的,其中5个来源同属细菌,2个来源其他属,3个来源不确定。25个GI cluster与毒力相关,B.pseudomallei BP76和BP169含有其中8个,是所有菌株中毒力相关GI最多的。52株B.pseudomallei的毒力基因除了fhaB1、fhaB2、BPSL1661、cheY1、wzM、tssH-5/clpV、tssA-5、boaA和boaB存在差异,其余都表现一致。与泰国和澳大利亚B.pseudomallei临床菌株比较,boaA、boaB、cheY1和chbp在两个国家的菌株中都表现出差异,同时fhaB1、fhaB3和bimA在澳大利亚菌株中表现出差异。结论海南地区B.pseudomallei GI具有保守性和独特性,通过特有GI和毒力因子研究,可以发现菌株水平基因转移(Horizontal gene transfer,HGT)的来源和分子水平的毒力差异。

海洋假交替单胞菌SM9913中基因岛GIPspSM9913的鉴定和功能研究

海洋细菌由于所处环境的复杂性和多变性,进化出独特的环境适应机制。基因岛通常携带宿主细菌环境适应性有关的基因,在推动细菌环境适应性和基因组多样化中起重要作用。假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas)在各种海洋生境中广泛分布,具有重要的工业应用价值和生态修复潜力。文章以深海沉积物中分离的假交替单胞菌SM9913为研究对象,通过与表层海水中分离的假交替单胞菌TAC125进行比较基因组学分析,发现SM9913基因组上yicC基因内部整合了一个18kb的基因岛,我们命名为GIPsp SM9913。该基因岛编码整合酶、切离酶以及多套限制修饰系统。数据库检索分析发现GIPsp SM9913同源的基因岛在假交替单胞菌、希瓦氏菌(Shewanella)、弧菌(Vibrio)和气单胞菌(Aeromonas)等细菌中广泛存在。定量PCR结果显示,当切离酶表达时,GIPsp SM9913会从基因组上大量切离,产生无基因岛的SM9913突变株。测序分析表明,GIPsp SM9913的切除不会影响整合位点侧翼基因的表达。比较切离突变株与野生菌的运动能力、电转化频率和接合转移效率等,发现GIPsp SM9913可以提高宿主细菌的泳动能力和对外源DNA入侵的抵御能力。

猪链球菌2型新基因岛SSGI4的发现

目的通过比较猪链球菌2型强毒株与弱毒株和无毒株的基因组差异,发现新的基因岛,探讨猪链球菌的基因群水平转移及其与致病性之间的关系。方法在已知猪链球菌2型强毒株全基因组序列和对可能基因岛的分析基础上,通过DNA测序和生物信息学分析,对基因岛的结构进行分析鉴定,并预测其功能。结果发现了一个只存在于猪链球菌2型中国强毒株,而在弱毒株和无毒株中整体缺失的新基因岛,命名为SSGI4。基因岛全长11 269bp,G+C含量(36.8%)明显低于基因组总G+C含量(41.1%),基因岛两端均有10bp的正向重复序列,并且末端携带有噬菌体整合酶基因,显示很可能是通过溶原性噬菌体整合入基因组。基因岛包含11个编码基因,部分基因推测为可能的膜表面蛋白基因或氨基酸结合蛋白基因。结论新发现的基因岛SSGI4具有致病性基因岛的各项典型特征,可能与猪链球菌2型强毒株的致病性有关,具有深入研究的价值。

林麝源屎肠球菌LS170308株多重耐药基因岛PRI1分析

屎肠球菌作为条件致病菌在临床上报道的越来越多,主要引起宿主心内膜炎、败血症等,目前关于屎肠球菌的耐药性研究已日益突出,其原因主要在于该菌对β-内酰胺类药物天然耐药及对万古霉素等糖肽类抗生素耐药性不断增强,但该菌耐药性传播机制仍在进一步研究中。本研究拟描述1株林麝源屎肠球菌多重耐药基因岛的特征,显示出该基因岛在不同属细菌中的传播。采用单分子测序技术对这株林麝心源屎肠球菌进行从头测序,同时采用分子生物学工具对该基因岛进行分析。结果显示:这株屎肠球菌染色体上携带多个耐药基因,其中携带ANT(9)、ErmA的Tn554转座酶和携带AAC(6′)-le-APH(2″)-la的一对插入元件IS256共同构成的一个多重耐药基因岛来自金黄色葡萄球菌,该基因岛对大环内酯类、林可酰胺类及氨基糖苷类抗生素具有抗性。结果表明从死亡林麝内脏组织中分离得到1株屎肠球菌,该菌株携带有一个多重耐药基因组岛PRI1,该类型基因岛目前在屎肠球菌中并未有相关报道,同时这株菌来自野生动物,可为野生动物源细菌耐药性传播提供数据支持。

比较基因组分析斯氏假单胞菌遗传多样性及固氮基因岛进化机制

对5株固氮与11株非固氮斯氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)基因组开展综合比较分析,从基因组水平上研究斯氏假单胞菌种内遗传多样性及其固氮基因岛进化机制。核心与元基因组分析发现,16个斯氏假单胞菌拥有的独特基因数占元基因数的46.37%;基于平均核苷酸相似度分析,这16个菌株被划分为11种不同的基因组变异型,表明斯氏假单胞菌基因组异质化程度高。固氮基因岛及进化树分析表明,5株固氮菌属于3种不同基因组变异型,它们的固氮基因岛及其侧翼序列保守性好,而且固氮酶基因进化树与菌株谱系进化树呈现高度一致性。据此推测,斯氏假单胞菌祖先可能通过水平基因转移的方式获得固氮基因岛,从而转变为固氮菌,但是在后期进化过程中,绝大部分固氮菌株丢失了固氮基因岛。

沙门菌多重耐药基因岛研究进展

多药耐药基因组岛是指细菌染色体上一段具有典型特征的基因簇,携带有多种耐药基因,决定细菌的多药耐药性;多药耐药基因组岛具有移动元件的特征,如G+C百分比和密码子使用与宿主菌不同,常含移动基因,可以在同种甚至于不同种菌株间水平转移,加速了临床上多药耐药菌株的产生。目前已发现在沙门菌属和其他菌属的细菌中携带沙门菌多重耐药基因岛。由于沙门菌多重耐药基因岛1上的耐药基因具有可移动性,使其在细菌多重耐药获得与传播机制的研究中具有重要意义。

一个新的TonB依赖的基因岛的分布特征研究

目的 为揭示首次在尿道致病性大肠杆菌CFT0 73菌株中发现的TonB依赖的基因岛在其他菌属中是否存在及分布特点。方法 根据组成该基因岛的全部基因设计引物 ,利用PCR方法进行检测分析 ,并以Southernblot和Dotblot方法予以证实。结果 该基因岛主要存在于多种大肠杆菌和志贺氏菌中 ,在 4 1株被检测的沙门氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、克雷伯氏菌、枸橼酸杆菌等其他菌属的标准菌株中均没有完整的该基因岛结构。在 33株从腹泻病患者粪便标本分离的包括 6种血清型的福氏志贺氏菌株中有 30株携带该基因岛。 17株ETEC临床分离菌株中仅有 1株菌阳性 ;19株EPEC临床分离株中仅有 1株阳性 ;7株EAEC菌中均为阴性。在 183株从腹泻病患者粪便标本分离的不属于已知的五类致泻性大肠杆菌中发现有 12 3株携带该基因岛 ,阳性率为 6 7.2 % ,其中 130株携带HPI毒力岛的大肠杆菌中有 95株携带该基因岛 (阳性率为73% ) ,5 3株非携带HPI大肠杆菌有 2 8株携带该岛 (阳性率为 5 2 .8% )。结论 该基因岛的结构比较保守 ,五个组成基因协同存在 ,主要分布在亲缘关系较近的大肠杆菌和志贺氏菌属 ,在大肠杆菌中与HPI毒力岛无明显的协同存在规律。

沙门氏菌一类基因岛研究进展

当前,鼠伤寒沙门菌噬菌体型104(DT104)多重耐药菌株已在全球范围内扩散,该菌株对氨苄青霉素、氯霉素/氟苯尼考、链霉素、磺胺类与四环素均具有耐药性。其抗性基因位于大小为43-kb具有转移能力的沙门氏菌一类基因岛(SGI1)上,SGI1的耐药性分子突变体已在多种血清型中被鉴定。SGI1携带菌株可能具有更强的毒力,并且呈现出迅速扩散之势。

ccr重组酶基因介导SCCmec基因岛的剪切功能研究

目的构建携带ccrC和ccrAB重组酶基因的载体质粒,并导入耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)中,验证ccrC重组酶具有把Ⅴ型SCCmec基因岛从细菌染色体上特异性剪切下来的功能。方法以携带Ⅴ型SCCmec基因岛的菌株81/0342的染色体DNA为模板,应用PCR法扩增ccrC基因,再以携带Ⅱ型SCCmec基因岛的菌株N315的染色体DNA为模板,应用PCR法扩增ccrAB基因,分别克隆到温度敏感质粒pYT3上构建重组质粒pSR5C和pSR2AB,电穿孔技术交叉导入原野生菌株81/0342和N315中构建6株细菌转化株,在适宜温度培育下充分表达质粒,应用PCR法检测SCCmec基因岛从染色体上脱落,并连续10d传代培养细菌,应用影印实验检查细菌的药物敏感性变化。结果ccrC重组酶基因的PCR扩增产物为1.9kb,小于Ⅱ型SCCmec基因岛上携带的ccrAB重组酶基因。经鉴定证实成功构建了重组质粒pSR5C和pSR2AB,当菌株81/0342中导入重组质粒pSR5C和pSR2AB后,81/0342所携带的Ⅴ型SCCmec基因岛能从染色体上剪切下来,并以环状DNA结构存在于细菌中,而只有当N315中导入重组质粒pSR2AB时,N315所携带的Ⅱ型SCCmec基因岛才能脱落下来,SCCmec基因岛脱落的细菌成为对妥布霉素和头孢唑肟药物敏感的菌株。结论ccrC重组酶与ccrAB一样具有特异性剪切酶的功能,可单独介导Ⅴ型SCCmec基因岛的脱落,从而为社区MRSA所携带的Ⅴ型SCCmec基因岛在金黄色葡萄球菌之间的广泛传播提供了实验依据。

奇异变形杆菌中基因岛介导的多重耐药传播研究进展

奇异变形杆菌是导致医院内感染的重要条件致病菌,广泛分布于自然环境及人和动物的肠道中。基因岛是细菌染色体上约10-200 kb独立的DNA片段,能促进宿主细菌适应复杂多变的环境,与细菌适应性进化密切相关。近年来在奇异变形杆菌基因组中发现了多个与多重耐药密切相关的基因岛,包括沙门菌基因岛1及其相关基因岛、SXT/R391整合性接合元件、PmGRI1等,表明基因岛在奇异变形杆菌多重耐药形成和传播中具有重要作用。本文对奇异变形杆菌中与耐药相关基因岛的结构特征、传播机制、流行情况等进行综述,以期为奇异变形杆菌中多重耐药相关基因岛的深入研究提供参考。

携带HPI毒力岛的大肠杆菌的毒力基因分析

目的检测分离自腹泻病人、家禽粪便和食品标本的携带HPI毒力岛的大肠杆菌携带其他致病性相关基因组岛的情况。方法运用PCR和DNA打点杂交方法。结果在被检测的82株大肠杆菌中,志贺氏菌属的Shi-2岛检出率为62.2%(51/82);大肠杆菌O157:H7的8个O岛中,OI55和OI140的检出率为57.3%(47/82),且二者协同存在;OI28的检出率为35.4%(29/82),OI115的检出率为68.3%(56/82),OI144的检出率为9.8%(8/82),OI43和OI122则均未检出。该82株大肠杆菌中78株携带至少2个毒力岛,如编码RTX的OI28岛、编码III型分泌系统的OI115岛以及编码粘附素的OI144岛,另外还有4株菌携带7个基因岛,20株菌携带6个基因岛。结论一些和细菌致病性有关的基因组岛在肠道大肠杆菌中广泛存在,其中一部分有可能是致病性的,提示基因横向转移在致病性大肠杆菌进化过程中具有重要意义。

在大肠杆菌和沙门氏菌中整合位点为tmRNA的串联基因岛的模式和整合的时序性

tmRNA是部分tRNA和一小段mRNA的结合体,已被证明是作为基因水平转移产物之一的基因岛的整合位点.我们通过序列比对和比较基因组学的方法确定了散布在肠杆菌科的13个属中整合位点为tmRNA的68个基因岛,其中53个基因岛属于大肠杆菌(Escherichia coli)和沙门氏菌(Salmonella enterica).在这53个基因岛中,S.enterica subsp.enterica serovar Agonastr.SL483等8个基因组,E.coliS88和E.coliO55:H7str.CB9615中发现了2个及以上连续的基因岛,即形成了串联基因岛.其中,S.enterica subsp.enterica serovar Typhimurium SL1344中发现在该位点有3个连续的基因岛组成的串联基因岛.通过在大肠杆菌和沙门氏菌已测序的基因组中分析整合位点为tmRNA的可变区,发现大多数的基因组除了在可变区中包括了基因岛区之外,还有一段残余的可变区.确定了串联基因岛进入基因组的时间顺序,即远离tmRNA的基因岛先于靠近tmRNA的基因岛整合进入该基因组中.上述的基因岛中整合酶主要有3种类型,分别是HP1整合酶,PhiCTX整合酶和P4整合酶,以P4整合酶所占的比例最多.在串联基因岛中,远离tmRNA的基因岛中的整合酶是P4整合酶,其次是PhiCTX整合酶,最靠近tmRNA的基因岛所用的整合酶是HP1整合酶,由此可以得出tmRNA是研究串联基因岛的遗传与进化的重要位点的结论.

迷你SCC重组质粒的构建及ccr重组酶对SCCmec基因岛的整合功能研究

目的构建4组迷你SCC重组质粒载体,并导入受体菌N315ex中,验证并比较ccrC和ccrAB重组酶具有识别特异性DNA片段,进而把Ⅴ型或Ⅱ型SCCmec基因岛整合入细菌染色体上的功能。方法以转化株0342(pSR5C)和N315(pSR2AB)中抽提的染色体DNA为模板,PCR扩增DNA片段attⅤ和attⅡ,并连接到pYT3载体上,构建pYTattⅤ和pYTattⅡ;将PCR扩增的重组酶基因ccrC0342和ccrAB315分别交叉克隆到pYTattⅤ和pYTattⅡ上,构建重组质粒,并导入N315ex受体菌,在适宜温度培育下充分表达质粒,应用在不同温度培养下含药培养基上菌落数量变化及PCR方法,检测各转化株中质粒整合频率,验证质粒插入方向。结果成功构建4组迷你SCC重组质粒。转化株N315ex(pSR5attⅤ)、N315ex(pSR5attⅡ)和N315ex(pSR2attⅡ)中迷你SCC质粒以不同频度和特定方向整合入细菌染色体中,整合效率分别为8.600%、0.005%和7.200%。N315ex(pSR2attⅤ)中未见整合发生。结论与ccrAB仅可识别Ⅱ型SCCmec基因岛的attⅡ相比,ccrC重组酶可识别V型SCCmec的attⅤ和Ⅱ型SCCmec的attⅡ两组DNA片段,发挥其重组整合作用。

在铜绿假单胞菌PAO1和PA14中确定基因岛的新方法

基于基因岛的3种显著特点,建立了一种新的确定基因岛的方法,能够较为全面地搜寻特定菌株的基因岛.以此方法在Pse udomonas aeruginosa PA14和Pseudomonas aeruginosa PAO1中共发现了9个基因岛,在PAO1中发现2个,在PA14中发现7个,其中有4个是已经被研究鉴定,5个是新发现的基因岛.9个基因岛中,有6个的插入位点是tRNA基因,而其余的3个基因岛中有1个正向重复序列同tRNA基因相关,1个的正向重复序列是在GMP合酶/谷氨酰胺氨基转移酶双功能酶的3′末端,只有1个的正向重复序列尚不清楚来源.对5个未被鉴定的基因岛进行内部基因的功能分析,预测PA14GI-2是同汞离子摄取相关的基因岛,PA14GI-3是同分泌相关的基因岛,PA14GI-6是毒力岛.而PA14GI-1和PA14GI-5功能尚不清楚.对PAO1GI-1,PA14GI-5和PA14GI-7中的整合酶进行分析,预测了各基因岛的酶切位点和结合位点.

一株同时携带SGI1和SXT/R391耐药基因岛的奇异变形杆菌

目的分析1株人源奇异变形杆菌CA151922的2个耐药相关基因岛SGI1和SXT/R391的基因结构和耐药基因。方法聚合酶链式反应(PCR)检测SGI1和SXT/R391基因岛特异性整合酶基因,采用二代测序方法测定CA151922基因组。分别以SGI1和SXT/R391基因岛的参考序列,从基因组序列中提取基因岛片段并组装。在线预测并注释开放读码框(ORFs)。基因岛的同源序列通过在线工具BLASTn获得,采用cd-hit获得非冗余的同源基因,利用R语言构建同源基因的聚类进化关系树。利用微量肉汤稀释法进行耐药表型检测。结果奇异变形杆菌CA151922同时含有SGI1(SGI1-B)和SXT/R391(ICEPmi Jpn1)2个耐药相关基因岛。SGI1-B和ICEPmi Jpn1与已知序列相似性分别为97%~99%和96%~99%。SGI1-B和ICEPmi Jpn1携带的耐药基因种类有所差异,但两者携带不同的编码β-内酰胺酶的基因。CA151922为多耐药菌株,耐药达18种,与基因岛耐药基因有关的耐药表型为氨苄西林和磺胺类药物,提示菌株耐药表型不完全由该耐药岛内的耐药基因决定。结论首次在奇异变形杆菌中发现,同时携带SGI1和SXT/R391耐药相关基因岛,增加了菌株耐药的复杂性和严重性,提示应加强对多耐药菌株耐药相关基因岛的监测。

市售鲜鸡蛋中沙门氏菌的分离鉴定及毒力岛基因检测

目的:监测市售鲜鸡蛋中沙门氏菌的污染情况,检测分离菌株的致病性及其毒力岛基因携带情况,了解沙门氏菌分离株毒力岛基因的携带与其致病力的相关性。方法:从陕西省不同地市的超市中随机购买鲜鸡蛋,无菌取其蛋壳膜分离沙门氏菌,聚合酶链式反应方法扩增沙门氏菌菌属特异性invA基因鉴定分离株;对分离菌株进行无特定病原体(SPF)雏鸡的致病性试验,依据GenBank发表的基因序列,设计引物聚合酶链式反应检测沙门氏菌毒力岛(SPI)核心蛋白基因。结果:从陕西省55家超市1100枚鲜蛋中分离鉴定出30株沙门氏菌,分离率达2.73%;动物致病性实验表明,30株沙门氏菌中13株有致病力,其中强致病力菌株有7株,占23.3%;分离菌株的毒力岛基因携带率分别为:SPI-1 60%、SPI-2 73.3%、SPI-3 100%、SPI-4 90%、SPI-5 76.7%,毒力岛基因SPI-1+SPI-2的携带与细菌致病性有关。结论:市售鲜鸡蛋中沙门氏菌携带率为2.73%,分离菌株对动物具有一定的致病力,毒力岛基因SPI-1+SPI-2的携带与沙门氏菌的致病性呈正相关。

致病菌基因组岛的研究进展

细菌基因组岛是细菌基因组上的特定区域,和水平基因转移相关,具有一定的结构特点,常携带致病、耐药及与适应性等功能相关的基因。通过基因组岛在细菌间的移动,可以造成相关基因在细菌间的传播,在细菌生存和致病等过程中具有重要作用。目前已经可通过生物信息和分子生物学实验等方法对基因组岛进行预测和验证。通过对致病菌基因组岛的研究,可以阐释细菌致病性和耐药等重要功能的获得,对疾病进行溯源,在传染病预防控制中具有重要意义。

创伤弧菌TF3全基因组包含的CRISPR-Cas系统及MGIVvuTF3基因岛分析

【目的】分析创伤弧菌(Vibrio vulnificus)全基因组框架序列,挖掘感兴趣的遗传位点,探索其是否具有CRISPR系统及其特征。【方法】在病虾体内分离获得了一株创伤弧菌TF3,通过Illumina Miseq测序得到基因组框架序列。经注释分析发现其基因组中存在一个CRISPR-Cas系统,命名为CRISPR-CasTF3,进一步分析发现CRISPR-CasTF3位于一个基因岛上,将该基因岛命名为MGIVvu TF3。对CRISPR-CasTF3及MGIVvu TF3的特征和来源进行了分析。【结果】CRISPR-CasTF3属于与大肠杆菌类似的Ι-E型CRISPR-Cas系统,CRISPR-CasTF3包括8个cas基因,其排列为cas3-cas8e-cse2-cas6-cas7-cas5-cas1-cas2;具有50个重复序列,每二个重复序列间为一个Spacer序列。MGIVvu TF3具有att L和att R序列,含有位点特异性整合、剪切、转移相关的基因。MGIVvu TF3与霍乱弧菌O395基因组中的一个基因岛MGIVch0395具较高相似性,二者最显著的差别在于Spacer序列完全不同,以及各有几个非保守的预测基因。【结论】MGIVvu TF3及CRISPR-CasTF3极有可能通过基因水平转移获得,并且CRISPR-CasTF3系统可以借助MGIVvu TF3实现水平转移。

正畸牙龈炎患者中牙龈卟啉单胞菌致病岛Rag基因的检测及其致病性分析

目的:分析不同rag基因型牙龈卟啉单胞菌(Pg)在正畸牙龈炎患者中的分布状况。方法:41例患者为戴用矫治器后发生牙龈炎者(正畸治疗组),36例为未戴矫治器牙周健康者(对照组),25例为中、重度牙周炎患者(牙周炎组)。利用多重PCR技术检测受试者龈沟液标本中牙龈卟啉单胞菌及致病岛rag基因,分析其与临床指标之间的相互关系。结果:牙龈卟啉单胞菌阳性率(%)在正畸治疗组、对照组和牙周炎组分别为70.7、36.1和92.0(P<0.01)。在Pg阳性患者(正畸治疗组和牙周炎组)rag基因型检出率依次为rag-3、rag-4、rag-1和rag-2。结论:不同rag基因型P.gingivalis在不同病变组织中的分布不同;rag-3型和rag-4型Pg与牙龈炎的发生发展有密切关系。