HIV-I CN54株gagprotease基因嵌合脊髓灰质炎病毒cDNA质粒的构建和表达研究(英文)

目的构建HIV-1CN54株gagprotease基因嵌合脊髓灰质炎病毒cDNA的表达质粒,并鉴定、检测基因及其表达。方法用PCR技术获得人免疫缺陷病毒CN54株的gagprotease基因,并使其两端带上合适的酶切位点,将其定向插入到包含脊髓灰质炎病毒cDNA的表达质粒pSVA14中,替代其部分结构基因,构建HIV基因嵌合缺陷性脊髓灰质炎病毒基因组的表达质粒。经筛选、鉴定后用脂质体转染技术将新构建的质粒转入Hela细胞内,用WesternBlot方法检测目的基因在Hela细胞内的表达。结果PCR技术扩增所得的人免疫缺陷病毒CN54株gagprotease基因经琼脂糖凝胶电泳、DNA测序证实成功获得,未引入突变碱基,筛选、鉴定证明gagprotease基因被正确定向插入到脊髓灰质炎病毒的cDNA序列之中,WesternBlot检测到gagprotease基因正确表达了相关蛋白。结论成功构建了表达人免疫缺陷病毒CN54株gagprotease基因的缺陷性脊髓灰质炎病毒基因组嵌合质粒,为利用脊髓灰质炎病毒作人免疫缺陷病毒基因的表达载体奠定了基础,此研究对开发以脊髓灰质炎病毒为艾滋病的疫苗载体有重要意义。

输注供体骨髓细胞诱导大鼠小肠移植基因嵌合的研究

目的探讨经门静脉途径输注供体骨髓细胞后，大鼠小肠移植中受体基因嵌合率的改变及可能机制。方法建立大鼠异位节段小肠移植模型（供体为雄性BN，受体为雌性Lewis，各15只），并将其随机分为三组，对照组、FK506组、PV组（喂养FK506及经门静脉注射供体骨髓细胞组）。应用原位荧光杂交定位检测以及实时定量聚合酶链反应技术分析供体雄性细胞的SRY基因在移植术后受体大鼠血液、肝脏及脾脏中的嵌合情况。结果PV组受体雌性大鼠血液（3．03±0．16）％、肝脏（0．86±0．05）％、脾脏（4．08±0．12）％中供体SRY基因嵌合率均较FK506组（1．15±0．07）％、（0．21±0．02）％、（1．23±0．05）％、对照组（1．10±0．07）％、（0．22±0．02）％、（1．17±0．06）％明显增高（P〈0．01）。结论经门静脉系统输注供体骨髓细胞可建立稳定的混和嵌合体状态。

结核病Mtb8.4/hIL-12嵌合基因疫苗免疫保护效果研究

目的研究Mtb8.4/hIL-12嵌合基因疫苗的免疫原性及对小鼠结核杆菌感染的免疫保护效果。方法将雌性C57BL/6N小鼠40只,随机分为5组,即Mtb8.4/hIL-12嵌合基因、Mtb8.4基因疫苗组、BCG组、空载体组和PBS组。小鼠脾细胞培养上清液检测细胞因子水平;并按效靶比例分别为100∶1、50∶1、10∶1进行细胞毒性T细胞(CTL)杀伤检测。用结核杆菌H37Rv强毒株静脉攻击小鼠,计数肺和脾组织中的结核杆菌菌落数,对小鼠部分肺和脾组织作病理切片,HE染色观察组织病变程度,Z-N染色查抗酸杆菌,观察该疫苗对小鼠结核杆菌感染的免疫保护效果。结果Mtb8.4/hIL-12嵌合基因疫苗对小鼠结核杆菌感染有一定的免疫保护效果,能够诱导较强的抗原特异性Th1型细胞免疫应答,细胞因子IFN-γ和IL-2分泌增加,IL-4分泌减少,特异性CTL活性增加;使小鼠肺和脾组织中的结核杆菌菌落数较空载体组显著减少,组织病变明显减轻,其效果优于卡介苗(BCG)组和Mtb8.4基因疫苗组。结论hIL-12与Mtb8.4构建成嵌合基因疫苗后,使Mtb8.4基因疫苗的免疫效力得到很大提高。

嵌合基因δKρF在转基因小鼠内的组织特异性表达

本文报告了鸡δ晶体蛋白基因的启动子,被Friend脾病灶形成病毒(SFFV)的长末端重复顺序(LTR)取代后的嵌合基因δKpF在转基因小鼠内的表达特性。采用显微注射方法,将含有δKpF基因的重组质粒pδKpF DNA导入小鼠受精卵的雄原核,再将其植入假孕小鼠的输卵管内,经生长发育,产出小鼠35只。以DNA-DNA分子杂交分析,发现其中1只小鼠的基因组DNA中整合有所导入的δKpE基因。再以免疫酶标记方法检测,发现δKpF基因在转基因小鼠内能够表达,而且具有组织特异性。作者认为,与δ晶体蛋白基因组织特异性表达有关的调节顺序位于+677bp之后。这与Hayashi等(1985)以培养细胞研究的结论不一致。

汉滩病毒G1S0.7嵌合基因重组腺病毒的构建及鉴定

目的在本室前期工作的基础上构建汉滩病毒M基因G1片段与S基因0.7kb片段嵌合基因的重组腺病毒。方法构建含有汉滩病毒G1S0.7嵌合基因的转移载体pShuttle-G1S0.7，然后通过特异性的酶切将嵌合基因与腺病毒DNA相连，电转化E.coli JM109，获得重组腺病毒Adeno-G1S0.7 DNA，转染HFX293细胞得到重组腺病毒。进一步对重组腺病毒的滴度和表达产物进行鉴定。结果构建的含G1S0.7嵌合基因的重组腺病毒，滴度可达10^13～10^15 PFU／L；该重组腺病毒感染Vero-E6细胞后，表达出可被抗汉滩病毒核蛋白及糖蛋白G1的特异性单抗（mAb）所识别的融合蛋白。结论利用腺病毒表达系统，成功地表达同时具有核蛋白及糖蛋白G1生物学活性的融合蛋白，为进一步研究其免疫学特性奠定了基础。

人/鲑降钙素嵌合基因在大肠杆菌中的串联表达

人工合成人/鲑降钙素嵌合基因,用同尾酶法构建多拷贝串联基因表达质粒pLEX-nCT(n=1,2,3,4,5)(单个降钙素基因之间用一段编码柔性连接肽的DNA连接),并在大肠杆菌GI724中表达。Western blotting结果显示,串联多肽具有人源降钙素的抗原性。

Ⅰ型人免疫缺陷病毒gag-gp120嵌合基因核酸疫苗的构建与鉴定

目的 :构建含Ⅰ型人免疫缺陷病毒 (HIV 1) gag gp12 0嵌合基因核酸疫苗的表达质粒。方法 :将gag和 gp12 0连接后的嵌合基因插入到真核表达载体 pVAX1中 ,构建真核表达质粒pVAXGE。用脂质体法将构建的重组质粒转染Hela细胞 72h后 ,取转染的Hela细胞进行RT PCR检测和和Dot ELISA分析。结果 :重组质粒转染细胞的总RNA中 ,可扩增出目的基因的转录产物。Dot ELISA的结果显示 ,目的基因在Hela细胞内得到表达。结论 :成功地构建了表达gag gp12 0嵌合基因的核酸疫苗质粒 ,为HIV

猪瘟病毒C株E^(rns)/E2嵌合基因表达蛋白单克隆抗体的制备及其生物学特性的鉴定

目的:制备抗猪瘟病毒(CSFV)C株Erns/E2嵌合基因表达蛋白的单克隆抗体(mAb),探讨Erns/E2蛋白的分子结构和生物学功能。方法:在大肠杆菌RosettaTM2(DE3)中表达了猪瘟病毒(CSFV)C株Erns、E2蛋白主要抗原域的嵌合基因CSFVErns/E2蛋白;以纯化复性后的CSFVErns/E2为免疫原,按常规方法免疫BALB/c小鼠,应用淋巴细胞杂交瘤技术制备抗CSFVErns/E2 mAb;利用间接ELISA、Western blot、Dotblot方法鉴定mAb生物学特性。结果:获得了1株稳定分泌抗CSFVErns/E2融合蛋白的单克隆杂交瘤细胞系C8株,该株mAb的细胞培养上清效价为1∶6400,小鼠腹水效价1∶2×105。其免疫球蛋白亚类为IgG1。间接ELISA和Western blot结果显示该株mAb不与猪瘟C株细胞毒、pET-32a标签蛋白反应,仅与融合表达的CSFVErns/E2蛋白存在特异性反应。Dot blot结果表明其识别的抗原表位为E2蛋白的RSGL-CPFDTSPV氨基酸序列。结论:获得了一株能特异识别E2蛋白抗原表位的mAb,为进一步研究CSFV的分子结构及功能奠定了物质基础。

Mtb8.4/hIL12嵌合基因疫苗免疫原性

目的:构建克隆结核分枝杆菌Mtb8.4/hIL12嵌合基因疫苗,并在COS7细胞中表达,研究该疫苗的免疫原性。方法:克隆Mtb8.4/hIL12嵌合基因,并导入真核表达载体pCIneo中,构建pCIneoMtb8.4/hIL12重组真核质粒。用限制性内切酶消化、PCR及DNA序列测定等鉴定后,转染COS7细胞,用RTPCR和Westernblot鉴定Mtb8.4/hIL12嵌合基因在转录水平的表达。用Mtb8.4/hIL12嵌合基因疫苗免疫C57BL/6N小鼠,收集脾细胞培养上清检测细胞因子的水平,并用乳酸脱氢酶(LDH)释放法测定细胞毒性T细胞(CTL)的杀伤作用。结果:pCIneoMtb8.4/hIL12重组质粒构建成功。以其转染COS7细胞后,Mtb8.4/hIL12嵌合基因在转录水平获得表达。Mtb8.4/hIL12嵌合基因疫苗能诱导较强的抗原特异性Th1型细胞免疫应答,IFNγ和IL2的分泌增加,IL4的分泌减少,特异性CTL的杀伤活性增强。结论:成功地构建pCIneoMtb8.4/hIL12重组质粒,并在COS7细胞中表达。构建的Mtb8.4/hIL12基因疫苗具有较强的免疫原性,可明显诱导CTL的杀伤活性。

RTS启动子与GUS的嵌合基因在转基因水稻花药中的专一性表达

通过PCR扩增 ,从籼稻品种IR36中克隆了RTS启动子的DNA片段 ;序列分析表明 ,所克隆的DNA片段含 12 5 7个核苷酸 ,与Lee等 (1996 )报告的序列比较 ,核苷酸同源性为 97.1% ;将 - 12 2 8～ + 2 5的RTS启动子区段与GUS编码区组成的嵌合基因插入双元载体的T DNA中 ,经根癌农杆菌介导转化 ,得到转基因水稻植株。GUS活力检测表明 ,此嵌合基因不仅能在花药绒毡层 ,而且还在花药表皮细胞、药室内壁以及花粉中表达 ,而 - 783～ + 2 5的 5’上游区与GUS编码区组成的嵌合基因则未在转基因水稻的花药中检测到其表达。

两种尘螨1类变应原嵌合基因的原核表达及生物活性鉴定

目的原核表达尘螨1类变应原（粉尘螨1类变应原仇叩和户尘螨1类变应原Derpl基因）的嵌合基因R8，并检测其生物活性。方法以含嵌合基因R8的pUCm-T重组质粒为模板，用Derel的特异性引物进行PCR扩增，产物经酶切后与载体pET28a（＋）连接，连接产物转入大肠埃希菌（E.coli）BL21感受态细胞，并用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达后纯化，十二烷基磺酸钠．聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS．PAGE）检测；纯化后的蛋白用ELISA检测其与粉尘螨过敏患者血清（IgE）的结合能力，同时以重组rDerfl和rDerP1蛋白作为对照。为检验嵌合蛋白R8的免疫原性，将75只BALB／c小鼠随机均分为5组，分别为PBS组（阴性对照组）、rDerf1组、rDerP1组、R8组和哮喘组（阳性对照组）。除PBS组外，其余各组分别于第0、7和14天每鼠腹腔注射（0．1μg/μl）粉尘螨注射液100μ1，第21～27天每鼠每天雾化吸入0．5μg／ml粉尘螨注射液悬浊液，30min／d。rDerf1组、rDerP1组和R8组于第25～27天雾化前30min．分别腹腔注射100μg／ml的rDerf1、rDerP1和R8蛋白各200μl进行特异性免疫治疗，PBS组用等量PBS进行腹腔注射和雾化吸人。所有小鼠于第27天雾化吸入后24h气管切开，用1mlPBS进行肺泡灌洗，收集肺泡灌洗液（BALF），检测γ干扰素（IFN-γ）和白细胞介素4（IL-4）的水平。结果SDS-PAGE结果显示，R8表达产物的蛋白相对分子质量（Mr）约为35000。EUSA检测结果显示，嵌合蛋白R8与粉尘螨过敏患者血清IgE的结合力为（37．03±12．46）μg／ml，显著低于rDerf1[（80．44±15．50）μg／ml]和rDerP1[（90．79±10．38）μg／ml]（P〈0．01）。动物实验结果显示，R8组IFN-γ水平[（343．43±38．79）pg／ml]与rDerfl组[（322．98±30．36）pg／m1]和rDerP1组[（314．97±33．89）pg/ml]的相比，差异均无统计学意义（P〉0．05）；与PBS组[（393．93±50．68）pg/ml]和哮喘组[（208．44±46．11）pg／m1]相比，差异均有统计学意义（P〈0．01）。R8组IL4水平显著低于其他各组水平（P〈0．05或0．01）。结论表达了具有低变应原性和高免疫原性的尘螨1类变应原嵌合基因R8。

P_(SAG12)-ipt嵌合基因转化樱桃番茄的研究

利用根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)介导法将嵌合基因PSAG12-ipt导入樱桃番茄,经双重PCR检测和基因组总DNASouthern杂交测验,共获得17株转基因植株。田间生长实验观察结果显示,这17株转基因植株生长发育及形态正常,但其中的14株长势明显好于对照。对14株中的2株进行叶片叶绿素、细胞分裂素检测结果表明,转基因植株基本定型叶下部,不同叶位叶片叶绿素、细胞分裂素含量明显高于对照,基本定型叶上部叶片与对照基本一致,同一叶位叶片比对照延缓衰老15～20d。

汉滩病毒M和S基因不同拼接方式嵌合基因免疫效果的研究

本文在前期工作的基础上,构建了汉滩病毒76-118株M基因G2片段与S基因5'端0.7Kb片段的嵌合基因真核表达载体pcDNA3.1-G2S0.7及pcDNA3.1-S0.7G2;用该质粒免疫BALB/c小鼠。结果表明两种质粒免疫小鼠可同时诱导产生抗汉滩病毒核蛋白(NP)及糖蛋白(GP)特异性的抗体,且前者刺激产生的抗体效价明显高于后者。淋巴细胞增殖实验表明,pcDNA3.1-G2S0.7组免疫小鼠脾细胞时NP及GP的增殖指数均明显高于空载体对照组,而pcDNA3.1-S0.7G2组未检测到其淋巴细胞有明显的增殖。这说明汉滩病毒M基因G2片段及S基因0.7Kb片段的嵌合基因既可刺激机体产生特异的抗汉滩病毒体液免疫应答,也可刺激机体产生特异的细胞免疫应答。不同拼接方式对嵌合基因免疫效果有很大影响,嵌合基因G2S0.7这种拼接方式明显优于S0.7G2。

应用嵌合基因实例拓展遗传学染色体畸变的教学

染色体结构变异,会扰乱机体的固有平衡系统,影响生殖和发育。在本科遗传学教学中,如何进一步诠释导致机体平衡系统紊乱的机理,是教师常面临的教学难题。一些嵌合基因(chimericgene)是染色体结构变异的产物,具有特异的生物功能,可能是致使固有平衡系统紊乱的原因之一,但很少见到在课堂或教科书中讲述与嵌合基因相关的内容。本文结合近年本团队对嵌合基因的研究成果及遗传学教学实践,以一个司法案例创设情境,引入嵌合基因实例,以激发学生的学习兴趣;进而通过对嵌合基因通性的梳理,辅助学生总结知识点,发展思维融汇力,从而拓展染色体畸变的教学,以期使学生对基因的变异及其功能有更深入的理解,提高遗传学教学效果。

肺孢子虫(菌)p55抗原嵌合基因的克隆及表达产物分析

目的构建肺孢子虫(菌)p55蛋白嵌合基因的原核表达载体,分析、鉴定及纯化表达产物。方法自NCBI网站的蛋白数据库中获取p55抗原及4个变异体信息,运用生物信息学方法预测可能的抗原表位,设计包含多个可能抗原表位的多肽,根据遗传中心法则及大肠杆菌密码子偏好性进行密码子优化,将氨基酸序列转化为核苷酸序列,将人工合成的嵌合基因(CAG)片段连接到质粒pGEX-6p-1(含GST标签)上,构建原核表达载体pGEX-6p-1/CAG,酶切、测序鉴定。pGEX-6p-1/CAG转化大肠杆菌,异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达重组融合蛋白CAG-GST。表达产物用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及Western-blotting分析鉴定。结果双酶切及测序结果显示重组质粒pGEX-6p-1/CAG构建成功。SDS-PAGE显示重组融合蛋白相对分子量约为69 000。Western-blotting结果显示,表达的融合蛋白为CAG-GST。结论成功构建表达p55蛋白嵌合基因的原核表达载体pGEX-6p-1/CAG,建立表达重组蛋白的原核表达系统。

木瓜环斑病毒外壳蛋白与核酸酶嵌合基因转化番木瓜胚状体的研究

以农杆菌ＬＢＡ４４０４介导木瓜环斑病毒外壳蛋白（ＰＲＳＶ－ＣＰ）与核酸酶（Ｎｕｃｌｃａｓｅ）嵌合基因，通过振动共培养法转化番木瓜子叶型胚状体，在选择培养基上筛选诱导再生转基因植株。ＮＰＴⅡ分析和ＳＯｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔＤＮＡ分子杂交结果表明，ＰＲＳＶ－Ｃｐ－Ｎｕｃｌｅａｓｃ嵌合基因已整合到番木瓜核基因组中。

HIV-1 gp160多表位嵌合基因的构建及表达蛋白的免疫原性分析

HIV感染引起的AIDS已经成为严重影响人类健康和社会发展的全球性疾病。酶联免疫吸附试验和免疫印迹检验组合则被认为是HIV检测的"金标准"。构建了gp160的抗原多表位融合基因及在原核系统的高表达,为HIV抗体测定提供特异、价廉的抗原。选定HIV-1gp160基因中3个片段包含较多抗原表位的区域,设计带有酶切位点的引物,用PCR的方法从HIV-1HXB2全基因扩增编码这3个片段的基因序列,通过质粒提取、酶切、测序方法鉴定基因片段的正确性,SDS-PAGE和Western blot测定融合蛋白的抗原特异性。构建的HIV-1gp160多表位嵌合基因的原核表达质粒,酶切和测序结果表明基因序列正确,基因全长969bp。在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达的重组蛋白分子量为37kDa,以包涵体的形式存在。应用Western blot测定10例正常人和12例HIV/AIDS病人血浆显示HIV-1gp160多表位融合蛋白具有良好的抗原特异性。成功构建了高表达HIV-1gp160多表位蛋白的原核表达系统,纯化的融合蛋白有较强的抗原特异性。

以寡聚精氨酸为PTD的嵌合基因的表达及其对HER2阳性SGC-7901胃癌细胞的杀伤作用

目的：构建以寡聚精氨酸（R9）为蛋白质转导结构域的嵌合抗体／caspase-3的真核表达载体，并检测瞬时转染该载体对HER2阳性SGC-7901肿瘤细胞及HER2阴性HeLa肿瘤细胞生长的影响。方法：用PCR法获得融合了R9的活性caspase-3基因片段，并将其克隆人含有HER2单链抗体e23sFv基因的真核表达载体，以脂质体法转染SGC-7901细胞及HeLa细胞，用间接免疫荧光、细胞计数等方法，检测其在两种细胞中的表达及其对两种细胞生长的影响。结果：成功构建了以R9为蛋白质转导结构域的嵌合抗体／caspase-3基因真核表达载体pCMV—e23sFv-R9-casp3，瞬时转染该质粒发现SGC-7901细胞和HeLa细胞均以分泌形式表达e23sFv—R9-casp3蛋白，但SGC-7901细胞生长受到明显抑制，细胞形态发生改变，出现核浓缩等凋亡特征；而HeLa细胞生长未受抑制，细胞形态无明显变化。结论：以分泌形式表达的嵌合蛋白，其HER2抗体部分能够介导靶向识别，R9可以辅助效应分子活化、转位至细胞液，活性caspase-3能高效杀伤细胞。

结核分枝杆菌mtb8.4/hIL12嵌合基因的克隆及真核表达质粒的构建

目的 :克隆结核分枝杆菌mtb8.4 /hIL12嵌合基因 ,构建其真核表达质粒 ,并进行鉴定。方法 :采用基因工程技术 ,首先以 pcDNA 3.1(+) -mtb 8.4为模板 ,经聚合酶链反应 (PCR)扩增出mtb 8.4 -linker基因 ,与pCI-neo载体进行连接重组 ,构建成pCI-neo -mtb 8.4 -linker(pML)重组质粒 ,然后以pORF -hIL12质粒为模板 ,经PCR扩增出hIL - 12基因 ,将hIL -12基因与pML质粒进行连接重组 ,构建成mtb 8.4 /hIL12嵌合基因真核表达质粒 ,用限制性内切酶消化、PCR及DNA序列测定等多种分子生物学方法进行鉴定。结果 :mtb 8.4 /hIL12嵌合基因重组真核表达质粒经证实构建成功。结论 :mtb 8.4 /hIL12嵌合基因重组真核表达质粒的成功构建 ,为进一步研究其免疫保护效果及制备结核病mtb 8.4