IKBKE在乙型肝炎病毒相关肝癌组织中的表达及临床意义

目的探究IKBKE在乙型肝炎病毒相关肝癌(HBV-HCC)组织中的表达及其与临床特征和预后的相关性。方法通过组织芯片免疫组织化学染色方法来检测HBV-HCC患者的癌组织和癌旁组织中B细胞编码κ轻链多肽基因抑制激酶E(IKBKE)的蛋白表达;整理并分析患者的一般资料、临床体征及病理报告结果,检测相关的血液指标;使用Pearson相关性分析比较IKBKE在肝细胞肝癌组织中的表达及其与患者的一般临床资料、临床体征、血液指标、病理结果和预后的相关性。结果该研究发现,在HBV相关的肝癌患者中,IKBKE的蛋白表达在癌组织中的表达水平显著高于正常组织,高表达组的生存时间明显低于低表达组。此外,IKBKE表达与肝硬化程度呈负相关,与TFF3、pCEA和Ki67等指标呈正相关。结论IKBKE、TFF3、pCEA和Ki67的联合检测有助于预测HBV相关肝癌的预后。

乙型肝炎病毒前基因组RNA评估恩替卡韦治疗乙型肝炎E抗原阳性慢性乙型肝炎疗效的价值

目的探讨恩替卡韦(ETV)对乙型肝炎E抗原(HBeAg)阳性慢性乙型肝炎(CHB)患者疗效,并观察血清乙型肝炎病毒(HBV)前基因组RNA(pgRNA)水平、评估其疗效价值。方法选取2019年1月至2021年6月东莞广济医院收治的确诊为HBeAg阳性的78例CHB患者为研究对象进行回顾性分析。根据患者ETV治疗12个月后HBeAg是否获得完全应答分为获得组(35例)和未获得组(43例)。两组患者均采用ETV治疗12个月,观察患者治疗过程中血清HBV pgRNA水平及谷丙转氨酶(ALT)各时间点动态变化,并探讨ETV治疗后患者获得应答情况与HBV pgRNA水平及ALT水平的相关性。结果两组患者治疗3、6、12个月的血清HBV pgRNA水平显著低于入组时,且获得组低于未获得组(P<0.05);血清HBV pgRNA水平与获得完全应答呈负相关(P<0.05)。两组患者治疗3、6、12个月的ALT水平显著低于入组时,且获得组低于未获得组(P<0.05);ALT水平与获得完全应答呈负相关(P<0.05)。结论血清HBV pgRNA、ALT水平与HBeAg阳性CHB患者ETV的疗效具有相关性,可用于评估疗效。

慢性重型乙型肝炎患者的乙型肝炎病毒C基因启动子和前C基因变异及与e抗原系统的关系

目的 研究慢性重型乙型肝炎患者血清的HBVC基因启动子 (CP)和前C基因变异情况。方法 通过DNA扩增、基因序列分析检测 75例慢性乙型肝炎 (CHB)和 14例慢性重型乙肝 (CSH)患者血清的HBVCP和前C基因序列 ,通过微粒子发光法定量检测血清中HBeAg的含量及通过荧光定量PCR技术定量检测血清中的HBVDNA。结果 (1)前C终止变异 (nt1896G→A)在CSH组中的发生率显著高于CHB组 (71 4 %和 2 6 7% ) ;CP双变异 (nt 176 2A→T和 176 4G→A)则在CSH组和CHB组的发生率无显著差异 (4 2 9%和 4 8 0 % )。 (2 )CSH组的HBeAg含量显著低于CHB组 ;CSH组的HBeAb阳性率则显著高于CHB组 (71 4 %和 32 0 % )。 (3)CSH组和CHB组的HBVDNA定量则无明显差异。结论 前C终止变异 ,对e系统有明显影响 ,与CSH的发病有关。

血清IL-10对慢性乙型肝炎患者抗病毒治疗后e抗原转阴的预测作用

目的观察慢性乙型肝炎病毒感染引起血清IL-10变化,探讨血清IL-10对慢性乙型肝炎(CHB)患者抗病毒治疗后e抗原(HBeAg)转阴的预测作用。方法纳入2008年5月—2013年9月于江苏省苏北人民医院和南京鼓楼医院就诊的90例CHB患者,包括6例非活动携带者(IC)、22例免疫耐受患者(IT)、44例HBeAg阳性患者(EPH)和18例HBeAg阴性患者(ENH)。同时,纳入11名健康人(HC)作为对照。对比健康人与CHB患者血清IL-10含量以及不同免疫状态的CHB患者IL-10血清含量。并对EPH患者中30例接受抗病毒治疗的患者进行随访,共5年。检测其抗病毒治疗后第0周、第4周、第12周、第24周和第48周血清ALT、HBV DNA和IL-10水平。观察抗病毒治疗后2年、3年和5年血清HBeAg是否转阴,并将其分为HBeAg转阴组和HBeAg仍阳性组,比较两组基线血清HBeAg和IL-10水平。结果CHB患者血清IL-10水平显著高于健康献血者。同时在CHB患者中,IT组、EPH组和ENH组患者血清IL-10含量明显高于IC组患者。抗病毒治疗后,血清ALT、HBV DNA、IL-10水平逐渐下降。通过随访发现,在抗病毒治疗后的2年、3年和5年内,分别有9人、10人、13人实现了HBeAg转阴。进一步分析发现,与HBeAg仍阳性组患者相比,在2年、3年和5年内实现HBeAg转阴的患者基线IL-10水平明显更高[(6.49±2.16)vs(3.33±1.22)pg/mL,P=0.062;(5.88±1.99)vs(2.27±1.36)pg/mL,P=0.026;(6.01±1.91)vs(1.15±0.63)pg/mL,P=0.027]。结论慢性乙型肝炎病毒感染可引起患者血清IL-10含量升高,抗病毒治疗可以降低血清IL-10含量,同时抗病毒治疗前血清IL-10含量较高的患者往往能够获得更好的治疗结局。

乙型肝炎病毒e抗原基因与绿色荧光蛋白基因的融合及其表达

质粒pS65T含有T7启动子驱动的绿色荧光蛋白突变型gfpS65T基因，经修饰后，在其中插入乙型肝炎病毒e抗原（HBeAg）基因，使两基因同框成为融合基因。在大肠杆菌BL21中由于T7启动子的控制，高效表达了具有双功能（抗原性和发光性）的融合蛋白（GFP－HBeAg）。融合蛋白MW为52kDa，N端有6个组氨酸残基，因而用Ni金属螯合层析柱对融合蛋白进行了分离纯化，利用诊断HBV的ELISA试剂盒检测了融合蛋白的抗原性，在荧光显微镜下观察到了融合蛋白的绿色荧光。并探讨了用其组装成新型免疫诊断试剂的可能性。

慢性乙型肝炎患者病毒基因组与乙型肝炎病毒e抗原、肝功能关系分析

目的探讨乙型肝炎病毒基因组(HBV-DNA)、乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)、肝功能的相关关系,为临床治疗提供参考。方法回顾分析401例患者的HBV-DNA、HBeAg、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)水平,对HBVDNA与HBeAg进行相关性分析。根据患者的HBV-DNA、HBeAg水平进行分组,比较各组的ALT、AST水平差异。结果 (1)HBV-DNA与HBeAg的阳性率存在相关性,相关系数r=0.671(P<0.01);(2)HBV-DNA载量达105 copies/mL时,血清ALT、AST较HBV-DNA阴性组及低载量组显著升高,差异有统计学意义(P<0.05);(3)在HBV-DNA载量相当时,HBeAg阳性组与阴性组ALT、AST活性差异无统计学意义(P>0.05)。结论 (1)HBeAg与HBV-DNA具有相关性;(2)HBV-DNA载量较高的患者容易出现肝功能异常;(3)HBeAg的存在情况与肝功能无显著相关性。

乙型肝炎病毒e抗原肝细胞结合蛋白新基因E-36基因表达谱芯片分析

目的:为了研究未知功能的HBeAg结合蛋白E-36的生物学功能,我们应用基因芯片技术对于pcDNA3.1(-)和pcDNA3.1 (-)-E-36分别转染的HepG2细胞的基因表达谱进行分析, 筛选能被E-36反式调节的靶基因. 方法:应用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术从HepG2细胞中扩增E-36蛋白编码基因片段,以常规的分子生物学技术构建表达载体pcDNA3.1(-)-E-36.以脂质体技术转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,提取总mRNA,逆转录为cDNA,与转染空白表达载体pcDNA3.1(-)的HepG2细胞进行DNA芯片分析并比较. 结果:构建的表达载体经过限制性内切酶分析和DNA序列测定鉴定正确.提取转染细胞的总mRNA并进行逆转录成为cDNA,进行DNA芯片技术分析.在1 159个基因表达谱的筛选中,发现有20个基因表达水平显著上调,包括甲状旁腺激素应答的骨肉瘤B1蛋白、SLIT2、核因子κB、白介素受体3、白介素6、血管紧张素Ⅰ转换酶、急性髓细胞性白血病1b、caspase 2、低密度脂蛋白1、T细胞受体重组β链、肿瘤坏死因子受体、肿瘤抑制亚转化因子、细胞周期相关激酶-2、亲代谢性谷氨酸盐受体-7、唾液酸转移酶-8及5个未知蛋白;真核细胞翻译延伸因子2基因的表达水平显著下调. 结论:E-36基因的表达对于肝细胞基因表达谱有显著影响DNA芯片技术是分析反式激活靶基因的有效技术途径.

乙型肝炎病毒E抗原反式激活靶基因的克隆化研究

目的 应用抑制性消减杂交 (SSH )技术及生物信息学技术 (bioinformatics)筛选并克隆乙型肝炎病毒 (HBV)e抗原(HBeAg)反式激活新型靶基因。方法 以HBeAg表达质粒pcDNA3 .1(-) HBeAg转染HepG2细胞 ,以空载体pcDNA3 .1(-)为平行对照 ,提取mRNA并进行抑制性消减杂交 (SSH)分析。对于所获基因片段序列分析表明 ,其中之一为新型基因片段 ,与GenBank中注册的已知功能基因序列没有同源性 ,利刚表达序列标签 (EST)序列的搜索和比对 ,进行电子拼接 ,根据基因起始密码子的KozaK规则和终止密码子下游保守的多聚腺苷酸信号序列 ,确定新型基因序列。从HepG2细胞提取总RNA ,以逆转录多聚酶链反应 (RT -PCR)技术扩增获得该新基因的全长序列 ,并测序证实 ,命名为HBeAgTP ,在GenBank中注册 ,注册号为AY42 3 62 4。结果 HBeAgTP基因的编码序列全长为 3 2 4个核苷酸 (nt) ,编码产物由 10 7个氨基酸残基 (aa)组成。结论 HBeAg反式激活新型靶基因HBeAgTP的筛选与克隆 。

人源抗乙型肝炎病毒表面抗原基因工程IgG全抗体的表达、纯化及初步鉴定

目的对人源抗乙型肝炎病毒表面抗原的基因工程IgG全抗体进行表达、纯化及初步鉴定。方法用含Fc片段抗-HBsAg Fab抗体基因的载体pAC-HBs-Fc,与杆状病毒线性DNA共转染昆虫细胞sf9,产生重组抗-HBsAg的全抗体。以不同浓度的HBsAg包被酶标板孔,用间接ELISA法检测培养上清中抗体的表达及特异性;用蛋白G亲和层析柱进行抗体的纯化,并对纯化的抗体进行SDS-PAGE、Western blot和竞争性ELISA分析。结果上清中表达的重组IgG抗体仅与HBsAg呈阳性反应,特异性良好,纯化后其纯度达97.1%。经SDS-PAGE和Western blot分析可见,IgG抗体轻链和重链的相对分子质量分别约为27000和55000,为人源IgG抗体。CHO表达的HBsAg和血源性HBsAg能竞争性抑制该重组IgG抗体与E.coli表达的HBsAg反应,其抑制率分别为55.9%和81.9%。结论人源抗乙型肝炎病毒表面抗原的基因工程IgG全抗体可在杆状病毒载体表达系统中成功表达。

乙型肝炎病毒e抗原与核心抗原调节靶基因的比较

目的利用基因表达谱芯片技术筛选、比较乙型肝炎病毒e抗原和核心抗原调节靶基因。方法利用分子生物学技术和生物信息学技术相结合,克隆HBeAg和HBcAg的编码基因,常规分子生物学技术构建相应的真核细胞表达载体pcDNA3.1-HBeAg和pcDNA3.1-HBcAg脂质体技术转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,利用基因表达谱芯片技术筛选转染细胞的差异表达cDNA的类型。结果对于2个基因转染细胞系差异表达基因谱的分析,HBeAg和HBcAg共同上调的基因1条;HBeAg和HBcAg共同下调的基因1条;未发现HBeAg上调,而HBcAg下调;或HBeAg下调,而HBcAg上调的基因类型;还有一些靶基因,或只受到HBeAg的调节,或只受到HBcAg的调节。结论应用基因表达谱芯片技术对于HBeAg和HBcAg反式调节的靶基因进行分析,可以发现HBeAg和HBcAg可引起体内多个系统相关的基因表达改变,两者在体内所调节的基因种类方面还有很大差异。

应用抑制性消减杂交技术筛选乙型肝炎病毒e抗原调节基因

目的 筛选与克隆HBeAg激活基因 ,了解其在体内的凋节功能线索。方法 以HBeAg表达质粒pcDNA3 .1(-) HBeAg转染HepG2细胞 ,以空载体pcDNA3 .1(-)为平行对照 ,制备转染后的细胞裂解液 ,提取mRNA并逆转录为cDNA ,经RsaⅠ酶切后 ,将实验组cDNA分成两组 ,分别与两种不同的接头衔接 ,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性聚合酶链反应(PCR) ,将产物与T/A载体连接 ,构建cDNA消减文库 ,并转染人肠杆菌进行文库扩增 ,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析。结果 成功构建人HBeAg激活基因差异表达的cDNA消减文库。文库扩增后得到 40个阳性克隆 ,进行菌落PCR分析 ,均得到 2 0 0～ 80 0bp插入片段。对插入片段测序 ,并通过生物信息学分析获得其全长基因序列 ,结果共获得 12种编码基因 ,包括 11种已知基因和 1种未知基因。结论 筛选到的cDNA全长序列 ,包括一些与细胞生长调节、信号转导、肿瘤免疫发生及物质代谢密切相关的蛋白编码基因 ,推测了HBeAg在体内可能存在的调控机制的线索 ,尚需进一步的实验证明。

乙型肝炎病毒表面抗原preS2+S基因在Pichia Pastoris酵母系统的分泌表达

拟获得adw2亚型乙型肝炎(乙肝)病毒表面抗原preS2+S基因在PichiaPastoris酵母分泌型表达系统(pPIC9K)的高效表达。实验首先将adw2亚型乙肝病毒表面抗原preS2+S基因重组到分泌型酵母表达载体(pPIC9K)形成表达质粒,电转化酵母细胞KM71,G418筛选多拷贝整合克隆,经甲醇诱导表达并用SDS-PAGE电泳及酶免疫法检测表达产物。经100个克隆筛选获得了表达量较高的表达菌株WC4。该菌株甲醇诱导后细胞上清10倍浓缩SDS-PAGE电泳检测显示,细胞上清中有特异蛋白条带,且第6天表达量最高,表达产物单体分子量为31kD左右。用美国雅培公司AUZYMEMONOCLONAL试剂盒估算表达量为2μg/100OD600细胞。上述结果表明,乙肝病毒表面抗原preS2+S基因在本系统中获得了分泌表达。同时检测了酵母细胞裂解液中特异蛋白质的表达,结果发现,自甲醇诱导后第一天即可检测到表达产物,而且除了第6天细胞外表达量高于细胞内外,其余各天的表达水平均表现为细胞内高于细胞外。以上结果提示,利用分泌型酵母表达系统表达乙肝病毒表面抗原在技术上可行,但表达产量偏低,一些蛋白滞留在细胞内未能分泌到培养基中。

乙型肝炎病毒e抗原阴性慢性乙型肝炎与前C基因及C基因变异关联性临床研究

目的临床观察乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)阴性的慢性乙型肝炎(e-CHB)与前C基因及C基因变异的关联性。方法将慢性乙型肝炎193例进行血清HBeAg、乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸(HBV-DNA)水平、前C基因核苷酸1896G→A点突变及C基因核苷酸1762碱基A→T和1764G→A联合突变的检测。结果慢性乙型肝炎193例中,①HBeAg阴性70例(36.27%),HBeAg阳性123名(63.73%)。②HBeAg阴性前C基因变异率76%,HBeAg阳性前C基因变异率31%,二者比较差异有统计学意义(P<0.05);HBeAg阴性C基因变异率51%,HBeAg阳性C基因变异率30%,二者比较差异无统计学意义(P>0.05)。③HBeAg阳性患者中,前C基因或C基因变异群的HBV-DNA水平低于未变异群,差异比较有统计学意义(P<0.05),而HBeAg阴性患者中,前C基因或C基因变异群与非变异群比较,血清HBV-DNA水平差异比较均无统计学意义(P>0.05)。结论在e-CHB中,前C基因变异与HBeAg转阴具有密切关系,而C基因变异与HBeAg转阴关系不明确;前C基因和C基因变异不能增强病毒毒性,与疾病严重程度可能无关。

乙型肝炎病毒基因变异与血清e抗原阴性的关系

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)e抗原(HBeAg)曾经是临床判定HBV复制程度慢性乙型肝炎患者预后的重要指标之一,后来发现HBeAg阴转体内HBV仍会有高水平复制,近年来研究表明HBV基因变异特别是C区及X区基因变异与HBeAg表达及在血清中的分泌关系密切。

乙型肝炎病毒E抗原结合蛋白E-19的猴同源基因的克隆化与序列分析

目的:乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)对HBV的感染和复制都不是必须的,普遍认为他与HBV引起免疫耐受,免疫系统功能障碍有关.应用酵母双杂交技术我们克隆了人肝细胞cDNA文库中与HBeAg相互作用蛋白的基因E-19,应用生物信息学技术克隆猴的E-19同源基因. 方法:应用酵母双杂交系统3,将多聚酶链反应(PCR)法扩增的HBeAg基因连接入酵母表达载体pGBKT7中构建诱饵质粒,转化酵母细胞AH109并在其内表达,然后与转化了人肝cDNA文库质粒pACT2的酵母细胞Y187进行配合,提取阳性菌落并测序,确定人E-19基因序列,利用生物信息学技术克隆猴的E-19同源基因,并进行编码产物的序列分析. 结果:成功克隆出人的HBeAg结合蛋白新基因E-19.应用生物信息学技术,确定克隆了猴E-19同源基因,编码基因全长378 nt,编码产物由125 aa组成. 结论:成功克隆出人的HBeAg的肝细胞结合蛋白E-19基因,并发现、确定了猴E-19的同源基因,为研究E-19 基因的结构与功能、表达与调控、生物学意义以及在病毒性肝炎发病机制中的作用奠定了基础.

乙型肝炎病毒e抗原前C区基因变异的血清型和基因型分布特点研究

目的分析比较不同血清型和基因型的乙型肝炎病毒(HBV)e抗原前C区基因序列,了解其特点及差异。方法在12条不同血清型和30条不同基因型的HBV全序列中,比较e抗原前C区编码基因。同时用Blast程序查找并分析与e抗原前C区变异基因相似的核苷酸序列,试图比较不同序列与慢性病毒性肝炎病情的关系。结果e抗原前C区编码基因相对保守,仅在Adw血清型出现1个6核苷酸的插入突变,在B基因型出现1个核苷酸的突变;核苷酸Nt1896位变异(T-A)可出现在血清型Adr和Adw型,和A、B、C、D、G基因型;而Nt1858位(T-C)变异见于Adw血清型,和A、F、H基因型。结论前-C区基因变异主要有插入突变和点突变两种类型,两者在不同血清型和基因型的HBV基因组中有出现频率不同,而不同变异的临床意义可能有所差别。

重组人乙型肝炎病毒E抗原(HBeAg)的基因扩增与表达

本文从两例临床确诊为乙型肝炎患者的2mg肝穿刺标本中利用基因扩增方法,设计扩增出缺失羧基端34个氨基酸的乙型肝炎病毒C抗原(HBcAg)基因的0.45kb基因片段,将此片段克隆入表达载体,导入大肠杆菌中表达,结果获得每毫升培养液含有100万酶联反应单位的HBgAg,也存在1万酶联反应单位的HBcAg。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳显示,其表达产物占菌体总蛋白的30～37％,分子量为155kD。HBeAg基因结构及表达形式有待进一步研究和探讨。

哺乳动物细胞分泌乙型肝炎病毒表面抗原基因工程疫苗的研制与试用

乙型肝炎病毒(HBV)感染已成为人类健康的严重威胁。在我国HBV传播广,带毒率高(8.83％,一般认为10％左右),急性、慢性肝炎患者多,晚期并发肝硬变和肝癌(约占肝癌的80％)病死率高。对乙肝病毒感染尚无特效药物,唯独用疫苗接种可以预防感染。目前使用血源疫苗由于产量不足,难供计划免疫之需,并有污染其它病原体的潜在危险,急需研制基因工程第二代疫苗。在疫苗供应充足的条件下。

CYP2R1基因多态性与恩替卡韦抗病毒治疗乙型肝炎病毒e抗原血清学转换的相关性

目的 探讨维生素D代谢酶基因CYP2R1多态性与慢性乙型病毒性肝炎(CHB)患者恩替卡韦治疗后乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)血清学转换的相关性.方法 选择CHB患者65例,使用恩替卡韦治疗48 w,随访至72 w;根据治疗应答效果分为完全应答(CR)组和非完全应答(NCR)组,对两组患者CYP2R1 rs2060793和rs12794714进行基因分型.观察其疗效和血清HBeAg转换的情况.结果 治疗48 w后,30例为CR组,35例为NCR组.CYP2R1 rs12794714 TT基因型(OR=2.019,95%CI:0.982~4.319,P=0.035)可以预测恩替卡韦治疗完成后持续的HBeAg血清学转换.在恩替卡韦治疗48 w后,CYP2R1 rs12794714 TT基因型患者的HBV DNA含量明显低于非TT基因型患者含量(P<0.05).结论 携带T等位基因的CHB患者在恩替卡韦治疗后更容易获得HBeAg血清转换效果.

乙型肝炎病毒感染孕妇血清标志物及病毒载量与胎儿宫内感染相关性研究

目的:探讨乙型肝炎病毒(HBV)感染孕妇血清标志物及病毒载量与胎儿宫内感染相关性。方法:选取本院从2021年9月至2023年9月收治的80例HBV感染孕妇为研究对象,将其按照胎儿宫内感染发生与否分作感染组(n=35)及未感染组(n=45)。对比两组孕妇各项基线资料(人口学特征、孕期疾病史、分娩情况),血清标志物[乙肝表面抗原(HBsAg)、乙肝e抗原(HBeAg)、乙肝核心抗体(HBcAb)及乙肝e抗体(HBeAb)]与HBV载量水平。以多因素Logistic回归分析HBV感染孕妇胎儿宫内感染的影响因素。结果:感染组居住地为乡村、孕期阴道流血史、羊水浑浊人数占比均高于未感染组(均P<0.05)。感染组HBsAg+HBeAg+HBcAb阳性以及HBV载量水平>107copy/mL人数占比均高于未感染组(均P<0.05)。经多因素Logistic回归分析证实,HBV感染孕妇胎儿宫内感染的危险因素包括居住地为乡村、孕期阴道流血史、羊水浑浊、HBsAg+HBeAg+HBcAb阳性、HBV载量水平>107copy/mL(均OR>1,P<0.05)。结论:HBV感染孕妇胎儿宫内感染的发生与多种因素有关,包括居住地、孕期阴道流血史、羊水状态以及血清标志物、HBV载量水平等,HBsAg+HBeAg+HBcAb阳性及HBV载量水平>107copy/mL会增加HBV感染孕妇胎儿宫内感染风险,应予以重视。