A组牛轮状病毒基因工程亚单位疫苗的初步研究

目的构建轮状病毒外膜蛋白VP4、VP7基因与大肠杆菌LTB蛋白基因的重组表达载体,研究重组表达蛋白的免疫原性,为研制犊牛腹泻基因工程亚单位疫苗奠定基础。方法克隆A组牛轮状病毒临床分离株CHLY的VP4、VP7基因和大肠杆菌LTB基因,插入pET32a中构建了4个原核表达载体pET32a/VP7、pET32a/VP4、pET32a/VP7-LTB、pET32a/VP4-LTB,转化到BL21(DE3)中进行表达纯化,纯化蛋白与弗氏佐剂混合免疫10 w龄雌鼠,在实验期间对雌鼠进行交配,对其所产乳鼠用150μL10-6.5/0.1 mL TCID50的轮状病毒进行攻毒以研究重组蛋白免疫原性和攻毒保护性。结果重组蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中以包涵体的形式存在,Bandscan扫描分析结果显示,它们分别占菌体总蛋白的35%、20%、30%、18%,利用Ni-NTA Agarose在变性条件下成功纯化得到高纯度重组蛋白。10 w龄雌鼠免疫试验表明rVP4-LTB组激发了最强的免疫反应,rVP4组次之,rVP7-LTB组略高于rVP7,各个免疫组间的差异性不显著(P>0.05),各实验组IgG抗体水平显著高于空质粒对照组(P<0.01)。雌鼠所产乳鼠的攻毒实验表明,免疫组雌鼠所产乳鼠腹泻率为13.35%～23.8%,腹泻持续时间为48h～72h,较空质粒对照组明显降低,腹泻症状较轻且症状持续时间明显缩短。四个重组蛋白组攻毒保护率为76.2%～86.7%,rVP7-LTBr、VP4-LTB两组略高于rVP7r、VP4组,但相互间差异不显著(P>0.05)。结论重组蛋白具有较好的免疫原性,被免疫雌鼠体内产生的中和性抗体可以经被动免疫过程传递至子代,并为仔鼠提供保护。本研究为犊牛轮状病毒基因工程疫苗的研究奠定了一定的基础。

棘球蚴基因工程亚单位疫苗免疫绵羊的效果研究

采用羊棘球蚴基因工程亚单位疫苗对2 315只3~20月龄藏系绵羊进行3次免疫试验,并用间接ELISA对免疫后的抗体进行动态监测。检测结果显示,首免前、首免1周后、二免1周后、二免1年后、三免1周后、三免后6个月的血清抗体阳性率依次为0%、98.75%、94.94%、40.74%、98.72%、50%。同时,对同龄、同群、同草场放牧的羊三免1年后进行剖检,免疫组59只、对照组60只。结果显示,对照组感染率、感染强度为86.67%和3.43,免疫组感染率、感染强度为45.76%和0.86,免疫保护率(减囊率)为69.38%。

牛新孢子虫NcSAG1基因工程亚单位疫苗的免疫试验

为了解新孢子虫NcSAG1表面蛋白基因工程亚单位疫苗对实验动物的免疫效果,本试验提取延边黄牛新孢子虫野毒株基因组DNA,用PCR技术扩增新孢子虫NcSAG1表面蛋白基因,并在大肠杆菌中进行原核表达,将Western-blot鉴定具有免疫活性的重组蛋白与弗氏佐剂混合制备NcSAG1基因工程亚单位疫苗,免疫BALB/c小鼠,应用间接ELISA方法测定体液免疫水平,应用流式细胞技术测定细胞免疫水平,以此评价疫苗对实验动物的免疫应答反应。结果显示,制备的NcSAG1基因工程亚单位疫苗免疫BALB/c小鼠后,在三免后第3天时,检测抗体的OD450nm值达0.688;CD4+/CD8+值达3.650,均显著高于重组蛋白免疫组和PBS对照组,说明制备的基因工程亚单位疫苗能够提高实验动物的体液免疫和细胞免疫水平。本试验为牛新孢子虫NcSAG1表面蛋白基因工程亚单位疫苗的深入研究奠定了基础。

产气荚膜梭菌α蛋白的高效可溶性表达与基因工程亚单位疫苗的制备

通过优化α蛋白的密码子、去除蛋白信号肽、选择亲水性与抗原性较好的序列、优化表达条件等方法,在大肠杆菌表达系统中获得了高效表达的产气荚膜梭菌可溶性重组α蛋白,用该蛋白免疫小鼠,再用间接ELISA方法测定血清抗体水平。结果表明:针对A型、B型、C型和D型产气荚膜梭菌的保护率分别为100%、90%、85%和90%,小鼠三免后7~14 d抗体效价达到峰值。该研究表达的α蛋白具有较好的免疫原性,可进一步用于研制预防产气荚膜梭菌的基因工程亚单位疫苗。

基因工程亚单位疫苗的研究现状及发展动态

随着生物技术在生物制品领域的应用不断深化和发展,近年成功研制了许多基因工程亚单位疫苗,代表了新疫苗的一个发展新途径。为克服一些常规疫苗的缺陷带来希望,展示了其广阔的应用前景。

鹅细小病毒vp2基因工程亚单位疫苗的免疫试验

为研究鹅细小病毒(GPV)VP2蛋白基因工程亚单位疫苗对实验动物的免疫效果,本试验对GPV延边分离株的vp2基因进行原核表达,将Western-blot试验鉴定为阳性的表达蛋白进行乳化,免疫BALB/c小鼠,应用ELISA方法监测试验动物的体液免疫水平,以此评价该疫苗的免疫效果。结果表明,在三免后2d,重组蛋白佐剂组检测到的血清OD450nm值达0.687,而生理盐水阴性对照组为0.038,两者差异极显著(P<0.01),提示本研究制备的基因工程亚单位疫苗在试验动物体内产生了VP2抗体水平。

不同剂量包虫病基因工程亚单位疫苗EG95免疫牦牛后的抗体水平测定

为比较和评价不同剂量包虫病基因工程亚单位疫苗EG95免疫牦牛后的抗体差异,随机选择1岁左右的牦牛50头,平均分成A、B、C、D、E 5组,分别按照1、2、3、4、5头份剂量(每头份含EG9550μg)进行一免和二免(间隔28 d);免疫前及二免后15 d采血,应用间接ELISA法检测血清中的特异性抗体。结果显示:二免后A、B、C组的抗体阳性率分别为30%、40%、50%,与E组的90%存在显著性差异(P<0.05),D组阳性率为80%,与E组无显著性差异(P>0.05);A组和B组抗体合格率均为0,C、D、E组的抗体合格率分别为10%、40%、70%,E组抗体合格率明显高于其他组(P<0.05)。试验结果表明,采用EG95基因工程亚单位疫苗按5头份剂量免疫,间隔28 d后二免,对牦牛的免疫效果较为理想。

羊棘球蚴(包虫)病基因工程亚单位疫苗的效果监测

为了解羊棘球蚴（包虫）病基因工程亚单位疫苗对包虫病防控的效果，我们在新疆某地区进行了持续的疫苗使用情况监测。试验结果显示：疫苗免疫后ELISA抗体检测呈阳性，2011年该地区羊棘球蚴患病率高迭57％，2012～2014年患病率分别为26．0％、8．53％、4．63％；2011～2014年犬粪中棘球蚴虫卵的检出率从14．1％下降至7．4％。说明该疫苗对羊包虫病的传播起到了明显的抑制作用。

羊棘球蚴(包虫)病基因工程亚单位疫苗的工业化生产及应用

本文对羊棘球蚴(包虫)病基因工程亚单位疫苗的工业化生产工艺及应用效果进行了研究,为有效防控包虫病在人畜间传播奠定了基础。

鸡传染性法氏囊病灭活苗与基因工程亚单位疫苗免疫效果比较

应用SPF鸡分别比较研究了鸡传染性法氏囊病组织灭活苗和基因工程亚单位疫苗接种后的免疫效果,并用中等毒力毒株D78株攻毒后产生的免疫保护力。结果表明用于试验的灭活苗能够80%保护已经免疫的SPF鸡免于D78株人工感染造成的死亡,而基因工程亚单位相对效果较差,仅能保护20%。这说明在不受母源抗体干扰的情况下,灭活苗的免疫效果要优于基因工程亚单位疫苗。

羊棘球蚴病基因工程亚单位疫苗免疫效果检测

使用羊棘球蚴(包虫)病基因工程亚单位疫苗对绵羔羊进行一免、二免,中间间隔1个月时间。一免后60天抗体阳性率维持在75%,有保护力的抗体占15%;二免后抗体水平较高,持续时间较长,有效保护力在6个月以上,并且有保护力的抗体占45%以上。根据此实验结果我们制定了合理的免疫程序用于生产中。

猪瘟E2基因工程亚单位疫苗使用效果分析

猪瘟俗称"烂肠瘟",又称"猪霍乱",是由黄病毒科猪瘟病毒属的猪瘟病毒引起,一年四季均可导致不同年龄、性别、品种的猪和野猪感染发病,具有高度传染性和致死性,在养猪生产中猪瘟的防控至关重要。猪瘟E2基因工程亚单位疫苗可以有效改善目前猪瘟的防控现状。从猪瘟E2基因工程亚单位疫苗免疫前后检测结果得出.

甲醛灭活猪圆环病毒2型基因工程亚单位疫苗抗原液的最佳条件研究

为探究甲醛对猪圆环病毒2型基因工程亚单位疫苗抗原液最佳的灭活条件,本试验采用10%的甲醛溶液与猪圆环病毒2型基因工程亚单位疫苗抗原液混匀,使甲醛终浓度分别达到0.05%、0.07%、0.10%、0.15%、0.20%,在4~8℃下经过不同时间的灭活,通过对灭活液不同时间点的无菌检验及灭活检验,综合判定灭活效果。结果显示:猪圆环病毒2型基因工程亚单位疫苗抗原液在甲醛终浓度为0.07%时灭活72h,或甲醛终浓度为0.10%和0.15%时灭活60h,或甲醛终浓度为0.20%时灭活48h,均取得可靠的灭活效果。考虑到甲醛的毒副作用,笔者认为4~8℃下用0.07%甲醛终浓度灭活72h是比较理想的灭活条件。

羊棘球蚴(包虫)基因工程亚单位疫苗与口蹄疫灭活疫苗及小反刍兽疫活疫苗联合使用的免疫效果分析

为分析羊棘球蚴(包虫)基因工程亚单位疫苗(GESV)与羊口蹄疫灭活疫苗(IFMDV)及小反刍兽疫活疫苗(LPPRV)联合使用的免疫效果。本试验采用羊棘球蚴基因工程亚单位疫苗与口蹄疫O型、A型二价灭活疫苗及小反刍兽疫活疫苗联合免疫绵羊,观察绵羊不良反应。采用间接ELISA法和液相阻断ELISA法分别测定绵羊血清中抗羊棘球蚴主要保护性抗原Eg95蛋白的抗体和口蹄疫抗体及小反刍兽疫抗体水平。结果显示GESV(皮下)和IFMDV(肌肉)及LPPRV(皮下)联合免疫绵羊后,仅个别羊出现一过性体温升高的免疫反应现象,未见明显的不良反应;同时,绵羊血清中抗羊棘球蚴主要保护性抗原Eg95蛋白的抗体水平明显高于单独免疫GESV组(P<0.05),且不影响口蹄疫抗体及小反刍兽疫抗体水平(P>0.05)。表示GESV与IFMDV及LPPRV联合使用具有良好的安全性,且可提高GESV的免疫效果。

2种佐剂在猪圆环病毒2型基因工程亚单位疫苗中的效果比较

为给猪圆环病毒2型基因工程亚单位疫苗选择一种理想的佐剂,以增强机体对抗原的适应性免疫应答,协同提高动物免疫力。实验用水包油Merckinade SDA 25佐剂和双向Montanide ISA 206佐剂,分别按各自说明制备猪圆环病毒2型基因工程亚单位疫苗,再对两种佐剂的疫苗进行稳定性、黏度、安全及效力检验,比较评价出猪圆环病毒2型基因工程亚单位疫苗的理想佐剂。结果表明,两种佐剂疫苗的稳定性、黏度、安全均合格,无明显差异;但Montanide ISA 206佐剂疫苗较Merckinade SDA 25佐剂疫苗诱导抗体效价更高。据此,笔者认为,Montanide ISA 206佐剂是猪圆环病毒2型基因工程亚单位疫苗比较理想的佐剂。

基因工程疫苗在畜禽疫病防制中的应用

随着现代生物科技的发展,基因工程疫苗在畜禽疫病防制领域发挥着重要的意义。与传统疫苗相比,基因工程疫苗具有更高的安全性、稳定性和免疫效果好的特性,被广泛应用于畜禽疫病防制中。本文主要论述基因工程亚单位疫苗、重组活载体疫苗、基因缺失疫苗和核酸(DNA)疫苗在疫病防制中的具体应用,以期为我国畜牧业的健康发展提供有益的参考和借鉴。

牛包虫病基因工程亚单位疫苗EG95免疫牦牛效果及安全性评价试验

为研究牛包虫病基因工程亚单位疫苗EG95对牦牛的免疫效果、安全性,并调查该疫苗在不同性别、不同年龄、不同海拔地区牦牛间存在的免疫差异性。对4月龄及以上牦牛以免疫剂量每次1头份,每头份含EG95 250μg进行首免、加免(28d后)、安全评价(免疫剂量每次2头份含EG95 500μg),在试验前、首免后28d及加免后28d分别对免疫效果组和对照组牦牛采血,应用间接ELISA法检测血清中特异性抗体。结果显示,首免后28d免疫抗体群体阳性率为71.33%,加免后28d免疫抗体群体阳性率为83.00%,相比首免免疫抗体群体阳性率提高11.67%,与对照组、免疫前比较差异显著(P<0.05)。安全试验组牦牛免疫后第1天有6头出现精神沉郁、采食量下降、体温升高、注射部局部肿胀等不同程度免疫应激反应,4d后均恢复正常。石渠县、康定市不同海拔地区试验牦牛在免疫抗体产生时间、群体阳性率等方面,无明显差异(P>0.05)。结果表明,该疫苗适用于不同海拔地区牦牛使用,安全并可产生较高的抗体水平,对4月龄及以上牦牛免疫程序基本为2次免疫,分别颈部皮下注射1头份,间隔期28d。

产气荚膜梭菌β2蛋白的高效可溶性表达与基因工程亚单位疫苗的制备

β2毒素是一种新近报道的产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）毒素,A、B、C、D、E等5个型的梭菌均可产生,该毒素也是制备基因工程亚单位疫苗的主要研究对象。本研究通过优化β2蛋白的密码子、去除蛋白信号肽,选择亲水性与抗原性较好的序列,同时优化表达条件等方法的探索,在大肠杆菌表达系统中获得了高效表达的可溶性重组β2蛋白,用该蛋白免疫小鼠可使动物产生较高的血清抗体水平,针对A型、B型、C型和D型产气荚膜梭菌的保护率分别为90%、100%、80%和90%,小鼠三免后第7~14天抗体效价达到峰值。本研究表达的β2蛋白具有较好的免疫原性,可进一步用于研制预防产气荚膜梭菌的基因工程亚单位疫苗。

羊棘球蚴(包虫)病基因工程亚单位疫苗的免疫监测

为了研究羊棘球蚴(包虫)病基因工程亚单位疫苗防控包虫病的效果,笔者在新疆巴州部分地区进行了免疫试验。采集首免前、二免前及首免后100 d的羊血分离血清,采用羊棘球蚴EG95包被的ELISA抗体检测试剂盒进行检测。结果表明,试验组首免前羊棘球蚴抗体阳性率2.34%;二免前阳性率74.76%;首免后100 d阳性率88.26%。对照组首免前羊棘球蚴抗体阳性率为0;二免前阳性率3.85%;首免后100 d阳性率4.03%。疫苗使用前,笔者在巴州地区4个县的羊屠宰场随机抽取羊只进行解剖,对不同寄生部位包虫病感染情况进行调查。结果表明,从该地区2579头羊中共检出患病羊426头,羊棘球蚴病的平均患病率高达16.52%。疫苗使用后,对巴州地区4个县的羊屠宰场随机抽取羊只进行解剖。统计结果表明,从该地区249头羊中共检出患病羊0头,羊棘球蚴病的平均患病率为0%。

接种传染性法氏囊病基因工程重组亚单位油乳剂疫苗的产蛋鸡血清抗体与蛋黄抗体的相关性分析

用笔者研制的传染性法氏囊病(IBD)基因工程重组亚单位油乳剂疫苗免疫产蛋鸡,接种后第22d及以后每周进行一次无菌采血,分离血清,用琼脂免疫扩散试验(AGID)检测IBD血清抗体水平;每周用同样的方法检测蛋黄中IBD抗体水平。对血清抗体水平和蛋黄中抗体水平进行相关性统计分析,得出两者之间的相关系数,并进行显著性检验。统计分析结果表明,相关系数r=0.7782,表明血清抗体水平和蛋黄中抗体水平相关关系属于强正直线相关;t值为14.02,t>t(∞)=2.576,差异极显著(P<0.01),即血清抗体水平和蛋黄中抗体水平之间的相关系数极显著;F值为190.55,F>F0.01(1,128)=6.84,差异极显著(P<0.01),即血清抗体水平和蛋黄中抗体水平之间的相关关系极显著。