多功能农药降解基因工程菌株m-CDS-1环境释放安全评价

【目的】为了评价多功能农药降解基因工程菌株m-CDS-1的环境释放中间试验水平的安全性。【方法】通过农药检测、平板计数、Most probable number-PCR(MPN-PCR)和Denaturing Gradient Gel Electrophoresis(DGGE)等方法在江苏大丰进行了工程菌株m-CDS-1田间降解农药效果、定殖动态和对土壤微生物群落结构影响的研究。【结果】投加1.01×107CFU/g干土的工程菌株m-CDS-1在30d时均能完全降解10.71mg/kg的甲基对硫磷和1.29mg/kg的呋喃丹。平板计数表明工程菌株m-CDS-1在土壤中快速下降;MPN-PCR检测结果显示,在4d,15d和30d时,0～10cm混合土壤中该工程菌株的数目分别为2.15±0.98×106CFU/g干土,3.70±4.66×104CFU/g干土和检测不出。工程菌株m-CDS-1的投加不会对土壤可培养三大微生物菌群数量产生显著影响;基于细菌16S rDNA V3区的DGGE分析结果表明,施加农药对细菌菌落结构有显著影响,4d,11d,30d时农药施用区与空白对照区的图谱相似性分别为17.16%,49.81%和75.01%,但到60d时的相似性为98.62%。工程菌株m-CDS-1释放在前期对细菌群落结构有一定影响,4d,11d和30d工程菌株释放区相对于空白的相似性分别为49.57%,38.30%和83.30%。在60d时,空白、施药和施菌小区的图谱相似性都在90%以上。【结论】工程菌株m-CDS-1不仅可同时高效降解甲基对硫磷和呋喃丹,仍保持了实验室内的原有特性,而且不会成为优势菌群长期在土壤环境中存在,也不会对土壤微生物群落结构造成长期影响。

表达大肠杆菌K88ac-ST_1-LT_B融合蛋白基因工程菌株的构建

利用PCR技术 ,从大肠杆菌C8390 2质粒中扩增出K88ac基因、ST1 突变基因和LTB 基因 ,通过分离、纯化、内切酶酶切、连接和转化 ,构建了含K88ac ST1 LTB 融合基因表达载体的重组菌株BL2 1(DE3) (pXKST3LT5 )。经酶切鉴定和DNA序列分析证实 ,构建的重组质粒pXKST3LT5中含有K88ac ST1 LTB 融合基因 ,且基因序列和阅读框架均正确。经ELISA检测 ,重组菌株表达的K88ac ST1 LTB 融合蛋白能够被ST1 单抗、LTB 和K88ac抗体识别。经乳鼠灌胃试验证实 ,表达的融合蛋白已丧失天然ST1 肠毒素的活性。免疫实验结果表明 ,K88ac ST1 LTB 融合蛋白能够诱发小白鼠产生抗体 ,该抗体具有中和天然ST1 肠毒素的毒性作用 ,表明构建的重组菌株可以作为预防仔猪黄。

基因工程菌株BLG8900的遗传稳定性

目的研究基因工程菌株BLG8900的遗传稳定性。方法在有选择压力(加氨苄西林)的条件下,测定pYC2质粒在大肠杆菌BLG8900株[含有质粒pYC2的BL21(DE3)]中的遗传稳定性。结果工程菌连续传10、25、50和100代后质粒具有良好的稳定性,而且经BamHⅠ/EcoRⅠ双酶切,酶切图谱相同。第100代菌株重组质粒的GnRH/TRS序列与原代菌株相同。原代与第10、25、50和100代菌株经IPTG诱导表达,GST-GnRH/TRS融合蛋白表达水平、菌体蛋白的SDS-PAGE图谱鉴定无明显差异。Western blot表明各代菌株表达产物均具有GnRH抗原特异性。结论质粒pYC2在大肠杆菌BL21(DE3)宿主菌中有较好的遗传稳定性。

表达ST1-LTB-α-β融合蛋白基因工程菌株的构建及其免疫原性分析

采用分子生物学技术构建了含有ST1-LTB-α-β融合基因的重组菌株BL21(DE3)(pETST3LTBαβ),SDS-PAGE和Western blotting分析表明ST1-LTB-α-β融合基因在大肠杆菌中得到了高效表达,融合蛋白分子量约为110kD;20L发酵罐培养得到的最佳诱导条件为:重组菌株以1%接种量、5L/min通气量培养3h后加终浓度为0.03mol/L的乳糖诱导,通气量升至12.5L/min继续培养6h,表达量占菌体总蛋白的38.53%;表达的ST1-LTB-α-β融合蛋白无毒性但具有免疫原性,可以抵抗大肠杆菌和产气荚膜梭菌的感染;构建的重组菌株BL21(DE3)(pETST3LTBαβ)有望作为预防仔猪腹泻基因工程疫苗的候选生产菌株。

微生物源谷氨酰胺转氨酶基因工程菌株的研究进展

微生物源谷氨酰胺转氨酶(mTCase)是一种催化酰基转移反应的酶,它可以催化蛋白质分子内、分子间的交联,进行蛋白质翻译后修饰,从而改变蛋白质的功能特性,在食品、生物医学、纺织等领域有着广泛的应用前景.本文综述了构建产微生物源谷氨酰胺转氨酶的基因工程菌株的相关技术、研究进展,并对未来研究方向提出建议。

基因工程菌株BL21(DE3)(pECB-ST1)菌种的限定代次及保存条件试验

本文对基因工程菌株BL2 1(DE3) (pECB -ST1)菌种的限定代次及保存条件进行了详细研究。实验结果证实 ,基因工程菌株BL2 1(DE3) (pECB -ST1)基础种子体外传至 10代 ,其效力、培养特性均不发生变化 ,表明基因工程菌株BL2 1(DE3) (pECB -ST1)是一株良好的疫苗生产菌株。基因工程菌株BL2 1(DE3) (pECB -ST1)甘油菌种和冻干菌种分别在 2 0℃保存 2年和 3年 ,菌种的数量未明显减少 。

表达抗α毒素单链抗体基因工程菌株的构建

将 2种抗A型产气荚膜梭菌α毒素单链抗体 (ScFv)基因ScFv 2E3和ScFv 1A8分别克隆至表达质粒pUC119,pET 2 0b ,pET 2 8a和pHOG2 1中 ,构建了重组质粒 ,分别转化至相应的受体菌JM10 5 ,BL2 1(DE3)和XL1 BLUE中 ,得到表达ScFv的重组菌株。ELISA和SDS PAGE分析检测表明 :经IPTG诱导后所表达的ScFv目的蛋白主要形成了包含体的形式 ,但也有少量ScFv存在于重组菌株的培养上清和胞周质中。经薄层扫描分析 :重组菌株XL1 BLUE (pHOG 2E3)的蛋白表达产物分别占菌体可溶性蛋白的 4% ,重组菌株XL1 BLUE (pHOG 2E3)的蛋白表达产物占菌体总蛋白的相对含量为 2 2 % ,其相对分子量约为 31ku。表达的ScFv蛋白不但具有中和卵磷脂酶的活性 。

基因工程菌株EscherichiacoliC600（pRLK14）的流加培养

在１Ｌ搅拌发酵罐中对含有重组质粒ｐＲＬＫ１４的大肠杆菌进行了培养。结果表明，采用二段培养法，于３４℃增殖细菌，在对数增殖后期升温到４２℃进行诱导，可以高效表达基因产品半乳糖激酶。诱导期，醋酸浓度增长较快，模拟实验表明，控制醋酸浓度可进一步提高半乳糖缴酶产率。

基因工程菌株的培养

基因工程菌株培养是传统发酵工艺的延伸和发展。随着人们的兴趣转向高水平地获取异源基因的表达产物以及开发其工业化生产。

导入额外拷贝dctA基因的根瘤菌工程菌株的构建

为进一步提高大豆根瘤菌的固氮能力,以费氏中华根瘤菌(Sinorhizobium fredii)15067基因组的DNA作为模板,采用PCR扩增技术,克隆四碳二羧酸转移酶结构基因dctA的全长序列;将其连入lac启动子下游,构建带有LuxAB基因标记的pTR-Plac-dctA重组表达载体。利用三亲本杂交技术将表达载体转入费氏中华根瘤菌中,构建大豆根瘤菌工程菌株。研究表明,转基因工程菌株侵染大豆幼苗后与出发菌相比,固氮酶活性有了显著提高,为提高大豆产量的研究提供一定参考。

武夷菌素高产基因工程菌株Streptomyces albulus OoWysR活性成分的分离鉴定

【背景】武夷菌素高产基因工程菌株Streptomyce albulus OoWysR具有明显的抑菌效果。【目的】明确S.albulus OoWysR的活性成分。【方法】采用柱层析法,利用大孔吸附树脂、离子交换树脂和高效液相色谱等对S.albulus OoWysR的活性成分进行分离纯化,经高分辨率电喷雾电离质谱(high-resolution electrospray ionization mass spectrometry,HR-ESI-MS)和核磁共振(nuclear magnetic resonance,NMR)等波谱技术对化合物化学结构进行鉴定,并通过生长速率法测定化合物的生物活性。【结果】从S.albulus OoWysR中分离鉴定出4个化合物,分别为对羟基苯甲酸(1)、吡咯-2-羧酸(2)、对羟基苯乙醇(3)和云南霉素(4)。化合物1对玉米弯孢病菌、番茄叶霉病菌、玉米小斑病菌和烟草赤星病菌具有一定的抑制作用;化合物2对番茄灰霉病菌、大豆菌核病菌、苹果腐烂病菌、玉米小斑病菌、小麦赤霉病菌、稻瘟病菌和烟草赤星病菌具有一定的抑制作用;化合物3对番茄灰霉病菌、苹果轮纹病菌、玉米小斑病菌和黄瓜炭疽病菌具有一定的抑制作用。【结论】S.albulus OoWysR的活性成分除武夷菌素外还包括对羟基苯甲酸、吡咯-2-羧酸、对羟基苯乙醇和云南霉素。本研究结果为进一步开发与利用该菌株提供了理论依据。

反硝化基因工程菌株YP4S的构建及对污水除氮特性研究

从养殖场污泥中筛选出菌株YP4,经16S rDNA分子发育树的同源序列比对,确定为克雷伯什菌属(Klebsiella sp.)。由NCBI数据库查编码亚硝酸还原酶(Nir)的基因nirS序列,设计引物,以铜绿假单胞菌PAOI基因组DNA为模板,应用PCR技术扩增目的片段nirS,经过双酶切、克隆和转化,得到重组质粒pYP4S,然后转化野生菌株YP4,构建反硝化基因工程菌YP4S。菌株生长曲线测定表明,工程菌株YP4S与YP4的生长特性基本一致。工程菌株YP4S对模拟污水COD、TN、NH_4^+-N和NO_3^--N具有较高的去除率,YP4S与YP4相比,对NO_2^--N积累的减少量为(32.44±3.96)%,明显减少了NO_2^--N的积累。通过正交试验获得工程菌株YP4S在C/N=10、T=30℃、r=200 r/min和pH=7.0的最佳组合条件下,对模拟污水TN去除率较高。应用工程菌株YP4S处理猪场沉淀池的实际污水,COD、TN、TP、NH_4^+-N和NO_3^--N去除率分别为(95.87±0.82)%、(76.38±3.84)%、(97.13±0.54)%和(75.35±2.57)%,NO_2^--N积累量为(3.31±1.24) mg/L,表明工程菌株YP4S具有较好反硝化作用,对含氮量高的实际污水修复具有潜在的应用前景。

2016-23基于pET22b基因工程菌株的抗菌蛋白表达、提取和纯化方法

一种基于pET22b基因工程菌株的抗菌蛋白表达、提取和纯化方法，以基因工程菌株ZSM-12（pET．22b-TasA—BL21）为对象，建立一种抗菌蛋白高表达方法；并且建立一种蔗糖和溶菌酶同时处理从细胞周质空间提取抗菌蛋白方法以及一种改进的HIS柱纯化抗菌蛋白方法。

2016—45改造核糖体结合位点提高基因工程菌株生产重组人骨形态发生蛋白2产量的方法

本方法涉及基因技术和微生物技术领域，涉及基因工程菌株生产蛋白质药物领域中的核糖体结合位点（RBS）改造技术。将大肠杆菌密码子优化后的重组人骨形态发生蛋白2（rhBMP．2）基因（具有SEQIDNO．1核苷酸序列的DNA）克隆到质粒pET28a中得到质粒pHJBMP01；将pHJBMP01中RBS改变为新的RBS（具有SEQIDNO．2核苷酸序列的DNA）得到质粒pHJBMP02；将pHJBMP01和pHJBMP01分别导入大肠杆菌BL21得到sHJBMP01和sHJBMP02本方法提供的RBS改造后的sHJBMP02生产rhBMP-2的发酵单位提高到136．3mg／L。

提高基因工程菌产二素链霉菌311—10产生酰化螺旋霉素的研究

基因工程菌产二素链霉菌(Str.ambofaciens)311-10是一株含麦迪霉素4″—羟基酰化酶基因的螺旋霉素产生菌,可发酵直接产生酰化螺旋霉素。经质谱鉴定,所产生的酰化产物为4″—异戊酰、4″—丁酰及4″—丙酰螺旋霉素,并含有50～60％的螺旋霉素组份。为了提高酰化螺旋霉素的含量,研究了17种氨基酸及有关化合物对产二素链霉菌311-10菌株直接产生酰化螺旋霉素的影响。结果显示,在发酵过程中添加一定量α—羟基异丁酸或L—异亮氨酸,酰化螺旋霉素的的百分含量可从对照组的45％分别提高到73％和67％。如同时加入α-羟基异丁酸和L-异亮氨酸.则酰化螺旋霉素的含量可增至88％左右。研究表明含麦迪霉素4″—羟基酰化酶基因的螺旋霉素产生菌能利用L—异亮氨酸或α—羟基异丁酸作为酰基的供体。从不同发酵时间加入试验表明合适的添加时间为发酵前期24小时左右。提示L—异亮氨酸或α—羟基异丁酸不只是提供酰化螺旋霉素4”—酰化酶酰基的供体,可能对4″—酰化酶基因的转录起诱导作用。 L—精氨酸能使酰化螺旋霉素组份下降至14％左右,并能抵消α-羟基异丁酸或L-异亮氨酸对酰化螺旋霉素的促进作用。 研究提示控制基因工程菌发酵条件,可以有效地获得所需基因工程产物。

基因工程菌SIPI-A0707代谢产物表柔红霉素的分离纯化工艺研究

目的建立天蓝淡红链霉菌基因工程菌(SIPI-A0707)发酵液中表柔红霉素的分离纯化工艺。方法调节发酵液pH值为5,用甲醇抽提表柔红霉素;先采用大孔弱酸性阳离子交换树脂D152,吸附流速为2mL/min,0.05mol/L HCl-50%丙酮解吸;然后采用氯仿-水萃取体系,萃取pH为6.5,反萃取使用pH为1.5的蒸馏水,最后采用大孔吸附树脂Microsphere-1;吸附pH为7,吸附流速3mL/min,50%甲醇解吸分步收集,浓缩冻干。结果表柔红霉素HPLC纯度达到98.1%,总收率为40%以上。结论此工艺在生产上可行性较高,适合工业大量制备。

发酵生物制氢领域的基因工程技术研究进展

氢气以其清洁、无污染、热值高的特征和广泛的来源,被认为是未来的良好能源载体。自然条件中,很多微生物可以利用有机底物或者水和光能代谢产生氢气。通过基因工程技术手段可以提高这些微生物的产氢能力,更有利于生物制氢技术的工业化应用和推广。文章综述了近年来基因工程手段在发酵法生物制氢领域的研究和应用情况,对现有的研究成果进行了比较,并对该技术将来在生物制氢领域的发展趋势做以预测分析。

高产靛蓝色素大肠杆菌工程菌的构建及靛蓝色素稳定性

目前国内外天然食用蓝色素资源稀缺,利用微生物发酵制备的靛蓝色素是天然蓝色素的重要来源之一。本文克隆了假单胞菌B3的苯乙烯单加氧酶基因sty AB,将其在大肠杆菌中进行了异源超量表达,构建了高产靛蓝色素的基因工程菌株E-AB,并研究了温度和光照等环境因素对靛蓝色素稳定性的影响。结果表明,工程菌以吲哚为底物合成靛蓝色素最高产量为68.9 mg/L,较野生型菌株提高约5.4倍。温度和光照条件对靛蓝色素色度稳定性具有显著性影响,低温和避光条件能显著延缓靛蓝色素的降解,而高温和紫外光则加速其降解;靛蓝色素降解反应较复杂,靛红是主要的降解产物之一。研究结果将为天然靛蓝色素的高效生物转化制备及应用提供了理论支持和技术指导。

海洋Pseudomonas aeruginosa sp. DES-3的鉴定以及基因ap02对其产蛋白酶的影响研究

海洋是地球上最大的生态系统,其多样独特的生态环境造就了其有别于其他环境的微生物资源。本研究利用蛋白酶的活性筛选策略,从辽宁省营口市某海洋淤泥中分离得到一株产蛋白酶的优势菌株DES-3。通过微生物形态学特征、生理生化性质和16SrDNA基因鉴定以及系统发育进化关系的分析,将该菌株鉴定为铜绿假单胞菌属,命名为Pseudomonas aeruginosa sp.DES-3。其胞外蛋白酶的最适反应温度和最适pH分别为55℃和9.0。将来自于碱性污染土壤宏基因组文库的编码碱性蛋白酶基因ap02与广宿主表达载体pBBR1MCS-5连接,转化至野生型菌株P.aeruginosasp.DES-3细胞中,成功构建了基因工程菌株P.aeruginosasp.DES-3/pBBR1MCS-5-ap02。基因工程菌株的最适反应温度为60℃,较野生型菌株提高了5℃。本研究构建基因工程菌株的策略可为菌株的改造和相应工业应用提供一定的技术参考。