HIV-1整合酶基因序列分析方法验证

目的 验证实验室自建人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)整合酶基因序列分析方法。该方法可用于评估HIV-1整合酶区段基因型耐药水平。方法 根据世界卫生组织自建基因序列分析方法验证的建议,从20份HIV-1阳性样本中提取RNA,扩增HIV-1整合酶区基因片段,并测序。通过与病毒质量保证(VQA)共识进行比对,评估实验室自建的HIV-1整合酶基因序列分析方案的准确性,通过扩增成功率评估其灵敏度,通过同一样本的重复检测结果评估其精密度和重现性。结果 20份样本与VQA共识的核苷酸一致率均>98%;10个高病毒载量(>10 000拷贝·mL^(-1))样本和5个低病毒载量(1 000~5 000拷贝·mL^(-1))样本的扩增成功率均为100%;4个样本的同批次5复孔和5个样本5次检测的结果均符合90%的样本配对比较核苷酸一致率>98%的要求。结论 该HIV-1整合酶基因序列分析方法的准确性、灵敏度、精密度和重现性均符合要求,适用于HIV-1整合酶基因序列分析。

鸡群中鸡传染性贫血病原与抗体检测及分离株VP1基因序列分析

为了解鸡群中鸡传染性贫血病毒(CAV)感染及抗体产生情况,从黑龙江省两个无临床症状鸡群(B群和S群)中,分别采集血清通过ELISA方法进行抗体检测,采集抗凝血并分离淋巴细胞,针对基因组保守序列设计引物,通过PCR方法进行病原检测,并对从B群病原阳性鸡分离到的分离株进行VP1基因序列分析。结果显示,B群和S群CAV抗体阳性率分别为62.7%(79/126)和68.2%(88/129),病原阳性率分别为43.0%(49/114)和62.3%(48/77),其中,B群和S群中抗体和病原双阴性的鸡分别为23.7%(27/114)和15.6%(12/77),而抗体和病原双阳性的鸡分别高达28.1%(32/114)和46.8%(36/77);在双阳性鸡中,B群和S群分别有62.5%(20/32)和58.3%(21/36)抗体滴度在1.0×10^(4)及以上,从B群病原阳性鸡全血中分离到一株CAV(HLJ/2022株),分离株HLJ/2022第394位氨基酸为谷氨酰胺,具有强毒的分子特征;两个鸡群的环境拭子CAV阳性率为10.0%(3/30),存在于消毒前的鸡蛋表面、更衣处和鞋底。研究表明,检测鸡群的CAV抗体阳性率在62.7%以上,病原阳性率在43.0%以上,抗体滴度在1.0×104及以上CAV仍可存在,CAV流行株(HLJ/2022)具有强毒分子特征,鸡群环境中存在CAV污染,结果为CIA防控提供重要的参考意见。

福建省新型鸭呼肠孤病毒生物学特性及基因序列分析

为了解福建省新型鸭呼肠孤病毒(NDRV)生物学特性和遗传变异状况,从福建省番鸭主要饲养区采集了8份临床发病样品进行病原学检测、病原分离、攻毒试验及S1基因序列分析。结果显示:8份临床样品均为NDRV阳性,接种番鸭胚后均成功分离到病毒;将NDRV尿囊液毒感染番鸭后3~10 d发病,发病率为20%~40%,死亡率为0~20%,剖检可见肝脏有出血斑及大量白色坏死灶,脾脏肿大坏死,与参考毒株NDRV-NP03相比,部分分离毒株毒力有所下降。S1基因序列分析发现:NDRV分离毒株与省内毒株亲缘关系较近,与省外毒株亲缘关系相对较远;在系统进化树上,8株NDRV分离毒株聚为同一分支,而福建省外毒株聚为另一分支,说明NDRV呈区域性流行特征;σC蛋白氨基酸序列与NP03株相比,存在12个差异位点,可能会导致NDRV感染能力发生改变。

微阵列芯片法和多同源基因序列测序在非结核分枝杆菌菌种鉴定中的差异

目的比较微阵列芯片法和多同源基因序列测序在非结核分枝杆菌(NTM)菌种鉴定中的差异,为NTM感染提供精准诊断依据。方法采用罗氏固体培养法复苏天津市海河医院2016—2019年保存的170株NTM菌株,分别采用微阵列芯片法和同源基因序列[16S rRNA、RNA聚合酶亚基B(rpoB)、热休克蛋白65(hsp65)]测序进行鉴定。以多同源序列测序分析结果为参考,分析微阵列芯片法菌种鉴定的准确性。比较2种方法样本周转时间(TAT)的差异。结果微阵列芯片法鉴定出8个NTM菌种,同源序列测序鉴定出14个。微阵列芯片法无法鉴定出缓慢生长群的猿分枝杆菌、慢生黄分枝杆菌、副瘰疬分枝杆菌和快速生长群的龟分枝杆菌、马德里分枝杆菌、母牛分枝杆菌等10个菌种,多同源序列测序可鉴定出全部的菌种。以多同源序列测序分析结果为参考,微阵列芯片法鉴定错误7株,鉴定到复合群的正确率为90.0%(153/170);16S rRNA、rpoB、hsp65单独和3个同源序列联合分析鉴定到复合群的正确率分别为93.5%、98.8%、99.4%和100.0%。对于微阵列芯片法无法区分的53株龟/脓肿分枝杆菌复合群(MABC),3个同源序列联合测序鉴定出6株龟分枝杆菌、25株MABC脓肿亚种、20株MABC马赛亚种和2株MABC bolletii亚种。微阵列芯片法单个样本鉴定TAT为8 h,170株NTM菌株全部鉴定需要2 d;多同源序列测序单个样本鉴定TAT为3 d,170株NTM菌株全部鉴定约需要5 d。结论微阵列芯片技术可快速鉴定临床常见分枝杆菌。多同源基因序列测序不仅可鉴定临床常见分枝杆菌,还可鉴定微阵列芯片法无法鉴定出的菌种和可能鉴定错误的菌种及其亚种,但所需时间较微阵列芯片法长。

基于等基因序列双重随机遗传算法的复合材料铺层优化

复合材料铺层优化中常用的各种遗传算法较难同时综合考虑表面45°、分层比例、连续铺层数限制等复杂工程约束问题,基于此,提出一种针对复合材料层压板的等基因序列双重随机遗传算法,在交换和突变算子中引入双重随机算法以保证优化迭代中基因序列的严格相等,基于SABRE软件实现该优化算法,并通过算例验证算法的正确性。结果表明:该算法可满足均衡性、对称性、表面45°、连续铺层数限制、铺层比例等复杂工程约束,有较高的可靠性与工程适用性。

孔雀球虫的分子鉴定及其ITS rRNA基因序列分析

为了解云南省昆明市孔雀感染球虫的种类及种属关系,采集昆明市2个动物园孔雀粪便样品及肠道内容物样本进行球虫卵囊的收集,进行形态学鉴定,PCR扩增球虫ITS rRNA基因,测序和序列分析,并利用MEGA6.0软件构建遗传系统进化树。结果显示,扩增的ITS rRNA基因序列长度为492 bp和493 bp,共鉴定出2种球虫,分别为和缓艾美耳球虫(Eimeria mitis)和火鸡和缓艾美耳球虫(E.meleagrimitis),相似度均为100%;进化分析结果表明,孔雀和火鸡之间可能存在球虫的交叉感染风险。该研究结果丰富了野生雉类寄生虫病的资料。

基于rDNA ITS 1基因序列的贵州山香圆平背粉虱遗传分化分析

【目的】探明茶树害虫山香圆平背粉虱不同地理种群的遗传多样性,掌握其遗传分化现状,为其科学防治提供依据。【方法】基于贵州茶园山香圆平背粉虱10个地理种群的rDNA ITS1基因序列片段,采用MEGA-X、DnaSP 5.10、Arlequin 3.5.2.2及SAMOVA 2.0等研究其种群遗传分化、基因交流、分子变异及种群遗传多样性。【结果】贵州茶园山香圆平背粉虱10个地理种群的rDNA ITS1基因序列共获得68条基因序列片段,其序列长度为434 bp,包含保守位点306个,变异位点78个,简约信息位点48个,其中9个位点发生转换,9个位点发生颠换,具有明显的G+C偏倚性;其共定义47个单倍型,包括5个共享单倍型和42个独享单倍型;总群体遗传多样性较高,表现出高单倍型多样性(H_(d)=0.968)和高核苷酸多样性(P_(i)=0.03628);总群体遗传分化程度高(F_(st)=0.72460),基因交流水平低(N_(m)=0.10);遗传变异主要来自组间(F ct=0.64620);单倍型系统发育分析表明,山香圆平背粉虱聚为两分支,MT、YQ、FG与SY种群聚成一类,MT、DZ、RH、HX、QX、JS与HHG种群聚成一类。【结论】贵州茶园山香圆平背粉虱总体遗传多样性水平较高,基因交流水平较低,具有显著的遗传分化。

福建华溪蟹线粒体DNA COI和16S rRNA基因序列的遗传多样性

目的探讨福建华溪蟹(Sinopotamon fukienense)的遗传多样性。方法采用PCR结合DNA测序技术,测定S.fukienense的线粒体COI和16SrRNA基因序列的组成。经比对获得639bp长度的COI基因序列和526bp的16SrRNA基因序列,以对比分析S.fukienense的遗传多样性。结果 S.fukienense基于COI基因核苷酸多样性(Pi)为0.048 4,高于其基于16SrRNA基因核苷酸多样性(Pi)为0.021 6。同时,S.fukienense基于COI基因单倍型间的平均遗传距离(P)为0.048,大于其基于16SrRNA基因单倍型间的平均遗传距离(P)0.026。结论 COI序列在分析S.fukienense遗传异变时的作用更优于16SrRNA基因序列。

基于ITS基因序列的我国东南沿海等边浅蛤遗传多样性及遗传结构研究

为探究我国东南沿海等边浅蛤的遗传多样性以及群体遗传结构特征,基于等边浅蛤核糖体DNA(rDNA)的基因间隔区(ITS)序列,对我国舟山、南麂岛、漳浦、北海4个群体,共81个等边浅蛤个体进行了测序分析,经处理得到长度为420 bp的同源序列,共检测到31个单倍型。研究结果显示4个等边浅蛤群体遗传多样性水平较高,其中单倍型多样性(h)和核苷酸多样性(π)的平均值分别为0.733和0.01863。两群体之间遗传分化系数(Fst)值结果显示,北海群体与其他3个群体之间存在遗传分化,且达到显著水平(P<0.05)。NJ系统进化树和单倍型网络图均显示北海群体与其他3个群体间存在遗传分化,这与Fst值显示的结果一致。分子方差分析(AMOVA)的结果显示68.87%的变异来自于群体内,中性检验结果显示,4个等边浅蛤群体的Tajima′s D值均不显著(P>0.05),Fu′s Fs值总体未达到显著水平。这表明4个等边浅蛤群体符合中性进化,无群体扩张现象发生。

广西流行的猪瘟病毒株E2基因序列测定及分析

目的对广西流行的猪瘟病毒E2基因进行序列测定及分析。方法应用PCR对15株猪瘟病毒E2基因进行扩增、克隆及测序,利用DNAstar分析软件对所测定的15株毒株与兔化弱毒(HCLV)、石门(Shimen)毒株的相应基因片段进行同源性分析。结果得到长度为1092nt猪瘟病毒E2基因,编码364个氨基酸残基的目的基因片段。广西株与HCLV、Shimen株的核苷酸同源性分别为81.5%～82.8%和82.8%～84.3%,推导的氨基酸同源性分别为87.1%～88.8%和88.5%～89.9%,广西毒株之间核苷酸与推导的氨基酸同源性分别为92.3%～99.9%和94.8%～100%。广西15株猪瘟病毒E2蛋白上的全部半胱氨酸(Cys)位点均未改变,推测其E2蛋白的抗原结构保持很高的稳定性。但广西毒株中与特定单克隆抗体结合的724、725、729、734和738位的氨基酸发生了变异,这些变异可能导致不完全免疫保护。把所测定的广西15株与国内外已发表的19株病毒相应序列进行比较,建立系统发育树,所比较的34株猪瘟病毒被分为两个群,广西毒株皆属于基因群Ⅱ。结论成功进行了广西流行猪瘟病毒E2基因序列分析,为进一步探讨猪瘟病毒E2蛋白的抗原结构提供了依据。

16S rRNA基因序列分析在临床微生物学中的应用

20世纪70年代前，生物类群的区分主要是根据形态和结构、生理和生化特征、行为习性表现以及少量的化石资料来进行的。这种通过表型特征鉴定的方法对细菌之问的亲缘性判断有时不够准确。随着分子生物学的发展，人们开始利用生物大分子特别是蛋白质和核酸的结构特征，作为判断生物进化关系的主要特征。其中Woese等通过寡核苷酸编目的方法，在20世纪70年代逐渐发展出1种新的鉴定细菌的标准，即通过比较1段稳定的遗传编码——16S rRNA基因序列来分析和鉴定细菌的种系发生关系，判断其亲缘性，对细菌进行分类。

云南省2021年猪蓝耳病流行情况调查及基因序列分析

为全面准确掌握云南省猪蓝耳病(PRRS)病原分布、免疫效果及流行情况,根据2021年云南省动物疫病监测与流调计划,每季度在各州(市)下辖各县(市)区按照配额抽样方法,分别在规模场、散养户和屠宰场采集棉拭子、全血和脾肺淋巴共6457份病原学检测样品以及37912份血清学检测样品,尽量保证全年采集样品覆盖全省所有县(市)区。采用ELISA和qPCR方法进行抗体和病原检测,采用克隆测序方法对病原学阳性样品中的ORF7基因和Nsp2基因进行测序分析。结果显示,2021年云南省PRRS抗体阳性率77.29%;病原学样品阳性率2.91%,场阳性率19.86%。所选毒株ORF7基因序列同源性为98.5%,与国外参考毒株同源性为88.6%~92.9%;所选毒株Nsp2基因序列同源性为97.7%~100%,与国外参考毒株同源性为93.9%~97.3%,分布于美洲株JXA1分支。虽PRRS已退出强免,但养殖场户仍在进行主动免疫,PRRS抗体水平维持在70%以上,后续应根据不同防控阶段,制定实施科学免疫方案,逐步实现从免疫控制到免疫退出。病原学阳性分布污染面广,毒株复杂但变异相对保守,后续应以疫病净化为防治重点,不断完善养殖场生物安全体系,逐步实现净化目标。

mtDNA 12S rRNA基因序列测定在腐烂动物肌肉样本鉴定中的应用

目的利用mtDNA12SrRNA基因序列测定法对宁波森林公安局查获的一例腐烂动物肌肉样本进行种属鉴定,并探讨该方法在腐烂动物肌肉样本鉴定中的应用价值。方法用酚/氯仿法从腐烂动物肌肉样本中提取出基因组总DNA,再用一通用引物通过PCR技术扩增mtDNA上12SrRNA基因的部分片段并进行序列测定。测序结果在GenBank上进行BLAST搜索,再利用DNAMAN软件进行同源性分析。结果扩增产物序列与东北虎的线粒体DNA的12SrRNA基因序列的部分片段的同源性高达99.9%。结论该动物样本为东北虎,本研究所用方法在野生动物案件的样本鉴定中有极高的应用价值。

利用mtDNA COⅠ基因序列鉴定我国烟粉虱的生物型

利用mtDNACOⅠ基因片段作标记 ,采用序列分析的方法 ,从分子生态学的角度研究了近年来在我国暴发危害的烟粉虱Bemisiatabaci 5个种群 (北京一品红种群 ,广州甘蓝种群 ,西安一品红种群 ,北京西红柿种群和新疆吐鲁番棉花种群 )的生物型。在 5个种群的基因片段上 ,截取与Texas B型相应的 72 0bp的序列分析 ,结果表明所测序列中只有 2个碱基与Texas B型不同 ,序列相似性为 99 7% ;在西安一品红种群和新疆吐鲁番棉花种群的原序列中截取与Arizona B型序列相应的4 2 3bp片段 ,分析表明这两个种群与AZB3型属于同一个单倍型。因此 ,我国烟粉虱 5个实验种群的生物型与Texas B型和Arizona B型种群为同一生物型“B”。

烟粉虱不同地理种群的mtDNA COI基因序列分析及其系统发育

烟粉虱Bemisia tabaci(Gennadius)是一种世界性的重要害虫并具有多种生物型。本文利用mtDNA COI基因片段对国内外12个地理种群烟粉虱的生物型进行了鉴定并对其来源进行了分析。序列比较和系统发育分析结果表明,采自北京海淀、河南郑州、山东枣庄、江苏南京、上海闵行、海南海口等地的烟粉虱与来自美国California州、Texas州、Arizona州以及以色列的B型烟粉虱的同源性达到99.8%～100%,由此可见目前在中国广大地区暴发成灾的烟粉虱生物型为B型;而采自云南省昆明地区一品红寄主植物上的烟粉虱与来自摩洛哥和西班牙的Q型烟粉虱具有极高的同源性,该烟粉虱生物型为Q型,这也是首次报道Q型烟粉虱入侵中国。

广藿香的基因序列与挥发油化学型的相关性分析

目的 探讨“南药”广藿香Pogostemoncablin (Blanco)Benth .不同产地间的叶绿体和核基因组的基因型与挥发油化学型的关系 ,为广藿香道地性品质评价、规范化种植提供分子依据。方法 用PCR直接测序技术对广藿香6个产地样本的叶绿体matK基因和核 18SrRNA基因核苷酸序列进行测序分析研究。结果 广藿香 6个样本的matK基因序列长均为 12 4 5bp ,编码 4 15个氨基酸成熟酶。 18SrRNA基因序列长为 180 3～ 180 5bp。根据排序比较 ,广藿香 6个样本间的matK基因序列存在 4 7个变异位点 ,18SrRNA基因存在 17个变异位点 ,非加权组平均法构建的系统分支树表明广藿香基因序列分化与其产地、所含挥发油化学变异类型呈良好的相关性。结论 结合挥发油分析数据 ,基因测序分析技术可作为广藿香道地性品质评价方法这一以及规范化种植过程关键技术“物种鉴定”

不同产地浙贝母的基因序列及生物碱含量比较

目的:探讨道地药材形成的基因基础。方法:以AS和AS-1为引物对4个不同产地浙贝母的5S-rRNA基因间区进行了PCR扩增和测序,并采用酸性染料比色法测定了它们的总生物碱含量及用柱前衍生化气相色谱法测定了其中2个单体生物碱的含量。结果:不同产地浙贝母的5S-rRNA基因间区具有相同的碱基序列,均为588bp;它们的总生物碱含量相当,气相色谱结果也表明,它们含有相同的单体生物碱,只是各单体生物碱的含量不同。结论:不同产地浙贝母的差异不是由碱基序列,而是由小环境因素引起的。

中国东南沿海青蟹属不同种类的mtDNA COI基因序列分析及其系统发育

对采自中国东南沿海青蟹属的4种青蟹锯缘青蟹Scylla serrata(Forskal,1775),紫螯青蟹S.tranquebarica(Fab-ricius,1798),榄绿青蟹S.olivacea(Herbst,1796),拟穴青蟹S.paramamosain(Estampador,1949)的线粒体COI基因片段进行了测定,分析研究了其种间遗传差异及系统发育关系.研究结果显示:4种青蟹在COI基因片段上存在差异,种间序列差异远大于种内差异.青蟹属在我国的优势种与GenBank上的S.paramamosain的遗传距离为0.001 3,与S.ser-rata的遗传距离为0.121 3.序列特征、遗传距离和系统进化等分析结果表明中国青蟹属的优势种为拟穴青蟹S.para-mamosain.

从Cyt b基因序列探讨鹿亚科动物的系统发生关系

鹿亚科共有 4个属 ,各属间和属内特别是鹿属内的系统进化关系存在疑义。根据Cytb基因序列分析 ,探讨了鹿亚科及中国鹿属、马鹿亚种的进化关系。结果分析表明 :现行分类系统中 ,斑鹿属可能并非单系发生 ,暗示应将豚鹿并入鹿属 ;麋鹿属与鹿属有较近的进化关系 ,也应并入鹿属 ;鹿属的进化地位有待进一步研究 ;归并后的鹿属为单系发生。中国马鹿各亚种在系统发生上是一单系群 ,其中马鹿天山亚种和阿尔泰亚种聚为最原始的一支。

基于16SrRNA基因序列分析梅花鹿瘤胃细菌多样性

本试验旨在对以柞树叶为主要粗饲料来源的梅花鹿瘤胃细菌多样性进行分析。提取瘤胃微生物基因组DNA，扩增细菌16SrRNA基因，构建16SrRNA基因克隆文库，分析梅花鹿瘤胃细菌区系组成。结果表明：1）试验共得到107个非嵌合体16SrRNA基因序列。按照97％序列相似性，划分为22个分类操作单元（OTUs）。