慢病毒介导人肝细胞生长因子基因感染BMSCs的实验研究

目的构建携带人肝细胞生长因子(human hepatocyte growth factor,hHGF)基因的慢病毒,感染大鼠BMSCs,建立稳定表达hHGF的BMSCs/hHGF细胞。方法从含hHGF基因的质粒pcDNA-hHGF中,用PCR法获取hHGF全长基因,与慢病毒载体pGC-E1分别进行AgeⅠ酶切,产物定向连接,转化后行PCR鉴定和测序,构建hHGF慢病毒表达质粒。脂质体Lipofectamine2000介导慢病毒载体三质粒pGC-E1-hHGF、pHelper1.0、pHelper2.0共转染293T细胞。收集病毒超滤离心浓缩,实时定量PCR测定滴度。将hHGF慢病毒感染BMSCs,荧光显微镜观察荧光表达,确定最佳感染复数(multiplicities of infection,MOI)值,以最佳MOI值感染细胞,流式细胞仪检测感染效率,ELISA法检测细胞培养上清hHGF分泌水平,RT-PCR检测hHGF基因的表达。结果实验成功构建携带hHGF基因的慢病毒,滴度达1×108TU/mL。hHGF慢病毒高效率感染BMSCs,最佳MOI值为10。流式细胞仪检测感染效率达98%,且在感染后28d BMSCs仍稳定表达强烈的绿色荧光。细胞培养上清可检测到hHGF因子,术后5d达高峰,达40.5ng/mL,这种高水平分泌可持续至感染后28d。RT-PCR检测出hHGF基因的表达。结论通过慢病毒载体将hHGF基因稳定感染至BMSCs细胞,可获得长期稳定的表达,并持续分泌hHGF因子。

应用抑制消减杂交和cDNA芯片技术筛选流行性感冒病毒感染相关基因

病毒基因组有限的编码能力和以病毒蛋白为靶的抗病毒药物易出现耐药性 ,使从病毒感染宿主筛选病毒感染相关生物大分子作为抗病毒药靶和诊断标志物成为新的研究方向。为了筛选流行性感冒 (流感 )病毒感染相关基因 ,采用抑制消减杂交 (suppressionsubtractivehybridization ,SSH)技术 ,以流感病毒A/鲁防 / 93 - 9(H3N2 )感染的MDCK细胞及正常MDCK细胞为材料 ,构建病毒感染特异性差减cDNA文库。从文库中随机挑取约 80 0个克隆 ,PCR扩增其中插入片段 ,经纯化、紫外定量后 ,用基因芯片自动点样仪点在氨基片上 ,制备cDNA芯片。将流感病毒感染的MDCK细胞和正常MDCK细胞的总RNA分别用Cy3、Cy5反转录荧光标记后 ,与cDNA芯片杂交 ,用芯片扫描仪扫描获得芯片杂交信号 ,经阳性对照校正和归一化处理后 ,以如下条件作为判定基因差异表达的标准 ;(a)Cy3与Cy5的信号比值大于 1 5 (正常细胞用Cy5标记 )或小于 0 6 7(正常细胞用Cy3标记 ) ;(b)Cy3和Cy5信号值之一必须大于 10 0 0。经cDNA芯片筛选获得了 18个流感病毒感染特异性克隆 ,经测序和生物信息学分析发现均为流感病毒感染相关新基因EST。流感病毒感染相关基因cDNA片段的获得 ,为新型病毒药靶诊断标志物发现和功能研究提供了基础。

病毒感染相关基因微阵列的制备及其在HBV感染应答基因筛选中的应用

为筛选乙型肝炎(乙肝)病毒(HBV)感染应答基因,探讨HBV感染分子机理,采用生物信息学分析、筛选宿主细胞中与乙肝病毒、丙型肝炎(丙肝)病毒、流行性感冒(流感)病毒等感染密切相关的基因,设计并合成寡核苷酸探针,制备了含231种病毒感染相关基因的寡核苷酸微阵列。利用此微阵列比较HepG2细胞、HepG2 2 15细胞之间的基因表达谱差异,筛选乙肝病毒感染候选应答基因,从分子水平对乙肝病毒感染作用机理进行初步研究。制备的病毒感染相关基因表达谱微阵列的监测结果显示,阳性对照和看家基因探针出现较强信号,空白点样液和阴性对照探针未出信号,大部分基因探针信号强度在可分析范围内,上矩阵和下矩阵反映的基因表达情况一致,证明微阵列的特异性、敏感性、重复性都较好。HepG2 2 15与HepG2细胞基因表达谱比较结果显示,28个宿主基因在HepG2 2 15细胞中高表达,包括ASGR1、AFP、Fibronectin、APOC等基因;4个基因低表达,包括RRM1、ICSBP等基因。初步筛选获得HBV感染候选应答基因。此结果表明,制备的微阵列敏感性、特异性、重复性好,可为研究病毒宿主相互作用关系提供技术平台,应用此微阵列筛选获得的HBV候选应答基因可为揭示HBV感染的分子致病机理提供新的信息,为抗HBV药物研究提供潜在的作用靶点。

包头地区2637例女性HPV感染情况及基因型分析

目的:根据所调查检测的来自包头地区2637名受检女性人员的HPV基因分型结果分析,初步了解包头地区适龄受检女性HPV的感染情况。方法:采用PCR-反向点杂交技术进行HPV基因分型的检测,并对所得结果做出分析探讨。结果:在所有受检女性中发现有723名感染人员,阳性率达27.42%;发现单一基因型别感染最多,占所有感染人员的69.02%;双重基因型别和多重基因型别分别占23.24%和7.74%;本次实验可查23种HPV基因型,于受检人群中共发现21种亚型,即检出高危型别16种,低危型别5种,2种高危型别HR-73和HR-83未检出;检出感染率最高的前3位分别是HR-52(6.22%)、HR-16(6.07%)和HR-58(3.15%);HPV在各年龄组女性中均可检出,其中35~44岁HPV的感染率最高,感染率为32.04%,HPV女性感染率在年龄上总体差异有统计学意义(P<0.05),在HPV双重型别感染率上不同年龄受检人员差异有统计学意义(P<0.05)。结论:包头地区受检女性人员的HPV感染以单一高危基因型别为主,同时存在双重基因型别和多重基因型别。且感染率与年龄有关,35~44岁年龄组的HPV感染率最高,有必要对这一年龄段的人群加强防癌的宣教和HPV的筛查。

猪伪狂犬病病毒HeN1株全基因组测序及感染和毒力相关基因的变异特征分析

2011年以来我国多个省份免疫过Bartha-K61弱毒疫苗的猪场相继发生猪伪狂犬病（PRl疫情。为分析PR病毒（PRV）流行株的变异情况，本研究对其中一株PRVHeNl分离株进行了全基因组测序，并对PRV感染相关基因（gB、gC、gD和gH）和毒力相关基因（TK、PK、RR1、RR2、gE和gI）进行比较分析。结果显示，国内分离株之间的序列同源性很高（96．2％～100％），而与国外分离株的同源性较低（92．9％～99．7％）；国内分离株与国外分离株在感染和毒力相关基因编码上存在氨基酸突变和插入／缺失特征；并且序列分析表明部分插入／缺失与微卫星序列重复单元数量的变化相关。遗传进化分析表明，国内外分离株间具有显著的遗传差异，处于两个独立的遗传分支。此外，国内分离株相对于国外分离株在gC蛋白中存在7个连续氨基酸的插入（63AAASTPA69），该插入突变可以作为PRV国内外病毒株的分子特征。本研究为有效防制PR提供实验依据。

一个与大鲵蛙病毒(ADRV)感染相关基因-6R的克隆、原核表达及其产物分离

在新近报道大鲵蛙病毒(Andriasda vidianus ranaviurs,ADRV)基因组的基础上,我们对ADRV 6R进行了克隆、原核表达及其产物的分离,这是一个经生物信息分析表明与病毒感染相关的功能基因。先经PCR扩增长到711 bp的ADRV6R,构建含扩增片段的克隆质粒p MD18-T-6R。再构建原核表达质粒p ET-32a-6R,进行测序,并与水生动物蛙病毒相关基因同源序列进行比对,该扩增片段与预期一致,其编码分子量约为27 k D、含236个氨基酸的蛋白,与水产动物病毒US22蛋白家族(US22 family protein)成员有很高的同源性。然后对p ET-32a-6R进行转化、诱导表达,并利用Ni-NTA His-Bind亲和层析及不同浓度咪唑洗脱液对表达产物进行分离、电泳分析,结果显示,获得与预测分子量相符的45 k D融合蛋白(27 k D目的蛋白与18 k D His标签)。这为后续制备抗体、并开展大鲵蛙病毒与宿主的相互作用研究提供了有用的实验材料。

中国首次分离的辛德毕斯病毒XJ-160病毒株感染性全基因组cDNA克隆的构建与分析

报告了中国首次分离的辛德毕斯病毒XJ-160株的感染性全基因组cDNA克隆的构建与鉴定.利用RT-PCR方法获得覆盖病毒全长基因组的cDNA片段,以低拷贝质粒pBR322作为骨架,将基因组cDNA置于SP6 RNA聚合酶启动子之后,基因组3'末端带有35个连续的A,通过DNA重组技术组装成病毒基因组全长cDNA克隆.该克隆可在大肠杆菌DH5a中稳定扩增.经体外转录,RNA转录体转染BHK-21细胞,细胞发生病变,恢复病毒滴度达到107～108pFU/ml.全基因组cDNA克隆构建过程中引入的沉默突变(8 453位核苷酸由C变为T)产生Xba Ⅰ酶切位点作为遗传标记,在子代恢复病毒的基因组中稳定存在.从细胞病变的特征、BHK-21细胞的空斑形态、病毒的抗原性、病毒在细胞中的生长动力学特征以及对乳鼠的致病性等方面比较,恢复病毒和亲本病毒XJ-160没有显著区别,提示获得了具有感染性的XJ-160病毒全长cDNA克隆.该病毒感染性全基因组cDNA克隆可以作为反向遗传学系统,为进一步研究病毒复制和致病机制,以及开发相应的载体表达系统提供分子生物学工具.

感染性犬2型腺病毒全基因组克隆及鉴定

以犬 2型腺病毒 (canine adenovirus type- 2 ,CAV- 2 )自然弱毒株 YCA18基因组 DNA为模板 ,经 PCR扩增分别获得其双链两末端 10 13bp(U)和 972 bp(D)的 DNA序列 ,以首尾相接方式克隆入载体 p Poly2 ,获得重组质粒p Poly2 - UD。以 Hind 和 Bst B 双酶切 p Poly2 - UD,回收含载体和部分 U、D的大片段并与 CAV- 2 DNA共转化感受态 E.coli Sure TM,经菌体内同源重组 ,获得含有 CAV- 2全基因组序列的重组质粒 p Poly2 - CAV- 2。后者以 Cla 和 Asc 双酶切 ,释放 CAV- 2全基因组 ,通过脂质体介导转染 MDCK细胞 ,盲传 3代后重复转染 1次 ,4d后 ,出现腺病毒典型病变。细胞上清血凝效价为 1∶ 6 40 ,并可被 CAV- 2抗血清有效抑制。以上结果表明 ,本研究获得了具有感染性的CAV- 2全基因组重组质粒 ,为以 CAV- 2作为重组疫苗载体的系列研究奠定了重要基础。

宫颈HPV感染现状及基因型分析

目的：探讨本地区女性人乳头瘤病毒（HPV）感染状况及其分布规律,为本地区HPV分子流行病学研究提供依据。方法：应用罗氏cobas 4800全自动化分子诊断系统分析2013年8月~2014年8月来我院就诊的3500例可疑患者,采集其宫颈分泌物标本,进行HPV16、18及其它高危型检测,分析常见感染的规律。结果：HPV阳性总检出率为18.4%（643/3500）,其中高危型主要为HPV16,感染率40.8%（262/643）,HPV 18感染率35.0%（225/643）,其它型高危型感染率24.2%（156/643）;单一基因型感染446例,占感染人数的69.4%;两重感染178例,占感染人数的27.7%;三重感染19例,占感染人数的2.9%。结论：本地区HPV感染者主要为16、18型,占总检出率75.7%（487/643）,主要为单一基因型感染,其它高危型24.2%有待进一步分型,研究其感染类型。

猪蛔虫感染相关基因07E12的RNAi研究

为寻找猪蛔虫免疫防治的"关键"靶分子,从已构建的猪蛔虫感染期幼虫消减cDNA文库中筛选了一感染相关基因(EST编号为07E12),采用RNA干扰(RNAi)技术对该基因的功能进行了初步探讨。针对其EST序列设计了1对特异引物,体外转录合成双链RNA(dsRNA)后,通过浸泡的方式将dsRNA导入猪蛔虫感染期幼虫中,在浸泡后的4个不同时间点采用RT-PCR方法检测虫体浸泡后靶基因被干扰的效果。试验结果表明,在浸泡后24、48、72 h都检测到了相对应基因表达的存在,但表达量随时间依次减少,96 h之后试验组没有检测到07E12的相应RNA的表达,提示dsRNA进入虫体并逐渐发挥了干扰作用,说明该基因在猪蛔虫幼虫感染宿主的过程中可能扮演重要角色。

抗病毒药物研究新领域:病毒感染基因组学

由于病毒基因组编码基因数量少 ,从病毒中发现药物靶标受到一定限制。最近的研究表明 ,抑制宿主细胞中某些蛋白的功能可以阻断病毒感染。与病毒基因组相比 ,人类基因组序列中可能包括更多的与病毒繁殖有关的基因。用DNA微阵列技术系统分析宿主基因表达 ,是一种从宿主细胞角度发现潜在抗病毒靶标的有效方法。最近报道了有关病毒影响宿主细胞基因表达谱的研究战略 ,以及通过表达谱分析来发现与病毒复制有关的宿主细胞通路。因此 。

应用抑制性消减杂交技术筛选流感病毒感染宿主应答基因

从宿主系统寻找病毒感染特异性相关的生物大分子是研究病毒药物靶标和诊断标志物的新方向 .为了筛选宿主细胞中流感病毒感染特异性基因 ,采用抑制性消减杂交技术 (SSH) ,以流感病毒A 鲁防 93 9(H3N2 )感染MDCK细胞及正常MDCK细胞为材料 ,构建病毒感染特异性差减cDNA文库 ,PCR法扩增鉴定其中插入片段大小 .从差减文库中随机挑取 10 0个克隆进行测序 ,用生物信息学方法对其同源性和基因功能进行分析和预测 .结果显示 ,成功构建了流感病毒感染特异性差减cDNA文库 ,文库中cDNA片段长度在 2 5 0～ 10 0 0bp之间 .从文库中随机选取 10 0个克隆测序 ,获得了 95个有效序列 ,经blast同源性分析发现 ,大部分基因为参与宿主细胞能量代谢和蛋白质生物合成过程中的基因 ;其中 19个为无任何功能线索的新基因片段 .流感病毒感染特异性差减cDNA文库的建立和筛选出病毒感染应答候选新基因cDNA片段 。

胃癌癌变中幽门螺杆菌及其CagA^+基因株感染的研究

目的 :探讨胃癌癌变中幽门螺杆菌 (HP)及其CagA+基因株感染的情况。方法 :应用组织学和免疫印迹技术分别检测胃癌及萎缩性胃炎患者HP和HpCagA +基因株的感染率。结果 :胃癌组、萎缩性胃炎组的HP阳性率均显著高于正常组(P<0.01) ,胃癌组和萎缩性胃炎组HpCogA+基因株阳性率均显著高于正常组 (P<0.05～0.01) ,胃癌组的HpCagA+基因株阳性率显著高于萎缩性胃炎组 (P<0.01)。结论 :HpCagA +基因株的检测同HP检测一样 ,可作为协助胃癌早期诊断的一个指标 ,并且对HpCagA +基因株阳性的萎缩性胃炎患者进行追踪 ,有利于癌变的早期发现。

自然流产与女性生殖道沙眼衣原体不同基因型感染关系分析

孕妇生殖道沙眼衣原体受到感染会致使孕妇流产,沙眼衣原体自身存在的19种基因型中的D^K 8种基因型与生殖泌尿系感染具有相关性,D、E、F型作为女性生殖系统感染中常见因素必须予以重视。在CT检测中,不同基因型存在着不同的流行病学特征,然而在相关研究资料中不存在与沙眼衣原体不同基因型相关的研究,因此本研究中从女性生殖道沙眼衣原体不同基因型感染方向入手,探讨其与自然流产的关系,为二者之间的相关性提供理论性依据。

人乳头瘤病毒感染基因型对妇女宫颈鳞状细胞癌和腺癌发病的影响

目的:分析人乳头瘤病毒感染基因型对妇女宫颈鳞状细胞癌和腺癌发病的影响。方法:将2018年1月~2019年3月期间某院收取的40例宫颈正常组织作为对照组,同期将40例宫颈鳞状细胞癌组织作为研究1组,40例宫颈腺癌组织作为研究2组,借助PCR技术与基因芯片检测技术对HPV感染23种基因进行分型,对比分析3组的HPV感染率与HPV感染基因型具体分布情况。结果:对照组相较于研究1组和研究2组,HPV感染阳性率较低(P<0.05),且研究2组的HPV感染阳性率相较于研究1组较低(P<0.05);3组患者一重感染、二重感染与多重感染例数均差异显著(P<0.05);对照组HPV感染阳性患者中,HPV-43基因型的比例(40.00%)最高,研究1组HPV感染阳性患者中HPV-16(43.24%)与HPV-18(40.54%)基因型比例最高;研究2组HPV感染阳性患者中HPV-16(33.33%)与HPV-18(36.67%)基因型比例最高(P<0.05)。结论:HPV-16与HPV-18基因型与宫颈鳞癌、腺癌的发生与发展均具有十分密切的联系,且积极参与到宫颈癌患者的多重HPV感染中,因此临床需要密切关注HPV的感染,对宫颈癌预防且具有积极意义。

人乳头瘤病毒感染基因型对妇女宫颈鳞状细胞癌和腺癌发病的影响

目的:探讨人乳头瘤病毒(HPV)感染基因型对妇女宫颈鳞状细胞癌和腺癌发病的影响。方法:回顾性分析2015年7月—2018年7月于鹤壁市人民医院接受治疗患者的52例宫颈鳞状细胞癌组织、46例宫颈腺癌组织、54例宫颈正常组织分别作为鳞癌组、腺癌组和对照组。收集并分析各组患者临床资料,统计各组发生的HPV感染阳性率、一重感染率、二重感染率、多重感染率,统计HPV感染阳性患者23种HPV基因型构成比。结果:鳞癌组、腺癌组和对照组病程、BMI、高血压疾病史、糖尿病疾病史数据对比差异无统计学意义(P>0.05),对照组HPV感染持续时间为(7.60±1.03)天,明显短于鳞癌组(21.42±3.15)天和腺癌组(22.84±3.26)天,数据对比差异有统计学意义(P<0.05)。鳞癌组共发现47例HPV感染阳性患者,HPV感染阳性率为90.38%;腺癌组共发现34例HPV感染阳性患者,HPV感染阳性率为73.91%;对照组共发现6例HPV感染阳性患者,HPV感染阳性率为11.11%;腺癌组一重感染率最高,鳞癌组二重感染率和多重感染率最高,对照组一重感染率、二重感染率及多重感染率最低,各组患者数据对比差异有统计学意义(P<0.05)。鳞癌组47例HPV感染阳性患者共检测出104例HPV基因型,其中HPV-16基因型占比最大,为40.38%;腺癌组34例HPV感染阳性患者共检测出69例HPV基因型,其中HPV-16基因型占比最大,为30.43%;对照组6例HPV感染阳性患者共检测出8例HPV基因型,其中HPV-43基因型占比最大,为62.50%。结论:HPV感染持续时间可能与宫颈鳞癌、宫颈腺癌发生有关,宫颈癌患者组织中二重感染或者多重感染发生率较高,HPV-16、HPV-43基因型感染可能与宫颈鳞癌及宫颈腺癌发病机制具有相关性。

IFN-β基因修饰的人脐带源性间充质干细胞抑制A549和H226肺癌细胞的克隆、迁移和增殖能力

目的探讨干扰素-β(interferon-β,IFN-β)基因修饰的人脐带源性间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,huc MSCs)对非小细胞肺癌细胞株A549和H226克隆形成、迁移和增殖能力的影响。方法按照慢病毒IFN-β感染huc MSCs条件分为以下5组:慢病毒组、阴性对照病毒组、间充质干细胞组、干扰素组、空白对照组。将IFN-β慢病毒感染huc MSC,荧光显微镜观察荧光表达,确定最佳感染复数(multiplicities of infection,MOI)值,以最佳MOI值感染huc MSCs细胞。达到稳定感染后收集慢病毒组、阴性对照病毒组和间充质干细胞组的上清,ELISA法和Western blot检测以上3组的IFN-β表达的水平。克隆形成实验、Transwell小室迁移实验、细胞增殖-毒性检测法(CKK-8)检测A549、H226细胞克隆形成、迁移和增殖能力。结果慢病毒组和阴性对照病毒组的慢病毒感染效率均在85%以上,慢病毒组的IFN-β表达水平明显高于阴性对照病毒组和间充质干细胞组,慢病毒组A549细胞和H226细胞的克隆形成、迁移能力和增值能力明显降低。结论 IFN-β修饰的huc MSCs能显著抑制非小细胞肺癌细胞株A549和H226的克隆形成、迁移及增值能力,有望成为治疗非小细胞肺癌的一种新途径。

鼠胎肝干细胞生物学特性与人端粒酶反转录酶基因介导的影响

背景:研究表明,感染人端粒酶反转录酶基因后的干细胞具有稳定表达高水平端粒酶活性,且能使细胞增殖旺盛,这为建立基因工程的永生化干细胞系奠定了基础。目的:探讨人端粒酶反转录酶基因感染对体外培养鼠胎肝干细胞增殖及细胞周期的影响。方法:体外培养鼠胎肝干细胞,经重组腺相关病毒作为载体介导人端粒酶反转录酶基因感染,用RT-PCR、Western blot检测鼠胎肝干细胞人端粒酶反转录酶基因和蛋白的表达,CCK-8法、细胞生长曲线检测细胞生长增殖情况,流式细胞仪测定细胞周期分布的变化。结果与结论:与对照组、空载病毒组相比,基因感染组人端粒酶反转录酶基因和蛋白水平均有表达,细胞的生长速度明显增快,G0/G1期细胞减少,S期细胞数增多。结果表明以重组腺相关病毒作为载体介导人端粒酶反转录酶基因感染能促进体外培养的鼠胎肝干细胞增殖,对其培养有优化作用。

不同核苷(酸)类药物对不同HBV基因型慢性乙型肝炎患者抗病毒治疗的应答反应比较

目的:比较不同核苷(酸)类药物对不同HBV基因型慢性乙型肝炎患者抗病毒治疗的应答反应。方法:选取2014年8月—2017年9月间收治的慢性乙型肝炎(CHB)患者240例,将其随机分为阿德福韦酯组、恩替卡韦组、替比夫定组和拉米夫定组,每组60例,并分别采用阿德福韦酯、恩替卡韦、替比夫定、拉米夫定等药物对其治疗,比较4组患者分别接受治疗前通过聚合酶链反应法测定其HBV基因型,并将每组又分为B基因型45例、C基因型10例、B/C混合基因型5例),并在治疗前后分别检测和比较4组不同基因型患者血清HBeAg转换率、HBV-DNA转阴率和ALT复常率的差异。结果:HBV基因型中B基因型、C基因型、B/C混合基因型患者分别有45例、10例、5例,分别占75.00%、16.67%和8.33%,未检出其他基因型;采用替比夫定、恩替卡韦、拉米夫定药物治疗时,B基因型患者的ALT复常率、HBeAg血清转换率、HBV-DNA转阴率均高于B/C混合基因型与C基因型患者(P<0.05)。结论:不同核苷(酸)类药物与不同HBV基因型抗病毒的疗效之间具有一定的相关性。