基因扩增产物微孔杂交法检测新城疫病毒致病毒株

目的建立一种快速、简便、敏感、实用的方法以检测新城疫病毒致病性毒株。方法在F蛋白裂解位点的两侧设计引物 ,引物1的5'端用生物素标记 ;按Aus/32强毒株F基因裂解区域设计24个碱基的寡核苷酸探针 ,并对之进行5'端地高辛标记。生物素化的双链扩增产物被固相的链霉亲和素捕获后经变性成为生物素化单链。然后微孔中加入地高辛标记的探针进行杂交 ,并用抗 -地高辛 -碱性磷酸酶显色。结果所建立的方法快速、简便、特异 ,敏感性比琼脂糖电泳法高约3～4倍 ,批内CV为9.88 % ,批间CV为18.31%。结论所建立的方法优化PCR条件后可作为新城疫病毒感染诊断。

端粒重复序列扩增法结合微孔板杂交法定量检测端粒酶活性

目的探讨定量检测端粒酶活性的非放射性检测方法。方法将端粒重复序列扩增测定法（ＴＲＡＰ）与微孔板杂交 相结合建立了非放射性检测方法，对３例正常肝组织和４例肝癌患者治疗前后的肝癌组织、瘤旁组织、肝癌凋亡组织 进行检测。结果肝癌组织具有比较高的端粒酶活性，而正常肝组织和瘤旁组织无此酶活性，肝癌凋亡组织端粒酶活性 显著降低。结论 该定量分析方法简单、灵敏、特异性强，可以比较准确地反映组织的端粒酶活性状态。

用微孔板杂交技术检测聚合酶链反应扩增产物

用微孔板杂交技术检测聚合酶链反应(PCR)扩增产物是将PCR技术和类似ELISA的技术结合起来的一种方法,它使PCR的敏感性提高100倍,通过探针杂交使其更具特异性,并可通过酶联检测系统使结果客观化,同时又具有简便、快速的特点,在基础和临床应用上前景看好。

端粒重复扩增-微孔板杂交法检测妇科肿瘤端粒酶活性的研究

目的 :探讨妇科几种常见恶性肿瘤与端粒酶活性的关系。方法 :采用端粒重复扩增 (TRAP)扩增端粒酶产物 ,通过生物素 -亲和素将扩增产物结合于微孔板 ,并与荧光素 (FITC)标记的特异性探针杂交 ,经酶标抗荧光素抗体结合而显色。结果 :妇科恶性肿瘤端粒酶活性检出 2 5例 (89.3% ) ,而肿瘤边缘组织检出 14例 (5 0 .0 % ) ,正常对照组织检出 10例 (35 .7% )。恶性肿瘤端粒酶活性显著高于肿瘤远端组织和正常对照组织 (P<0 .0 5 )。结论 :端粒酶激活可能在妇科恶性肿瘤的发生、发展中起重要作用。 TRAP-微孔板杂交法是检测端粒酶活性灵敏而特异的一种方法。

两种结核杆菌基因扩增杂交方法的比较

聚合酶反应是一种新的体外基因扩增方法，其用于结核杆菌的检测已体现了快速、灵敏、特异的特点，但其在临床应用时，易出现假阴性和假阳性结果，故最近发展趋势是样本处理、基因扩增和产物分析三方面进行改进，其中传统的电泳方法鉴定产物蔽病尤为突出，其改进进展也最快...

微孔板杂交法检测端粒酶活性

目的 利用微孔板反向杂交法对端粒酶重复序列扩增法加以改进 ,建立一种快速、简便、量化的端粒酶活性检测方法。方法 将端粒重复序列扩增法 (TRAP)与微孔板杂交法相结合 ,并采用蜡珠包埋活性酶及引物的方法 ,使TRAP反应单管一次完成。结果 与TRAP法相比 ,该方法检测鼠骨髓瘤细胞株的敏感性为 10个细胞 ,检测肝癌标本为阳性 ,经RNase处理及加热处理的细胞和标本及正常细胞均呈阴性。结论 应用该方法可简便、快速检测端粒酶活性 ,1日内完成并可单人份操作 ,对临床试剂的建立具有一定的参考价值。

检测PCR产物的新途径—非扩增性单链尾引物技术

PCR技术已成为核酸研究和临床实验室获取特异性基因序列的基本工具。随着它在基因诊断领域中的广泛应用,传统上用凝胶电泳分析PCR扩增产物的手段,已难以满是这一技术快速、敏感、特异的检测要求。近年来,许多以固相亲和检测为基础的非凝胶方法相继问世,但这些方法由于是通过固相表面的亲和介质与变性的单链PCR产物结合,再与标记探针杂交来实现检测,变性后扩增产物互补链的复性会由于竞争大大削弱检测探针的敏感性。本文介绍的单链尾引物技术。

人地中海贫血β654基因作为外源基因用于转基因的制备方法

目的探讨人地中海贫血β654基因为外源基因用于转基因小鼠制作时,外源基因的制备方法,为进一步制作转基因小鼠打下基础。方法采用反向点杂交法确诊人地中海贫血β654纯合子DNA,以PCR法扩增获得人地中海贫血β654基因,分离纯化后,通过连接酶反应将其克隆入含βLCR调控序列的基础载体pBGT51质粒中,经PCR扩增、酶切、反向点杂交及DNA测序鉴定重组质粒,用EcoRⅤ酶切获得转基因所用的外源基因。结果将人地中海贫血β654基因作为外源基因克隆入基础载体pBGT51质粒中构建了重组质粒βBGT51,用EcoRV酶切获得含人β654基因及βLCR调控序列的6.5kb的DNA片段,制备了可用于显微注射转基因的外源基因。结论采用该方法构建的含人地中海贫血β654基因的重组质粒,可获得用于显微注射转基因的外源基因。

基因扩增技术中抗污染的研究

目的 了解残留UDG对dU -DNAPCR产物的影响及灭活UDG时对Taq -P的影响。方法 采用微孔板杂交技术检测dU -DNAPCR产物 3 7℃放置 2 0h杂交百分率 ;检测在 -2 0℃、4℃、室温、3 7℃时不同保存条件下的杂交百分率 ;94℃灭活 10min对Taq -P活性的影响。结果 加 0 2单位、1 0单位UDG组比不加UDG组杂交A值下降 13 2 81%～ 2 0 5 5 7%。t检验差异有显著性 (t=2 85 5 ,2 869,P <0 0 5 ) ;经 94℃灭活产物组 3 7℃杂交A值比 -2 0℃A值下降 5 5 47% ,未经 94℃灭活杂交A值下降 10 3 45 % ;94℃预变性 3 0s杂交A值为 98 714 %、10min 3 0s组杂交A值为 96 818%。结论 以上结果提示经 94℃加热灭活对PCR产物保存有重要作用 ,不仅对灭活UDG有作用而且还可灭活来源于UDG以外可破坏DNA的酶。表明含UDG组杂交A值比不加UDG组低13 2 81%～ 2 0 5 5 7%与UDG有关。

用逆转录PCR-核酸探针杂交法对柯萨奇B组病毒分型诊断

目的 建立一种逆转录PCR 核酸探针杂交法对柯萨奇B组病毒 (CVB1～ 6 )进行分型诊断。方法 一对通用PCR引物 ,它能有效扩增所有CVB1～ 6型的特异性DNA片段 ;另选取 6条各型特异性寡核苷酸探针 ,将它们分别共价结合在不同的微孔板上。经过一次PCR扩增 ,扩增后的产物分别与包被有不同探针的微孔板进行杂交检测 ,从而有效鉴别CVB各型。结果 本法与ELISA法的分型比较显示它们具有很好的一致性 ,无错误分型。对 15 2例IgM抗体阳性标本的检测 ,该方法阳性率为 71 7%。结论 本法可准确对CVB进行分型 ,为CVB的临床诊断及流行病学调查提供了一种有效的方法。

RT—PCR—ELISA方法检测甲肝减毒活疫苗病毒滴度的初步研究

目的应用核酸扩增产物测定的固相杂交酶联显色法(RT-PCR-ELISA)检测甲肝减毒活疫苗病毒滴度。方法应用RT-PCR-ELISA，将标记有生物素的寡核苷酸引物所扩增的疫苗病毒基因产物，与微孔反应板上的特异性探针进行快速杂交，通过辣根过氧化物酶标记的链亲和素进行酶联显色，读取吸光度(A值)，判断结果。应用此法检测了11批甲肝活疫苗滴度，并与常规细胞培养法(CCID50）比较。结果本方法与细胞培养法的敏感性相仿，具有简便、快速、特异的优点。结论RTPCR—EUSA法有望代替常规细胞培养法应用于甲肝减毒活疫苗病毒滴度的检测。