荧光定量基因扩增法与萋-尼抗酸染色法检测结核分枝杆菌的比较

目的对荧光定量基因扩增法(FQ-PCR法)和萋-尼抗酸染色法检测结核分枝杆菌的准确性和阳性率进行比较。方法 88例肺结核患者的痰标本,分别用FQ-PCR法和萋-尼抗酸染色法进行检测。对比两种方法的检测结果。结果 FQ-PCR法有55例阳性,检出率为62.5%,萋-尼抗酸染色法检测有20例阳性,检出率为22.7%,明显低于FQ-PCR法。结论在检测结核分枝杆菌的方法中,FQ-PCR法的检出率明显高于萋-尼抗酸染色法的检出率,所以在临床诊疗工作当中,临床医生应该更多选择FQ-PCR法检测结核分枝杆菌,以便在肺结核的早期诊断和早期治疗中发挥更大的作用。

定量分析的体外基因扩增法

定量分析的体外基因扩增法解放军农牧大学刘纯杰综述军事医学科学院生物工程研究所张兆山审校ＰＣＲ技术自１９８５年建立以来，在短短的几年里得到了迅速的发展和广泛的应用，被誉为分子生物发展史上的一个重要里程碑。笔者曾就ＰＣＲ技术的新发展及ＰＣＲ在基因重组与突...

体外基因扩增法检测头颈部肿瘤中人乳头瘤病毒16型DNA

体外基因扩增法检测头颈部肿瘤中人乳头瘤病毒１６型ＤＮＡ刘学锋，赵文先，杨平，李铁军，汪说之，李华伟，杨强人乳头瘤病毒（ＨｕｍａｎＰａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓｅｓ，ＨＰＶ）是一类ＤＮＡ肿瘤病毒。迄今为止，根据核酸杂交和酶谱分析已确定的ＨＰＶ型别达６０余...

婴儿配方乳粉中阪崎克罗诺杆菌解旋酶恒温基因扩增检测方法的建立

目的:建立一种检测婴儿配方乳粉中阪崎克罗诺杆菌的解旋酶恒温基因扩增方法。方法:根据阪崎克罗诺杆菌ITS基因设计特异性引物,优化解旋酶恒温基因扩增法反应条件UvrD helicase、T4 gp32的浓度,人工添加阪崎克罗诺杆菌确定检出限,多种致病菌在建立的解旋酶恒温基因扩增体系中扩增验证特异性,电泳检测扩增产物。结果:解旋酶恒温基因扩增法检测婴儿配方乳粉中阪崎克罗诺杆菌得到与设计序列长度一致的100 bp基因片段,检出限为10 CFU/g,优化反应条件UvrD helicase、T4 gp32的终浓度分别为0.1、5.0μg。结论:解旋酶恒温基因扩增法用于检测婴儿配方乳粉中阪崎克罗诺杆菌的特异性强、灵敏度高、耗时短,为婴儿配方乳粉中阪崎克罗诺杆菌的快速检测提供了新的方法。

一步等位基因特异扩增法检测中国人N-乙酰化酶基因型

目的建立简化的一步等位基因特异扩增法(ASA),研究中国人N-乙酰化酶(NAT2)多态性等位基因的分布。方法用一步法直接检测215名中国健康人NAT2 *5,*6,*7等位基因。结果一步法测定结果与两步法一致。215名健康中国人NAT2 *5,*6,*7 3种突变型等位基因的基因频率分别为3.3％,24.6％和10.0％。基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)。野生型纯合子、杂合子和突变型纯合子分别为85,96和34人,分别占39.5％,44.7％和15.8％。结论一步法测定NAT2基因准确、方便,为临床个体化合理用药提供理论基础。

等位基因特异扩增法研究中国人CYP2D6中速代谢的相关基因

目的 建立CYP2D6 10B的等位基因特异扩增法 (ASA PCR) ,以探讨中国人CYP2D6中速代谢的基因分型。方法 采用两步扩增法得到CYP2D6 10B等位基因特异片段 ,分析健康中国汉族人CYP2D6 10B等位基因 ,并探讨基因分型结果与右美沙芬表型分型结果的相关性。结果 35名表型为极快代谢受试者 (VEMs)中 ,CYP2D6 10B以杂合子 (wt/m)为主占 5 7% ;2 9名中速代谢受试者 (IMs)以突变型纯合子 (m/m)为主占 6 9% ;慢代谢受试者 (PM)基因型为m/m。CYP2D6 10Bm/m组的MR明显大于wt/m组和野生型组 (wt/wt)。结论 ASA PCR法有快速、准确的优点 。

重叠区扩增基因拼接法在构建膜锚定金黄色葡萄球菌肠毒素A融合基因上的应用

目的 :将超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素 A(SEA)基因与人胎盘碱性磷酸酶 (h PL AP- 1) C末端信号肽序列进行拼接 ,形成融合基因。方法 :利用重叠区扩增基因拼接法 ,分别扩增 h PLAP- 1C末端信号肽序列和 SEA基因序列。然后 ,将二段基因拼接并与 p GEM- T克隆载体连接 ,酶切和测序鉴定。结果 :成功扩增出 h PLAP- 1C末端信号肽序列 131bp和 SEA基因序列 796 bp;经测序证实 ,二段基因序列成功拼接 (90 1bp)。结论 :重叠区扩增基因拼接法能将 SEA基因与 h PL AP- 1C末端信号肽序列拼接 ,形成融合基因。

重叠区扩增基因拼接法在构建膜锚定共刺激分子融合基因上的应用

目的 将小鼠共刺激分子 B7- 1(m B7- 1)基因的胞外区与人胎盘碱性磷酸酶 (h PL AP- 1) C末端信号肽序列进行拼接 ,探讨其形成融合基因的作用。方法 利用重叠区扩增基因拼接法 ,分别扩增 h PL AP- 1C末端信号肽序列和 m B7- 1基因的胞外区序列 ,然后将二段基因拼接起来 ,拼接后与 p GEM- T克隆载体连接 ,酶切和测序鉴定。结果 分别成功扩增出 h PL AP- 1C末端信号肽序列 15 5 bp和 m B7- 1基因的胞外区序列 76 4 bp,并将二段基因序列成功拼接 (891bp) ,经测序是正确的。结论 重叠区扩增基因拼接法能拼接 m B7- 1基因的胞外区与 h PL AP-1C末端信号肽序列 。

酸乳中葡糖醋杆菌赖解旋酶恒温基因扩增检测方法的建立

建立酸乳中葡糖醋杆菌的赖解旋酶恒温基因扩增(helicase-dependent isothermal DNA amplification,HDA)检测方法。根据葡糖醋杆菌16S基因序列(基因号为HQ677466.1)设计特异性引物,并优化反应体系中UvrD解旋酶和T4 gp32的浓度。通过HDA法直接检测酸乳中的葡糖醋杆菌,并确定其检出限,在建立的HDA体系中对酸乳中多种菌株进行扩增和电泳检测,验证方法的特异性。结果表明:用HDA法检测酸乳中葡糖醋杆菌,得到了与设计序列长度(101 bp)一致的基因片段,检出限为102 CFU/g,反应体系中UvrD解旋酶和T4 gp32的适宜添加量分别为0.1μg和5.0μg。该方法用于检测酸乳中葡糖醋杆菌的灵敏度高、耗时短。

发酵乳中沙门氏菌依赖解旋酶恒温基因扩增快速检测方法的建立

建立依赖解旋酶恒温基因扩增(helicase-dependent isothermal DNA amplification,HDA)快速检测发酵乳中沙门氏菌方法。以沙门氏菌invA基因序列为目的基因,设计特异性引物,优化反应体系中UvrD解旋酶及T4 gp32添加量,建立最优反应体系。通过HDA方法直接检测发酵乳中沙门氏菌,扩增其产物后进行电泳检测,验证方法特异性。结果表明:采用HDA快速检测法检测发酵乳中沙门氏菌特异性良好,优化后反应体系体积50μL时,UvrD解旋酶添加量为0.10μg,T4 gp32添加量为5.0μg,得到与设计序列长度(304 bp)一致的扩增产物,检出限为2.6×10^(2) CFU/g;该方法用于快速检测发酵乳中沙门氏菌能够满足检测需求,具有较高的灵敏度、易操作,可作为一种基础且快速的方法检测发酵乳中沙门氏菌。

快速检测发酵乳中葡萄糖杆菌的赖解旋酶恒温基因扩增方法的建立

建立赖解旋酶恒温基因扩增(helicase-dependent isothermal DNA amplification,HDA)快速检测发酵乳中葡萄糖杆菌的方法。选择葡萄糖杆菌ITS基因序列(基因号为KF896260.1)为目的基因,设计特异性引物,并优化反应体系中UvrD解旋酶和T4 gp32的添加量,建立最优反应体系。采用建立的HDA体系对多种菌株进行扩增和电泳检测,验证方法特异性,通过HDA法直接检测发酵乳中的葡萄糖杆菌,并确定其检出限。结果表明:采用HDA法检测发酵乳中葡萄糖杆菌,反应体系中UvrD解旋酶和T4 gp32的适宜添加量分别为0.10μg和5.0μg,扩增产物与设计序列长度(309 bp)一致,特异性良好,检出限为4.3×10^1 CFU/g。该方法用于检测发酵乳中葡萄糖杆菌的灵敏度高、耗时短。

PCR法及环介导等温扩增法筛查食源微生物的耐药基因

耐药基因可通过垂直传播和水平传播等途径在微生物的种内和种间进行传递,食用受到耐药菌污染的食品,具有威胁人类健康的潜在可能。为建立耐药基因快速检测方法并应用于食源性微生物耐药基因的筛查,对食源性耐药菌在食品中的存在状况、耐药种类进行了探讨。采集了3个不同菜市场的9份食品样本,对食源菌进行了分离培养,使用四环素、链霉素、红霉素、氯霉素、甲氧苄胺嘧啶进行抗性菌筛选,并利用聚合酶链式反应(PCR)技术及环介导等温扩增(LAMP)法对8种抗性基因进行筛查,同时用实时荧光定量技术对结果进行了验证。9份食品样本中,菌落总数在105CFU/g至107CFU/g。红霉素抗性的菌落数最多,除1份样本外均在105CFU/g以上;氯霉素抗性菌菌落数最低,除1份样本之外均在103CFU/g以下。在对8种耐药基因筛查时发现,在四环素抗性菌中耐药基因tetA阳性率最高,为75.56%。采用LAMP法筛查耐药基因,阳性率高于PCR法。结果表明,具有抗药性的食源菌在样本中大量存在,这提示食品可以作为抗性菌存在和传播的重要介质。而LAMP作为一种简单、快速的基因检测技术可以用于耐药基因的快速筛查,为了解抗性菌在食品加工环境的污染和分布情况,以及消杀防控措施的采取和评估提供了基础信息。

等位基因特异扩增法检测移植患者多药耐药基因多态性

目的:建立等位基因特异扩增法(Allele-Specific Amplification,ASA-PCR)研究移植患者多药耐药基因(multi-drug re- sistance gene,MDR1)多态性。方法:用ASA-PCR对177位肝、肾移植患者的MDR1第26外显子C3435T、第21外显子G2677T/A位点和第12外显子C1236T位点进行基因分型。结果:ASA-PCR测定结果与聚合酶链式反应-限制性片断长度多态性方法(Polymerase chain reaction-Restriction Fragment Analysis,PCR-RFLP)的测定结果一致。177例移植患者DNA标本中,C3435T:CC型69例(39.0%),CT型92例(52.0%),TT型16例(9.0%);G2677T/A:GG型39例(22.0%),GT型48例(27.1%),TT型32例(18.1%),GA型30例(16.9%),AT型24例(13.6%),AA型4例(2.3%);C1236T:CC型23例(13.0%),CT型88例(49.7%),TT型66例(37.3%)。结论:采用ASA-PCR检测移植患者MDR1多态性准确、方便,可为临床个体化用药提供理论依据。

应用PCR基因扩增法检测孕妇滋养细胞中沙眼衣原体感染研究

目的研究应用PCR基因扩增法检测孕妇滋养细胞中沙眼衣原体感染的检测效果.方法选择我院2019年1月~2019年12月期间收治的130例孕妇作为本次研究对象,对孕妇的宫颈内口冲洗法对获取的滋养细胞进行PCR基因扩增法检测,重点检测孕妇的沙眼衣原体感染情况,分析不同孕期产妇的阳性率、孕妇年龄和产次与沙眼衣原体感染的关系.结果孕早期、孕中期以及孕晚期孕妇的沙眼衣原体检测阳性率存在明显差异(P<0.05),而孕妇的产次、年龄则与沙眼衣原体阳性率检测阳性率无明显差异(P﹥0.05).结论采用PCR基因扩增法对孕妇滋养细胞中沙眼衣原体感染进行检测,可以有效的提高检测结果的准确性,而且还具有操作简便、快速以及特异性强等多个优点,临床应用价值与效果显著,所以,应该将该检测方法广泛推广于临床应用.

乙型肝炎病毒全基因组扩增方法研究进展

HBV基因全长 PCR扩增为 HBV基因结构的多样性与致病性和传播途径等关系的研究提供了全新的技术 ,在 HBV研究中已显示了巨大优越性。本文对该方法的几个主要技术问题研究进展作了简要综述。

重叠区扩增基因拼接法拼接hIL-2信号肽基因和CVB3的VP1基因

目的 :将 h IL- 2信号肽基因拼接到 CVB3VP1基因的 5′端 ,以获得分泌型 VP1 (s VP1 )基因。方法 :采用重叠区扩增基因拼接法。结果 :凝胶电泳见到预期大小 DNA条带 ,经测序表明基因序列与报导的 h IL- 2信号肽及 CVB3VP1的基因序列一致。结论 :成功获得了融合基因 s

基因扩增产物微孔杂交法检测新城疫病毒致病毒株

目的建立一种快速、简便、敏感、实用的方法以检测新城疫病毒致病性毒株。方法在F蛋白裂解位点的两侧设计引物 ,引物1的5'端用生物素标记 ;按Aus/32强毒株F基因裂解区域设计24个碱基的寡核苷酸探针 ,并对之进行5'端地高辛标记。生物素化的双链扩增产物被固相的链霉亲和素捕获后经变性成为生物素化单链。然后微孔中加入地高辛标记的探针进行杂交 ,并用抗 -地高辛 -碱性磷酸酶显色。结果所建立的方法快速、简便、特异 ,敏感性比琼脂糖电泳法高约3～4倍 ,批内CV为9.88 % ,批间CV为18.31%。结论所建立的方法优化PCR条件后可作为新城疫病毒感染诊断。

鳜胰蛋白酶基因外显子3上SNP G169A位点鉴定和四种不同检测方法的比较

采用PCR产物直接测序法(DS)对鳜(Siniperca chuatsi)胰蛋白酶基因(TRY)进行单核苷酸多态性(SNPs)分析,发现外显子3上的G169A多态性。对312个样品进行分析,共发现三种基因型GG、GA、AA,其基因型频率分别为0.26、0.54、0.20,两个等位基因G和A的基因频率分别为0.53和0.47。用创造限制性酶切位点法PCR(CRS-PCR)、单管双向等位基因专一性扩增(SB-ASA)和单链构象多态性分析(PCR-SSCP)对该SNP位点进行验证。结果表明,CRS-PCR法不能对该SNP位点分型,PCR-SSCP和SB-ASA法可以且准确度分别为100%和96.67%。

C型乙型肝炎病毒基因SOEing法引入228位点突变

目的为获取乙型肝炎病毒(HBV)基因分型芯片病毒靶序列,对C型HBV第228位碱基进行点突变。方法通过不同基因型HBV全基因组的序列比对分析,显示基因型A,C,D,G在228位上的碱基为G,而基因型B,E,F,H为A,所以检测该位点的碱基类型可以实现HBV基因型的初步分型。结果将C型乙肝病毒第228位上的单位碱基由G突变为A,经测序后证明突变成功。结论重叠区扩增基因拼接法(SOEing)是一种简便引入点突变的方法,可以应用此法制备HBV基因分型芯片检测基因片段序列。

SOE-PCR法检测PRRSV ORF5缺失跨膜区的融合蛋白基因片段的研究

PRRSV为有囊膜的单股正链RNA病毒，含有8个开放阅读框（open reading frames，ORFs），其中ORF5—7分别编码PRRSV主要的结构蛋白：糖基化囊膜蛋白（E）、膜蛋白（M）和核衣壳蛋白（N）。糖基化囊膜蛋白（E）又称GP5蛋白，具有良好的抗原性和免疫原性，分子质量约为25ku。重叠延伸PCR技术简称SOE—PCR，又称重叠区扩增基因拼接法、交错延伸剪接PCR技术或套叠PCR技术。此技术利用PCR技术在体外进行有效的基因重组和定点突变，而且不需要内切酶消化和连接酶处理。研究在分析了GP5蛋白跨膜区之后，采用SOE—PCR的方法将跨膜区基因缺失，对GP5蛋白编码跨膜区外的基因片段进行了克隆，旨在为获得高表达、高活性的基因产物打下基础。