非洲马瘟病毒VP7基因拼接、表达及重组ELISA方法的建立与初步应用

采用人工拼接的方式拼接了非洲马瘟病毒(AHSV)含有绝大多数线性抗原表位的VP7编码基因片段,克隆于pET-30a构建重组质粒pET-30a-VP7,将pET-30a-VP7转化BL21(DE3),经1.0 mmol/L IPTG诱导,外源基因以包涵体的形式获得高效表达。通过Dot-ELISA以及ELISA试验证明表达产物具有良好的反应原性。以纯化后表达产物作为诊断抗原包被酶标板建立了检测AHSV抗体的间接ELISA方法。结果表明,抗原的最佳包被浓度为0.25μg/mL,血清的最佳稀释度为1∶40,待检血清阳性临界值初步定为0.25。用此方法和商品化ELISA试剂盒检测了184份血清样品,结果完全符合。

重叠区扩增基因拼接法在构建膜锚定金黄色葡萄球菌肠毒素A融合基因上的应用

目的 :将超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素 A(SEA)基因与人胎盘碱性磷酸酶 (h PL AP- 1) C末端信号肽序列进行拼接 ,形成融合基因。方法 :利用重叠区扩增基因拼接法 ,分别扩增 h PLAP- 1C末端信号肽序列和 SEA基因序列。然后 ,将二段基因拼接并与 p GEM- T克隆载体连接 ,酶切和测序鉴定。结果 :成功扩增出 h PLAP- 1C末端信号肽序列 131bp和 SEA基因序列 796 bp;经测序证实 ,二段基因序列成功拼接 (90 1bp)。结论 :重叠区扩增基因拼接法能将 SEA基因与 h PL AP- 1C末端信号肽序列拼接 ,形成融合基因。

重叠区扩增基因拼接法在构建膜锚定共刺激分子融合基因上的应用

目的 将小鼠共刺激分子 B7- 1(m B7- 1)基因的胞外区与人胎盘碱性磷酸酶 (h PL AP- 1) C末端信号肽序列进行拼接 ,探讨其形成融合基因的作用。方法 利用重叠区扩增基因拼接法 ,分别扩增 h PL AP- 1C末端信号肽序列和 m B7- 1基因的胞外区序列 ,然后将二段基因拼接起来 ,拼接后与 p GEM- T克隆载体连接 ,酶切和测序鉴定。结果 分别成功扩增出 h PL AP- 1C末端信号肽序列 15 5 bp和 m B7- 1基因的胞外区序列 76 4 bp,并将二段基因序列成功拼接 (891bp) ,经测序是正确的。结论 重叠区扩增基因拼接法能拼接 m B7- 1基因的胞外区与 h PL AP-1C末端信号肽序列 。

采用基因拼接方法构建人源特异性抗乙型肝炎病毒表面抗原Fab噬菌体抗体库

目的 构建人源特异性抗乙型肝炎病毒表面抗原Fab噬菌体抗体库。方法 从抗乙型肝炎病毒表面抗体高滴度 (1:10 2 4 )的人全血中分离外周血单个核细胞 (PBMC) ,经RT PCR分别扩增出轻链可变区和重链可变区 ,再以噬菌体质粒为模板分别扩增出轻链恒定区 (Cκ)和重链恒定区 (CH1) ,将轻链可变区和轻链恒定区 (Cκ)及重链可变区和重链恒定区 (CH1)进行第 1次基因拼接 ,分别形成κ轻链和Fd重链 ,再以κ轻链和Fd重链作为模板进行第 2次基因拼接 ,形成完整的Fab基因 ,与pComb3H SS噬菌体质粒连接后 ,电穿孔转化大肠杆菌XL1 Blue。结果 通过多次电穿孔转化 ,获得总容量为 4× 10 5库容的噬菌体抗体库。

血浆表达CD44分子几种基因拼接体的临床诊断价值

探讨血浆中可溶性 CD44标准型、v6和 v7- v8变构体的表达水平与四类肺癌的发生和转移的关系。方法 :用我们自己建立的通用免疫杂交法定量测定 5 9例肺癌患者血浆 s CD44 S、s CD44 v6、s CD44 v7- v8的含量。结果 :原发性肺癌 (5 2例 )和转移性肺癌 (7例 )的 s CD44 v6表达水平明显高于正常对照组 (P<0 .0 0 1)和肺慢性炎症对照组 (P<0 .0 5 ) ;原发性未转移组 (2 2例 )与原发性转移组 (30例 )比较 ,差异不显著 (P>0 .0 5 )。未转移组鳞癌的 s CD44 S检测水平低于正常水平 (P<0 .0 5 ) ,与肺泡癌比较差异有显著性 (P<0 .0 5 )。四类肺癌组 s CD44 v6均极显著高于正常组 ,肺泡癌与小细胞癌比较差异有显著性 (P<0 .0 5 )。s CD44 v7- v8在肺癌中无特别意义。结论 :s CD44 v6与肺癌的恶性增殖和转移密切相关 ,s CD44 v6可作为肺癌的早期诊断 ,疗效评价 ,转移和复发的监测指标。

同源基因拼接技术在酶体外进化中的应用

同源基因拼接技术是一种全新概念的酶人工定向进化策略。本文在介绍这一技术基本概念的基础上,主要对该技术的两个关键环节:突变体基因库的构建以及高通量的重组子筛选手段进行详细论述。最后对该技术在酶改性中的应用研究进展进行综述,并对其发展前景及存在问题进行评述。

重叠区扩增基因拼接法拼接hIL-2信号肽基因和CVB3的VP1基因

目的 :将 h IL- 2信号肽基因拼接到 CVB3VP1基因的 5′端 ,以获得分泌型 VP1 (s VP1 )基因。方法 :采用重叠区扩增基因拼接法。结果 :凝胶电泳见到预期大小 DNA条带 ,经测序表明基因序列与报导的 h IL- 2信号肽及 CVB3VP1的基因序列一致。结论 :成功获得了融合基因 s

基因拼接技术为农业发展开辟新纪元——实验表明一些新的作物可能导致农业革命

根据前不久宣布的“突破”来看,基因拼接技术可能会给农业带来自人们开始培育农作物和牲畜以来的最佳福音。当然从目前在实验室里见到的令人鼓舞的发展趋势看,要在农田上产生巨大推动力,可能还需要许多年。 据报道,有一种称之为“向日豆”(Sunbean)的作物。

云斑白条天牛COI基因拼接方法及序列比较的实验设计

以云斑白条天牛雌成虫细胞色素氧化酶亚基I基因(COI)为实验对象,利用DNAStar软件的Seq Man对云斑白条天牛CO I的abl和seq 2种不同格式测序文件进行拼接,详细介绍基因序列的拼接方法,并对2种文件的拼接过程进行了比较。经比对,验证了abl文件拼接序列碱基准确性大于seq文件拼接序列,但碱基长度小于seq文件的拼接结果。该实验结合地域特色具有较高的实用性,实验过程简单易行,为其他基因相关研究性实验提供基础,对提高大学生的综合实践和创新能力有重要作用。

基因拼接导致人猿差异

人类和黑猩猩在基因组成上有99%的相似,但两者在行为、思考方式和抗病能力等方面却存在着千差万别。最近,研究人员对造成这种差异的原因有了新的解释。

利用套叠PCR技术进行基因突变和拼接

利用套叠 PCR技术 (又称重叠区扩增基因拼接法 )对 h GM-CSF基因内第 2 8位氨基酸处的糖基化位点进行突变和进行人促性腺激素基因、腺苷酸激酶短肽与胰岛素样生长因子 -I基因三者之间的拼接 ,结果表明采用该技术能在体外实行有效的基因重组和定点突变 ,其成功率为 1 0 0 % ;这一技术不需要内切酶消化和连接酶处理 ,技术操作简单易行 ,在基因拼接。

体外拼接破伤风毒素C片段基因

目的以破伤风毒素C片段(TETC)基因为例,探讨区段基因拼接方法。方法根据已知的TETC基因序列(GenBank登记号M12739,367-1719),结合乳链菌氨基酸密码子的基因编码情况,设计适于在乳链菌内表达的TETC基因序列,为进一步克隆,根据同义突变的原理消除序列中的EcoRI和KpnI的酶切位点,在TETC基因的5′端加上SalI酶切位点,3′端加上XhoI和HindⅢ酶切位点,序列全长1383bp。将其中1380bp的片段使用DNAstar6.0设计为68条长40bp的寡核苷酸TETC_1-TETC_68,设计TETC_69作为下游引物。分3个区段分别拼接TETC_1-24、TETC_23-46、TETC_45-68,随后分别以TETC_1、TETC_69为上下游引物,进行TETC全长基因的拼接,将获得的TETC基因经SalI和HindⅢ双酶切后连接到经相同双酶切的p BluescriptⅡSK(+),得到的阳性克隆经测序鉴定。结果分别拼接出大小约500bp的TETC_1-24、TETC_23-46、TETC_45-68,等浓度的3个区段混合后,拼接出了全长为1383bpTETC基因,目的基因连接到载体后测序与设计的TETC基因完全一致。结论区段基因拼接法采用分段拼接的方法先拼接出全长基因的组成部分,随后进行全长基因拼接,更适合长基因片段的体外拼接。

“端粒到端粒”人类参考基因组:精准医学时代的新起点

DNA测序技术的飞速发展使人类基因组学研究迈进“端粒到端粒(T2T)时代”。这个时代的核心标志是实现每一个人类染色体分子——从端粒到端粒——高质量、高完整度的连续线性组装,成为精准医学质量控制的金标准,从而准确和稳定地识别个体变异信息。越来越多个体基因组的完整组装为我们揭示远高于预期的人类基因组差异,也为各人群采用自己的近缘参考基因组进行变异分析提供了关键的理论依据。近缘参考基因组可以更准确地识别和定位个体的基因变异,而准确的变异数据是精准医学中变异与表型关联研究的关键数据基础。这种以人群为单位的基因组分析和研究新范式,必将显著影响国际和国内未来精准医学发展的格局。

人白细胞介素12两个亚基基因p35、p40拼接的新方法

目的:探讨人白细胞介素12(IL-12)两个亚基基因通过连接肽基因进行拼接的新方法。为进一步研究IL-12基因的生物学功能以及应用提供实验基础。方法:采用两个牛弹性蛋白基序(10个氨基酸)的基因序列为两个亚基基因拼接的连接肽基因。根据人IL-12p35、p40两个亚基基因片段以及连接肽基因核苷酸序列设计引物,其中p40基因下游引物包括部分连接肽基因序列以及KpnⅠ酶切位点,p35基因上游引物包括部分连接肽基因序列以及KpnⅠ酶切位点。通过聚合酶链反应(PCR)方法分别获得人IL-12p35与p40基因片段。利用KpnⅠ内切酶对p35与p40基因的PCR产物进行酶切,酶切产物回收后利用T4DNA连接酶进行连接,应用p40基因上游引物与p35基因下游引物对连接产物进行PCR扩增。利用KpnⅠ内切酶对连接产物进行酶切鉴定。将扩增的连接产物克隆入T载体,挑选阳性克隆并进行酶切鉴定,酶切鉴定正确的克隆进行拼接产物的核苷酸序列测序。结果:通过PCR分别获得约1000bp大小的p40基因片段与600bp大小的p35基因片段,两个基因酶切片段连接后PCR扩增获得1600bp左右的拼接产物,采用KpnI内切酶对拼接产物进行酶切后获得约1000和600bp大小的基因片段,分别与p40和p35基因片段大小一致。拼接产物的T载体经酶切鉴定可见1600bp大小的酶切产物,拼接产物测序结果与GenBank核酸数据库上的p40基因、p35基因以及连接肽基因核苷酸序列完全一致。结论:利用该基因分子拼接技术成功地将人白介素12两个亚基基因通过连接肽基因进行拼接。建立了一种简单、方便、有效进行人白细胞介素12两个亚基基因拼接的新方法,为进一步研究IL-12的生物学功能以及基因治疗提供实验基础。

TRADD基因外显子的拼接及重组腺病毒的构建

目的构建含有人TRADD基因片段的重组腺病毒载体。方法从人肝组织中提取总RNA,逆转录得到cDNA。按照TRADD基因4个外显子的基因序列设计引物,分别扩增得到4个外显子的基因片段。对4个外显子进行基因拼接,得到全长的TRADD片段。利用AdEasy系统构建TRADD重组腺病毒,测定病毒滴度,并转染成纤维细胞。结果拼接成功939kb的TRADD基因,行PCR扩增重组腺病毒中TRADD基因,在略小于1000kb处见到明显的TRADD条带。结论构建成功的含有TRADD基因片段的重组腺病毒,可用于转染人成纤维细胞,用于检测TRADD对病理性瘢痕成纤维细胞的影响。

用改进的重叠区扩增基因拼接法构建中间缺失突变体

目的 构建缺失第 32 5～ 373位氨基酸密码子的磷脂酸磷酸化激酶β(phosphatidylinositol 4 - kinase beta,PI4 K-β)基因 ,以探索一种简便的构建中间缺失突变体的方法。 方法 应用重叠区扩增基因拼接法的原理 ,在拼接延伸后 ,再进行一次 PCR扩增 ,得到缺失第 32 5～ 373位氨基酸密码子的 PI4 K- β基因 ,克隆至 p CMV- Tag4 A真核表达载体。 结果 成功地构建出缺失第 32 5～ 373位氨基酸密码子的 PI4 K- β突变体。 结论 这种改进的重叠区扩增基因拼接法可以有效而可靠地构建中间缺失突变体 ,具有推广价值。

马槟榔甜蛋白基因(MBLⅡ)的拼接与表达载体的构建

从云南植物Capparismasaikai中提取总DNA,设计引物克隆马槟榔甜蛋白基因MBLⅡ,序列测定后经同源性分析表明与GeneBank中登陆的马槟榔甜蛋白基因MBLⅡ(cDNA)序列一致,表明MBLⅡ不存在内含子序列。利用重叠区扩增基因拼接法(genesplicingbyoverlapextension,geneSOEing)进行体外基因剪接,剪接片段与植物表达载体pVKH相连,构建pVKH-35S-MBLⅡ-Pa、pVKH-35S-S-A+B-pA、pVKH-35S-A+B-pA、pVKH-35S-S-A-pA、pVKH-35S-S-B-pA,为寻找mabinlin的活性表达形式和翻译后剪接机制打下基础。

基因拼接型蜡状芽孢杆菌ZY12磷脂酶D的异源表达及转酯活性的研究

磷脂酶D是一类酯键水解酶,能够水解磷脂生成磷脂酸,并在某些羟基化合物存在的条件下,通过脱水缩合生成新型磷脂。利用磷脂酶D生成新型磷脂的活性,通过生物转化可以制备稀有磷脂如磷酯酰丝氨酸等。因此,磷脂酶D在食品及医疗领域应用潜力巨大。实验室前期发现的蜡状芽孢杆菌ZY12来源新型磷脂酶D具有水解活性,但检测不到转酯活性,将其与链霉菌PMF来源磷脂酶D进行基因拼接,通过pET-30b重组质粒在大肠杆菌BL21(Lyss)中异源表达。实验结果表明,通过基因拼接手段对蜡状芽孢杆菌ZY12磷脂酶D的改造,使该磷脂酶D获得转酯活性。在诱导温度为16 ℃、IPTG添加量0.5 mmol/L、诱导时间12 h,可溶性拼接型磷脂酶D活性最高87 mU/mL。转酯反应温度为45 ℃、pH为4.5、反应时间3 h,生成磷酯酰丝氨酸产量最高7.1 mg/L。

SOE和SDL——巧妙拼接基因的新方法

PCR技术(多聚酶链式反应)是现代分子生物学的一个巨大突破,它能在体外迅速、大量、灵敏地扩增基因片段。可是,经PCR技术扩增的大量相关基因片段如何能有效拼接,却是一个很值得探讨的问题。