基因捕获技术

基因捕获技术是一种产生大规模基因突变的便利手段,对于揭示大量基因序列所对应的基因功能具有重要应用价值。本文综述了基因捕获技术的基本原理和研究方法、发展现状及远景。

基因捕获筛选TGF-β1诱导间充质干细胞C3H／10T1／2平滑肌分化的差异表达基因

目的利用基因捕获方法,分离转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)诱导小鼠胚胎间充质干细胞C3H/10T1/2(简称10T1/2细胞)平滑肌分化前后差异表达基因。方法 5 ng/mL TGF-β1诱导10T1/2细胞平滑肌分化,倒置显微镜下观察细胞形态学改变,RT-PCR鉴定平滑肌分化相关基因alpha平滑肌肌动蛋白(alpha smooth muscle actin,αSMA)、平滑肌22 alpha(smooth muscle 22 alpha,SM22α)、平滑肌肌球蛋白重链(smooth muscle myosin heavy chain,SM-MHC)和血清应答因子(serum response factor,SRF),免疫细胞化学实验检测αSMA。TGF-β1诱导建立的10T1/2细胞基因捕获阳性克隆库分化前后进行LacZ染色。cDNA末端快速扩增法(rapid amplification of cDNA ends,RACE)及电子克隆分离差异表达序列,在GenBank网站nBLAST进行生物信息学分析,用GenBank网站在线软件BankIt提交GenBank获取ID号,用pI/Mw软件计算蛋白分子量、等电点。Real-time PCR检测新基因mgt-16在BALB/c小鼠小肠、骨骼肌及心肌的表达。结果细胞形态学、RT-PCR及免疫细胞化学实验鉴定TGF-β1成功诱导10T1/2细胞平滑肌分化。LacZ染色筛选获得2个平滑肌分化后差异表达克隆。RACE、电子克隆和nBLAST分析后发现为线粒体核糖体蛋白S6(mitochondrial ribosomal protein S6,Mrps6)和新基因mgt-16。mgt-16基因位于19号染色体,编码一个93个氨基酸的蛋白(命名为mgt-16),相对分子质量为9 772.02,等电点为6.04,提交后ID号为GU266552。新基因mgt-16在BALB/c小鼠小肠表达较高,而在骨骼肌、心肌表达较低。结论利用基因捕获分离获得了TGF-β1诱导平滑肌分化前后2个差异表达基因:Mrps6和新基因mgt-16。

用无终止子的RFP报告基因捕获水稻终止子研究

基因捕获技术已被广泛应用于植物功能基因组学研究。文章构建了水稻PolyA捕获载体pLJ19,该载体含有用于检测转化事件的绿色荧光蛋白报告基因(GFP)及用于进行PolyA捕获的无终止子的红色荧光蛋白报告基因(RFP),在水稻转化愈伤组织阶段筛选同时含有GFP及RFP的转化愈伤组织并进行RFP插入位点T-DNA侧翼序列(FST)分析可获得水稻终止子序列。将pLJ19转化粳稻品种‘日本晴’的胚性愈伤组织,获得了17个具有PolyA捕获事件的愈伤组织。FST序列分析表明6个T-DNA插入在水稻基因组序列中,其中有5个T-DNA插入在水稻基因3’端附近。结果表明,pLJ19载体可用于水稻终止子捕获研究中,可为水稻终止子研究提供研究方法和材料。

多用途基因捕获C3H/10T1/2细胞阳性克隆库的构建及鉴定

目的：以10T1／2细胞为间充质干细胞模型，构建用于间充质干细胞分化及恶性转化分子机制等研究的基因捕获阳性克隆库．方法：Dra I线性化逆转录病毒基因捕获载体ROSAFARY后，与pIRES2-EGFP用脂质体共转染phoenix细胞，LacZ染色证明转染成功后收集病毒上清感染10T1／2细胞．经潮霉素筛选获得阳性克隆，为排除假阳性克隆用LacZ部分片段PCR进行鉴定．结果：ROSAFARY脂质体转染phoenix细胞后48h，GFP指示的转染效率约为20％～30％，LacZ染色有大约10％的阳性率．150mg／L潮霉素筛选病毒感染的10T1／2细胞，挑取药物抗性克隆，PCR鉴定后获得43个阳性克隆，LacZ染色5个为捕获基因高表达细胞克隆．结论：基因捕获技术建立非胚胎干细胞的克隆是可行的，成功建立的基因捕获阳性克隆库为应用基因捕获技术揭示成体干细胞分化及恶性转化分子机制奠定了基础．

利用目标基因捕获结合二代测序技术发现左心室心肌致密化不全MYBPC3基因错义突变

目的:建立目标基因捕获结合第二代测序技术,对孤立性左心室心肌致密化不全(IVNC)患者的已知致病基因MYBPC3进行突变筛查。方法:收集5例IVNC患者及一级亲属的超声影像学资料,并提取外周血全基因组DNA,设计MYBPC3外显子区域特异性捕获探针,与基因组DNA文库进行杂交,富集目标基因组区域DNA片段,利用二代测序技术,确定突变位点,并使用Sanger测序法在其一代亲属中验证。结果:目标基因特异性捕获探针可有效地捕捉并富集基因组DNA目标靶片段。在5例IVNC患者中,发现1例MYBPC3基因杂合非同义突变c.G1000A(p.E334K),该突变位于MYBPC3基因第13外显子中,测序深度249.65。经过数据分析与Sanger测序验证后,父亲发现此突变位点,母亲未发现提示突变的父亲的遗传。结论:本研究所建立的Gen Cap目标基因捕获测序技术结合二代测序技术成功发现了MYBPC3基因突变。

目标基因捕获测序技术检测肺动脉高压致病基因突变的研究

目的:利用目标基因捕获测序技术,对9例肺动脉高压(PAH)患者进行4个已知致病基因突变筛查,探讨利用目标基因捕获测序技术对PAH进行基因诊断的可行性。方法:抽取PAH患者外周血,提取全基因组DNA,制备文库。设计骨形成蛋白2型受体(BMPR2)、激活素受体样激酶1(ACVR1)、细胞内皮糖蛋白(En G),信号蛋白SMAD4基因(SMAD4)外显子区域特异性捕获探计,利用目标基因捕获技术,进行杂交,富集目标基因组区域的DNA片段,利用Illumina Hi Seq 2000进行高通量测序,分析致病基因突变与PAH的相关性。结果:9例患者中,2例患者发现BMPR2基因突变,1例发现ACVRL1突变,BMPR2突变临床症状较重,ACVRL1突变发病年龄较小。结论:本研究利用目标基因捕获测序技术,在9例PAH患者中查出3个致病基因突变。该方法快速有效,可实现对PAH致病基因突变的初步筛查,对PAH的临床基因诊断具有重要价值。

基因捕获成体干细胞及鉴定的初步研究

目的探讨基因捕获技术应用于成体干细胞的可行性。方法线性化逆转录病毒基因捕获载体ROSAFARY,利用Lipofectamine2000转染包装细胞PA317,LacZ染色证明转染效率后,收集病毒上清,感染种植于24孔板的小鼠成肌干细胞系C2C12、人骨髓间充质干细胞(hBMSC)。为排除潮霉素B筛选的假阳性干细胞,以C2C12、hBMSC细胞基因组DNA为模板,PCR扩增ROSAFARY上LacZ部分序列(560 bp)进行鉴定。结果ROSAFARY脂质体转染PA317细胞后LacZ染色,400倍镜下可见2-5个蓝色细胞/视野。病毒上清感染种植于24孔板的C2C12和hBMSC,4 d后经LacZ染色,C2C12可见6个蓝色细胞/孔,400倍镜下hBMSC可见4-5个蓝色细胞/视野。最佳PCR鉴定参数为基因组模板量2μg,退火温度55.5℃,Mg2+浓度3 mmol/L。结论逆转录病毒基因捕获载体感染多种成体干细胞后LacZ染色显示可成功捕获激活状态启动子驱动的基因,为基因捕获应用于成体干细胞分化及恶性转化分子机制的研究奠定了基础。

目标基因捕获结合第2代测序技术检测原发性高血压致病基因突变

目的建立目标基因捕获结合第2代测序技术,对原发性高血压（EH）患者的13个已知致病基因进行突变筛查,探讨EH与致病基因突变的关系。方法提取5例EH患者外周血全基因组DNA,利用GenCap目标基因捕获技术,设计内皮素转化酶1（ECE1）、G蛋白调节信号5（RGS5）、钠钾三磷腺苷酶通道β1多肽（ATP1β1）、选择素E（SELE）、血管紧张素原（AGT）、血管紧张素受体1（AGTR1）、α-内收蛋白（ADD1）、细胞色素P450 3A亚家族多肽5（CYP3A5）、一氧化氮合酶3（NOS3）、鸟嘌呤核苷酸结合蛋白β3（GNβ3）、一氧化氮合酶2A（NOS2A）、苯基乙醇胺N-甲基转移酶（PNMT）和前列腺素I2合成酶（PTGIS）基因外显子区域特异性捕获探针,与基因组DNA文库进行杂交,将目标基因组区域的DNA片段进行富集后,再利用Illumina HiSeq 2000第2代测序仪进行测序,通过数据分析,确定突变位点,对选定的突变位点用Sanger测序法验证。结果设计合成的目标基因特异性捕获探针可有效捕捉并富集基因组DNA的目标靶片段。目标区域平均测序深度为301.12~431.92,99.30%~99.70%目标区域覆盖度。5例患者中ADD1基因发现3个错义突变;AGT基因发现1个错义突变;SELE基因发现2个错义突变;PNMT基因发现1个剪切位点突变;PTGIS基因发现1个错义突变。结论 GenCap目标基因捕获技术结合Illumina HiSeq 2000第2代测序技术成功发现了EH患者的致病基因突变。该方法快速有效,对深入研究EH的分子病因学有重要意义。

利用目标基因捕获结合第二代测序技术发现腹主动脉瘤致病基因突变

目的建立目标基因捕获结合第二代测序技术对腹主动脉瘤患者原纤维蛋白1(FBN1)基因进行突变筛查,探讨腹主动脉瘤与FBN1基因突变的关系。方法提取4例腹主动脉瘤患者外周血全基因组DNA,利用Gen Cap目标基因捕获技术,设计FBN1的65个外显子区域特异性捕获探针,与基因组DNA文库进行杂交,将目标基因组区域的DNA片段进行富集后,再利用Illumina Hi Seq2000第二代测序仪进行测序,通过数据分析,确定突变位点,用Sanger测序法对突变位点进行验证。结果设计合成的目标基因特异性捕获探针可有效地捕捉并富集基因组DNA的目标靶片段。4例患者目标区域平均测序深度为448.15~536.61,99.5%~99.7%目标区域覆盖度。经过数据分析及Sanger测序验证发现1个新的错义突变c.2753 C>G(p.Pro918Arg),db SNP137数据库、千人基因组及内部800名正常汉族人数据库均无此突变。经SIFT预测为有害突变。结论本研究所建立的Gen Cap目标基因捕获技术结合Illumina Hi Seq2000第二代测序技术成功地发现了FBN1的新突变。该方法快速而有效,对腹主动脉瘤分子病因学有更好的认识。

基因捕获技术及其在水稻突变体库构建上的应用

基因捕获是一种新的基因标签技术,被广泛应用于植物突变体库的构建及基因分离。近年来,基因捕获技术应用于水稻突变体库构建方面取得了显著进展;介绍了基因捕获技术及其在水稻突变体库构建上的应用。

应用目标基因捕获结合二代测序技术检测无遗传性眼病家族史的遗传性视网膜疾病患者的致病基因

背景遗传性视网膜疾病（HRDs）是以原发性视网膜病变为主要病理改变、视力和色觉等视敏度严重损害为主要临床表现的致盲眼病，其与遗传因素密切相关，是『晦床上难治性盲的首要原因。目的应用目标基因捕获结合二代测序技术检测HRDs的致病基因。方法选择2014年1月至2015年1月在宁夏眼科医院就诊的无遗传性眼病家族史的20例HRDs患者作为研究对象。收集所有患者及其家庭成员临床资料，完善眼科检查，抽取患者和家庭正常成员外周静脉血，提取DNA。针对232个HRDs已知致病基因的目标序列设计并定制目标序列捕获芯片，借助高通量二代测序技术检测患者的遗传变异，数据经分析滤过，候选突变进行Sanger测序验证和致病性评估，明确致病基因和突变，并对表型和基因型间的关系进行分析。结果20例HRDs患者中有11例患者检测到致病性突变位点，共涉及9个基因，阳性率为55％。其中有8例患者检测到复合杂合突变，3例患者为纯合子突变，均为新发现的突变位点。通过对家系成员的基因筛查分析，6例HRDs患者为常染色体隐性遗传，5例遗传类型不确定。结合临床表型以及基因检测结果分析，11例HRDs患者的诊断分别为锥杆细胞营养不良5例，致病基因分别为ABCA4、RPE65、USH2A、RIMSl和RHO；Leber先天性黑嚎3例，致病基因分别为CRBl（2例）和LCA5；先天性静止性夜盲1例，致病基因为PRP乃；Best卵黄样黄斑营养不良1例，致病基因为BESTl基因；Stargardt病1例，致病基因为ABCA4基因。结论目标基因捕获结合二代测序技术可以对视网膜疾病患者进行快速、有效的基因诊断，结合临床特征分析有助于提高隐性遗传及遗传方式不明的HRDs的临床诊断水平。

利用基因捕获技术建立稳定表达HBV的细胞模型

pGEM-HBV1.3质粒经HindIII限制性内切酶消化,将HBV1.3全长DNA切下,与同样经HindIII限制性内切酶降解过的PU21连接,得到PU21-HBV重组质粒。将该重组质粒采用电击转染方法导入HepG2细胞中,G418筛选阳性克隆并以X-gal染色,RT-PCR、Southernblot等方法验证HBVDNA的插入和表达。PU21-HBV重组质粒经测序证明HBV1.3全长DNA正确与PU21载体连接,该重组质粒转染HepG2细胞后经G418筛选,得到一系列阳性克隆,Southernblot证实HepG2细胞基因组中含HBVDNA,RT-PCR结果表明HBVDNA在HepG2细胞中有功能基因的转录。HBV1.3已被整合在HepG2细胞染色体中并能稳定表达其RNA。稳定的HBV表达细胞模型构建成功。HBV表达细胞模型的建立,为进一步研究相关基因对HBV的转录、复制、转录后调节以及HBV各种蛋白的表达机理研究提供实验材料。

基因捕获技术及其最新进展(英文)

基因捕获技术是目前最具应用前景的基因克隆方法之一。利用该技术建立的随机插入突变的突变体文库,可用于寻找、鉴定和研究大量未知功能和已知功能的活化基因,它是继自然突变、物理突变和化学突变之后发展起来的新的分子生物学方法。基因捕获载体是带有报告基因和／或选择标记基因的不完整的基因表达载体;这些载体所带的基因只有在整合到宿主功能基因内部且与融合的宿主基因编码框一致时才能得以表达。经典的基因捕获载体有:增强子捕获载体、基因捕获载体和启动子捕获载体。增强子载体只有一个最小化的启动子控制下游报告基因的表达活性。只有当启动子上游存在一个增强子时才能启动其下游基因的转录;而单独依靠这个启动子则不能转录。狭义的基因捕获载体是指插入到结构基因内部从而捕获该基因的载体,分为内含子捕获载体和外显子捕获载体。前者插入内含子,因此需要在无启动子的报告基因前面添加一个splice acceptor(SA)位点;后者插入外显子,因此不需SA位点就能产生融合蛋白mRNA。启动子捕获载体由一个无启动子的报告基因和选择标记基因组成,只有在捕获载体插入到内源基因的外显子中,且两阅读框一致的时候才会有报告基因和被捕获的内源基因上游编码区的融合蛋白的表达。利用某些遗传元件的遗传特性也可以构建非常有用的捕获载体。常用的有:逆转录病毒介导的捕获载体和转座子介导的捕获载体等等。该文较为全面地概括了转座子介导的捕获载体的用途和研究现状。比如:在拟南芥中应用Ac／Ds转座子元件,在果蝇中应用P-element和piggyBac转座元件,在斑马鱼中应用Tol2转座子元件,在脊椎动物研究中应用Tcl／meriner转座子超家族,以及在哺乳动物和小鼠ES细胞中应用piggyBac 转座子元件。还列举了设计新颖的载体优化策略,比如:发展新的选择标记基因,利用内源核糖体识别／结合位点(IRES), 去掉起始密码子和加一小段接头(linker)等方法。最后介绍了几种针对特定实验目的而设计的捕获载体。附录部分还列出了关于基因捕获技术的网络资源。

FOX基因捕获技术在植物中的研究进展与应用

利用功能获得突变技术已在模式植物拟南芥与水稻中获得了大量的突变群体,通过对这些突变群体进行研究分析,极大促进了拟南芥与水稻基因功能的研究。其中FOX基因捕获技术是利用单一或者有限数量的全长cDNA使植物基因异位表达,从而系统地获得功能获得型突变体。FOX技术不但在拟南芥、水稻等模式植物中的应用日趋成熟,同时在其他植物物种内的研究也已取得极大的进展。

植物基因捕获系统及其应用研究进展

随着人类和其他一些重要动、植物序列数据的快速积累,我们面临着如何鉴定这些序列数据所代表的生物学功能的巨大挑战。基因捕获技术是一种产生大规模基因突变的便利手段,对于揭示大量基因序列所对应的基因功能具有重要应用价值。本文介绍了植物中的基因捕捉系统及其在植物分子生物学研究中的应用。

基因捕获技术在肝癌侵袭和迁移相关基因筛选中的应用

目的:用基因捕获技术在肝癌细胞SMMC7721细胞中寻找与肝癌侵袭和迁移相关的基因。方法:首先,将p U21质粒转染到肝癌细胞SMMC7721细胞,用G418筛选出单克隆稳定细胞系;其次,采用Transwell小室实验和划痕实验,检测这些单克隆细胞侵袭和迁移能力的变化;最后,用5’-Full RACE实验、T克隆及基因测序检测这些细胞系中被p U21质粒捕获的基因。结果:成功获得了约300株稳定转染p U21质粒的单克隆细胞系,得到了约30株侵袭和迁移能力增强的细胞株和约40株侵袭和迁移能力减弱的细胞株。通过5’-Full RACE实验、T克隆及基因测序检测,证明了在A554细胞系中,被p U21质粒捕获的基因是long inter-genic non-protein coding RNA 52(LINC00052)。结论:应用基因捕获技术筛选肝癌侵袭和迁移相关基因是可行的。

SNP微阵列和基因捕获测序联合在智力障碍或精神发育迟缓儿童中的应用价值

目的研究单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism,SNP)微阵列和新一代基因捕获测序技术的联合应用对智力障碍或精神发育迟缓儿童的诊断价值。方法通过资料分析法选取2018年9月至2020年3月在南京医科大学附属儿童医院康复门诊接受治疗的智力障碍或精神发育迟缓儿童19名,年龄在6个月至14岁,男童11人和女童8人。分别采用发育诊断量表和韦氏儿童智力量表中国修订本(WISC-RC)对其进行智力评定,发育商低于49分或智商低于51分者纳入本次研究,进行全基因组拷贝数变异(Copy Number Variation,CNV)及致病基因变异分析,对检测的CNV采用定量PCR法进行先证者及父母验证,对明确或疑似致病性基因变异采用双脱氧法测序进行验证和家庭基因谱核查。结果研究表明19名入选者中有16名患儿的SNP微阵列分析结果为阴性,其中6例确认患有单一遗传疾病、7例阴性、3例存在可疑的基因病变(表现在11q24.1q25、21q22.2q22.3、12q22.1q23区域,其是诱发智力障碍和精神发育迟缓的主要病因)。结论SNP微阵列和新一代基因捕获测序技术的联合应用可显著提高不明原因的智力障碍或精神发育迟缓儿童的分子遗传病因诊断概率,通过寻根朔源方式也可为后续诊治方向提供可靠依据,具有重要的临床意义。

陈学进研究组在“利用核移植及同源重组和基因捕获技术获得HPRT基因敲除兔”研究中取得新进展

2015年11月2日,上海交通大学医学院动物科学部分陈学进研究组在Scientific Reports发表了一篇研究论文,题为“Generation of hypoxanthine phosphoribosyl transferase gene knockout rabbits by homologous recombination and gene trapping through somatic cell nuclear transfer”。陈学进研究员的博士生尹明茹和姜伟华并列为论文第一作者,李善刚副研究员参与指导,为共同通信作者。

基因捕获测序诊断血癌

澳大利亚新南威尔士大学和加文医学研究所的科研人员开发了一种新的基因测序技术，被称为“捕获测序”，其精度大大高于现有方法，它尤如一台倍数更高的显微镜，可用于对基因组进行精细研究，并帮助快速诊断血癌（即白血病）。

条件性定点基因捕获载体的构建

基因捕获是依赖于捕获载体的随机插入产生突变而进行基因功能研究的一类重要技术。由于传统捕获载体在捕获位点上的局限性,各种新型的捕获载体正在不断地被设计并应用于基因捕获技术。以PL-451为基础质粒,结合定点的重组酶识别位点LoxP及Frt序列,突变LoxP的1个碱基的LoxP511A和LoxP511B,SA位点以及不含启动子但有poly(A)的EGFP片断,构建了能够在捕获元件两侧克隆同源臂的条件性基因捕获载体,从而为实现可调控性基因捕获奠定基础。