TP-M13自动荧光检测法在高粱SSR基因型鉴定中的应用

研究利用TP-M13自动荧光检测法对48份高粱材料进行了简单序列重复(SSR)标记的基因型鉴定。在这个方法中,需要合成一个普适性的用荧光(如FAM)标记的M13引物,并把M13的正向引物和一个SSR反向引物相连(称为TP-M13引物),利用3条引物序列进行PCR扩增,其PCR产物在DNA测序仪(如ABI3700仪)上进行自动荧光检测。结果表明,这种方法和其他的传统方法相比,具有经济、灵敏、高效的优点。建议在利用数量很多的SSR标记对数量有限的基因组较小的材料进行基因型鉴定时,使用TP-M13自动荧光检测系统。

3＇末端外显子捕获：从脊椎动物DNA中确定基因

３＇末端外显子捕获：从脊椎动物ＤＮＡ中确定基因一些定位克隆方法的目的是为了阐明在这些ＤＮＡ区域存在可转录序列。一个主要的难题是大多数脊椎动物基因都被一些长的插入内含子序列分为若干短的外显子序列。目前的方法包括寻找ＨＩＦ岛、检测高度保守序列（ｚｏｏｂｌ...

基于启动子捕获系统的水稻基因的分离

为了分离水稻的基因及其启动子,该实验室构建了T-DNA(GUS)结构的水稻启动子捕获系统,对其中编号为113#、T-DNA单拷贝插入、GUS报告基因为组成型表达的阳性捕获系进行了进一步分析。潮霉素筛选结合GUS组织化学染色获得了T-DNA插入的纯合株(113#-22和113#-26);Inverse法分离得到T-DNA插入位点水稻基因组DNA旁邻序列,测序和BLAST结果表明,T-DNA反方向插在水稻基因组4号染色体预测基因的内含子中;扩增T-DNA插入位点上游2kb左右DNA片段,构建启动子分析质粒转化水稻‘中花11’胚性愈伤组织,获得转基因植株,GUS组织化学染色模式与113#阳性株系一致。结果表明,该预测基因及其启动子是利用启动子捕获系统所捕获到的候选基因。

古DNA捕获新技术与中国南方早期人群遗传研究新格局

古DNA捕获技术目前已获得极大的发展,能够从骨骼和环境沉积物等多种材料中获取到目的DNA片段,而且对于保存环境较差的低纬度地区,同样能够获取有效的内源DNA片段,极大地丰富了古DNA研究的材料来源。本文围绕这一新技术开展总结和讨论,主要分为两个方面:1)总结并介绍该技术应用前景;2)应用这一技术打开了中国南方早期人群研究的新局面,梳理该新技术的应用对史前中国南方人群古基因组研究所获得的新认识,并对中国南方早期人群古基因组深入分析;另外,利用古DNA捕获技术成功获取云南3446~3180 BP的大阴洞遗址4例高质量线粒体基因组信息,并开展了人群遗传历史的研究。

SNP微阵列和基因捕获测序联合在智力障碍或精神发育迟缓儿童中的应用价值

目的研究单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism,SNP)微阵列和新一代基因捕获测序技术的联合应用对智力障碍或精神发育迟缓儿童的诊断价值。方法通过资料分析法选取2018年9月至2020年3月在南京医科大学附属儿童医院康复门诊接受治疗的智力障碍或精神发育迟缓儿童19名,年龄在6个月至14岁,男童11人和女童8人。分别采用发育诊断量表和韦氏儿童智力量表中国修订本(WISC-RC)对其进行智力评定,发育商低于49分或智商低于51分者纳入本次研究,进行全基因组拷贝数变异(Copy Number Variation,CNV)及致病基因变异分析,对检测的CNV采用定量PCR法进行先证者及父母验证,对明确或疑似致病性基因变异采用双脱氧法测序进行验证和家庭基因谱核查。结果研究表明19名入选者中有16名患儿的SNP微阵列分析结果为阴性,其中6例确认患有单一遗传疾病、7例阴性、3例存在可疑的基因病变(表现在11q24.1q25、21q22.2q22.3、12q22.1q23区域,其是诱发智力障碍和精神发育迟缓的主要病因)。结论SNP微阵列和新一代基因捕获测序技术的联合应用可显著提高不明原因的智力障碍或精神发育迟缓儿童的分子遗传病因诊断概率,通过寻根朔源方式也可为后续诊治方向提供可靠依据,具有重要的临床意义。

3种方法检测宫颈脱落细胞HPV感染结果的分析

目的探讨3种方法检测宫颈脱落细胞人乳头瘤病毒(HPV)感染的内在联系及与薄层细胞学检测(TCT)结果的相关性。方法用基因捕获DNA检测法(hC2)捕获样品HPV DNA解链、杂交,检测与宫颈癌高度相关的13种HPV。用实时荧光定量PCR(Q-PCR)法提取样品HPV DNA,扩增核酸在Q-PCR定量仪上检测结果。MPHC提取样品HPV DNA,扩增核酸,将扩增后的产物加到微孔板中进行杂交,加入酶标液,用酶标阅读仪测定结果。后两种方法检测病毒亚型数量与hC2法相同。本实验将hC2法与Q-PCR匹配检测260例宫颈脱落细胞HPV感染;将hC2法与MPHC匹配检测200例宫颈脱落细胞HPV感染情况。结果3种方法在鳞状上皮异常改变组中,HPV检出阳性率均为100%;在鳞状上皮良性改变组中Q-PCR和MPHC检测HPV阳性结果绝大部分与hC2相符,只有较少部分样品结果在hC2阴性结果的范围内,灵敏度均>hC2,MPHC假阳性率占2%。结论HPV检测结果与TCT的结果相结合评价宫颈疾病、宫颈癌及癌前病变是最佳方案。

激光捕获显微切割技术应用研究新进展

对疾病发生过程中的组织损害要进行分子水平分析,首要步骤就是纯净目标细胞的分离。近年发展起来的激光捕获显微切割(lasercapturemicrodissection,LCM)技术可以在显微镜直视下快速、准确地获取所需的单一细胞亚群,甚至单个细胞,从而成功解决了组织中细胞异质性问题。本文介绍了LCM技术的原理及其优缺点,并对其在DNA分析和基因表达分析两个方面的应用研究新进展进行综述,同时对LCM技术的发展和完善提出了可能的方向。

宫颈病变人乳头状瘤病毒分子检测及分型的意义

目的探讨宫颈癌前病变患者进行人乳头状瘤病毒(HPV)DNA检测及基因分型的意义。方法采集2153例宫颈中心就诊患者的宫颈脱落细胞,采用杂交捕获技术对HPV DNA进行检测。采用凯普导流杂交HPV分型技术检测342例宫颈上皮内瘤变(CIN)患者的HPV亚型。结果①2153例受检者中701例HPVDNA检测阳性,阳性率达32.6%;其中以宫颈癌患者感染率最高,达93.9%,其次为宫颈上皮内瘤变,达54.6%。②高危型HPV感染好发于30岁以上,40～59岁是高危型HPV最高发的年龄阶段。③随着宫颈病变的严重程度,高危型HPV DNA病毒载量有上升趋势。④宫颈上皮内瘤变患者高危型HPV主要的感染类型为16、52和58亚型,低危型主要为11、6和42亚型。⑤CINⅠ主要感染亚型为16、52和33亚型,CINⅡ主要亚型为16、58和18亚型,CINⅢ主要亚型为16、52和58亚型。⑥高危型HPV感染者多重感染率为23.0%,其中双重感染18.9%,三重及以上感染4.1%。CINⅠ、CINⅡ和CINⅢ多重感染发生率未发现明显增高趋势。结论高危型HPV DNA检测用于宫颈癌前病变筛查极有价值。HPV16仍然是最应关注的高危亚型。

沉积物古DNA探秘灭绝古人类演化

古DNA领域首次从世界不同洞穴遗址的沉积物里提取古核基因组以揭示相关物种演化的突破性进展,标志着沉积物古DNA研究正式进入全基因组时代。近期,一种新的沉积物古核DNA富集方法成功从西班牙Estatuas洞穴沉积物里捕获多个尼安德特人的核DNA,揭示该灭绝古人类群体此前未知的人口更替的历史。沉积物古核DNA富集突破了古DNA研究依赖化石材料的限制,为深入探究远古不同人类群体在更宏大时空框架下迁徙、演化与适应的历史提供了更多可能。由此,本文将着重解读该研究带来的对尼安德特人遗传历史的新认识及其方法创新的重要意义;此外还将结合人类化石DNA及其他沉积物研究所发现的灭绝古人类线粒体DNA证据,厘清尼安德特人的种群多样性及其种群间分离或替代的历史。

基于纳米金复合探针的基因芯片膜转印检测法

建立了一种基于纳米金复合探针的基因芯片膜转印核酸检测新方法。首先,用纳米金颗粒同时标记检测探针P2和两种长短不同且生物素化的信号探针(T10,T40),其中检测探针与靶DNA5′端互补,两种信号探针起信号放大作用。当靶DNA分子存在时,芯片表面捕捉探针P1(与靶DNA分子3′端互补)通过碱基互补配对原则结合靶DNA分子,将其固定于芯片上,同时检测探针通过与靶DNA5′端互补配对将纳米金复合探针结合于芯片表面,结果在芯片表面形成"三明治"结构,后通过链霉亲和素-生物素反应,使芯片表面对应有靶DNA分子的部位结合上碱性磷酸酶,最后利用BCIP/NBT显色系统使芯片表面信号结果镜面转印至尼龙膜表面。当检测探针和信号探针摩尔比为1∶10,T10和T40摩尔比为9∶1时可以检测1pmol/L合成靶DNA分子或0.23pmol/L结核分枝杆菌16S rDNA PCR扩增产物,检测结果通过普通的光学扫描仪读取或肉眼直接判读信号有无。本芯片检测系统灵敏度高,操作方法简单、快速,不需要特殊仪器设备,在生物分子的检测方面具有较高的应用价值。

一种新的线粒体基因组DNA捕获探针的制备及初步应用

目的:建立新的线粒体基因组DNA杂交捕获探针制备方法并用进行初步应用。方法:通过PCR技术扩增特异线粒体DNA片段,并与生物素偶联,最后与标记磁珠的亲和素混合获得捕获探针。并自行制备的线粒体基因组DNA文库捕获探针与肝癌全基因组测序文库进行液相杂交。分离捕获产物后PCR扩增并进行测序分析。结果:成功建立了线粒体基因组杂交捕获探针制备方法并成功分离线粒体基因组DNA;对测序数据的分析显示:90%以上测序数据来自线粒体基因组DNA,且覆盖率达到100%,且均一性良好。检测到的同质性变异位点数量和异质性变异位点数量与全基因组测序数据产生的结果接近(P=0.9152,P=0.8409)。结论:新方法制备的线粒体基因组DNA杂交捕获探针可以从全基因组文库中高效捕获线粒体基因组DNA测序文库。

线粒体DNA耗竭综合征1例临床特点和DGUOK基因突变分析

该文报道1例线粒体DNA耗竭综合征患儿的临床特征及DGUOK基因突变特点。患儿女,婴儿期起病,表现为肝脾肿大、肝功能异常、眼球震颤和精神运动发育迟缓等。提取患儿及其父母外周血DNA标本,采用外显子组捕获测序技术检测致病突变,并对检测到的突变进行Sanger测序验证。结果显示患儿为DGUOK基因突变c.679G>A和c.817del T的复合杂合子,前一个突变来自于母亲,为已报道致病性突变;后者来自于父亲,是一个未见文献报道的新突变。该研究扩展了DGOUK基因突变谱,为患儿病因诊断及该家系的遗传咨询和产前诊断提供了分子依据。

惠州地区妇女宫颈感染高危型人乳头瘤病毒调查

目的研究高危型HPV-DNA检测负荷量与宫颈病变程度的相关性。方法分析2013年1月至2014年12月就诊于惠州市中心人民医院妇科（门诊和住院）并采用第二代基因杂交捕获法检测高危型HPV-DNA的患者9917例，从中筛选出1209例检测结果为阳性的患者，并同时行液基细胞学检查（TCT）。结果（1）9917例样本中，HPV感染率12．19％，21-50岁年龄段感染率总体高于其他年龄段（P〈0．05）。（2）l209例高危型HPV-DNA阳性患者中，细胞学诊断：未见上皮内病变835例（69．07％），炎性反应细胞改变179例（14．8l％），ASC33例（2．73％）,LSIL59例（4．88％），HSIL103例（8．52％）。将高危型HPV-DNA检测结果阳性负荷量分为1-100、10-300,301-600,601-1000、〉1000pg／mL组，看不同TCT结果的负荷量分布情况，可见每组的比率并不完全随宫颈病变的加重雨呈递增趋势。（3）宫颊细胞学病变程度与HR-HPv-DNA负荷量相关系数r=0．245（P〈0．01）。结论高危型HPV—DNA负荷量与宫颈病变程度并不完全相符，高危型HPV-DNA负荷量并不能作为预测宫颈痛变严重程度的指标。

比较基因组杂交应用于结直肠癌检测中的质量控制

比较基因组杂交（comparative genomic hybridization，CGH）是在染色体荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）基础上发展起来的一种新的分子细胞遗传学技术，与其他肿瘤细胞遗传学方法相比，主要的优点是无需制备肿瘤细胞的中期分裂象，对肿瘤标本没有限制，只要能得到少量基因组DNA的标本如新鲜或冻存的或石蜡包埋的癌组织、癌细胞系均可用来分析，且只经一次实验便可得到整个基因组的扩增和丢失的情况。与FISH相比，它克服了需制备染色体特异区域的探针且仅能检测个别染色体或部分位点的局限性，它是一种全方位检测法，一次实验即可检测出待测标本整个基因组DNA拷贝数增减。

肝癌高危人群中DNA氧化损伤与损伤修复酶基因多态性的关系

目的:探讨肝癌高危人群中DNA氧化损伤与损伤修复酶基因多态性的关系。方法:收集广西扶绥县550例乙型肝炎病毒携带志愿者的外周血和尿样,应用高效液相-电化学法和聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism,PCR-RFLP)检测法检测肝癌高危人群的尿8-羟基-2-脱氧鸟苷(8-hydroxy-2-deoxy-guanosine,8-OHdG)水平和外周血中DNA损伤修复酶基因多态性,分析2者之间的关系。结果:肝癌高危人群中尿8-OHdG水平男性低于女性(P<0.01);PCR-RFLP检测法检测外周血DNA损伤修复酶X线修复交叉互补组1(X-ray repair cross com-plementing group 1,XRCC1)基因和人8-羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶1(human 8-oxoguanine DNA glycosylase 1,hOGG1)基因多态性的结果发现,女性hOGG1 Ser326Ser和XRCC1 Arg194Arg者的尿8-OHdG水平较低(P=0.049,P=0.048)。将尿8-OHdG水平以中位数为基点分为高、低2组进行多因素分析发现,hOGG1突变型杂合子和突变型纯合子者的尿8-OHdG水平较高,尤其在女性研究对象中更明显(P<0.05)。结论:DNA损伤修复酶基因多态性可以影响其编码的蛋白质的功能,影响机体对损伤DNA的修复作用,最终可能导致肿瘤发生的个体差异。

乙型肝炎肝脂肪变性与损害程度的相关性分析

目的 了解乙型肝炎肝组织脂肪变性程度与肝组织损伤程度的相关性分析。方法 选择病理证实为乙肝的患者 156例 ,全部病例均按病理诊断标准进行病理组织学诊断。结果 肝组织脂肪变性程度与肝组织内HBV -DNA无明显的相关性 ,而与肝组织损害程度有明显的相关性 (Hc =64.11P <0 .0 1)。另外损害程度还与患者年龄有关。

新血液检测法能诊断多种早期癌症

美国和欧洲研究人员8月16日在美国《科学转化医学》杂志上报告说，他们研发出一种基于检测血液里肿瘤特异性遗传物质的早期癌症诊断新方法，准确率可达62％。癌症血检主要依赖于检测肿瘤释放到血液里的微量DNA片段，即循环肿瘤DNA。然而，大多数时候血液里的基因变异都不是由肿瘤引发，能否区分循环肿瘤DNA和其他变异，是研发癌症血检方法而临的一大挑战。