慢病毒介导的短发夹RNA敲低PIWIL2基因对肝母细胞瘤细胞生物学行为的影响

目的探讨PIWIL样蛋白2(PIWIL2)基因在肝母细胞瘤(hepatoblastoma,HB)中的表达及慢病毒介导的短发夹RNA敲低PIWIL2基因对HB细胞生物学行为的影响。方法收集2015年7月—2020年12月青岛大学附属医院小儿外科收治的33例HB患儿肿瘤组织及瘤旁正常组织标本,采用免疫组织化学方法检测两种组织中PIWIL2蛋白的表达。采用实时荧光定量PCR方法检测HB细胞HUH6与正常肝细胞LO2中PIWIL2 mRNA的表达。分别以shRNA-PIWIL2慢病毒和阴性对照慢病毒感染HUH6细胞,分为实验组和对照组,采用克隆形成实验、CCK-8实验、Transwell迁移实验检测两组细胞的增殖、迁移能力。结果HB肿瘤组织中PIWIL2蛋白表达水平显著高于瘤旁正常组织(t=7.16,P<0.05)。HB细胞HUH6中PIWIL2 mRNA表达水平显著高于正常肝细胞LO2(t=20.77,P<0.05)。与对照组相比,实验组细胞增殖能力减弱(t=7.62,F=17.68、165.40,P<0.05),细胞迁移能力降低(t=20.05,P<0.05)。结论PIWIL2在HB肿瘤组织及HB细胞HUH6中高表达,敲低PIWIL2能明显抑制HUH6细胞增殖,细胞迁移能力降低。

CDK9在动脉粥样硬化组织中的表达及其敲低对血管平滑肌细胞增殖的影响

目的研究细胞周期蛋白依赖性激酶9(CDK9)在动脉粥样硬化(AS)组织中的表达,及其敲低对血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖的影响及调控机制,并探讨其临床意义。方法收集我院健康体检者(A组)及冠心病患者(B组)外周血标本各20例,正常颈动脉内膜组织(C组)及颈动脉粥样硬化斑块组织(D组)各6例。选取VSMCs,分为阴性转染组(E组)和CDK9敲低组(F组),其中E组转染CDK9阴性对照(CDK9-NC),F组转染CDK9小干扰RNA(CDK9-siRNA)。通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测CDK9 mRNA在各组中的表达量以及E、F组中增殖细胞核抗原(PCNA)mRNA的表达量;采用Western blotting方法检测E、F组中CDK9、PCNA蛋白的表达量;通过EDU、CCK-8实验检测E、F组细胞的增殖情况。结果RT-qPCR检测结果显示,A组与B组、C组与D组中CDK9 mRNA的表达量比较,差异有显著性(t=7.94、4.79,P<0.05)。RT-qPCR和Western blotting检测结果显示,E组和F组中CDK9 mRNA和蛋白相对表达量比较,差异有显著性(t=30.33、16.39,P<0.05);E组和F组中PCNA mRNA和蛋白相对表达量比较,差异有显著性(t=8.14、12.62,P<0.05)。EDU和CCK-8实验结果显示,E组和F组平均吸光度值、波长450 nm处吸光度值比较,差异有显著性(t=13.13、6.78,P<0.05)。结论CDK9 mRNA在动脉粥样硬化组织中显著升高。在VSMCs中敲低CDK9可显著抑制细胞增殖及PCNA的表达。在AS中,CDK9可能通过影响PCNA的表达而调控VSMCs的增殖。

HDAC9基因对LPS诱导冠状动脉平滑肌细胞增殖与凋亡及炎症反应影响

目的探讨蛋白去乙酰化酶9(HDAC9)基因对脂多糖(LPS)诱导的人冠状动脉平滑肌细胞(HCASMC)增殖、凋亡及炎症反应的影响。方法采用LPS诱导HCASMC,实验分为空白对照组、模型组、阴性对照组和转染组。采用实时荧光定量PCR(qPCR)和Western blot方法检测HDAC9 mRNA和蛋白表达;MTT法和流式细胞术分别检测细胞增殖和凋亡情况;ELISA检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)和白细胞介素-8(IL-8)含量。结果与空白对照组相比,模型组细胞中HDAC9 mRNA和蛋白表达水平升高(F=91.145、185.108,q=19.403、25.646,P<0.05)、细胞活力升高(F=77.940,q=17.819,P<0.05)、凋亡率降低(F=98.321,q=15.563,P<0.05)、TNF-α与IL-1β及IL-8的含量增多(F=91.145~325.808,q=10.813~15.180,P<0.05)。敲低HDAC9能够抑制细胞活力和炎症反应,并促进细胞凋亡。结论敲低HDAC9可抑制LPS诱导的HCASMC增殖及炎症反应,并促进细胞凋亡。

小鼠shRNA-Slfn3重组腺病毒载体的构建及其在EPCs中转染效率的测定

目的构建小鼠短发夹RNA(shRNA)-Schlafen3(Slfn3)重组腺病毒载体,并检测其在内皮祖细胞(EPCs)中的转染效率。方法采用GenBank基因软件查询小鼠Slfn3基因序列,设计并合成3个siRNA片段及其引物,取腺病毒干扰载体pADV-U6-shRNA-CMV-EGFP,采用限制性内切酶进行酶切,线性化后连接siRNA片段,获得重组腺病毒载体shRNA-Slfn3,从中筛选阳性克隆抽提质粒,进行DNA测序验证;取对数生长期的人胚胎肾细胞HEK293,采用Admax系统将目的质粒转染至HEK293细胞,获得重组腺病毒shRNA-Slfn3后进行小量扩增及病毒滴度测定;取小鼠脾脏单个核细胞体外培养至对数期EPCs,用前述所得重组腺病毒shRNA-Slfn3对其进行转染48 h,采用绿色荧光蛋白量检测重组腺病毒的转染效率。结果测序验证3组目的质粒构建成功;获得shRNA-Slfn3重组腺病毒,病毒滴度分别为2.37×10^(13)pfu/L、3.16×10^(13)pfu/L及4.74×10^(13)pfu/L;EPCs转染效率为(63.64±2.58)%。结论成功构建了小鼠shRNA-Slfn3重组腺病毒载体,转染小鼠脾源EPCs后的转染效率较高。

荧光定量PCR对FEN1敲低细胞株转录组测序结果的验证

目的探讨DNA分枝结构特异性内切酶-1(FEN1)基因敲低细胞株及对照细胞株的差异表达基因,用实时荧光定量PCR方法进行结果验证。方法从293T野生型及293T FEN1敲低细胞株中提取RNAs,并反转录成cDNA;挑选10个转录组测序中差异表达的基因,设计引物,利用SYBR Green染料法,定量检测挑选基因的表达情况。结果挑选的10个差异表达基因中,成功扩增了其中7个基因;通过实时荧光定量PCR方法对两组细胞的7个基因进行定量检测发现,与转录组测序结果相比较,其中有2个没有明显差异,另外5个基因荧光定量方法的检测结果与转录组测序结果一致。结论在细胞内基因表达水平检测中,为提高转录组测序结果的可靠性,还需通过实时荧光定量PCR方法对其结果进一步验证。