雄性不育相关基因敲除小鼠模型

男性不育的发生机制复杂,建立雄性不育的动物模型,特别是小鼠模型,为研究不育相关基因功能和分子机制提供了模型基础,目前用于生物医学研究的小鼠模型主要有3种类型,例如敲除/敲入/基因捕获方法获得小鼠,转基因小鼠和化学诱导的点突变小鼠。本文对雄性不育相关基因敲除的小鼠模型进行了总结,以期为研究男性不育的发病机制寻找合适的动物模型。

LRP16肝特异性基因敲除小鼠模型的构建与鉴定

目的建立白血病相关蛋白16(leukemia-related protein 16,LRP16)肝脏特异性基因敲除小鼠模型,进而在体内研究LRP16基因与胰岛素抵抗的关系。方法构建LRP16基因重组载体,通过电转打靶转染胚胎干细胞(ES细胞),将筛选出的阳性ES细胞克隆,显微注射至超排小鼠的囊胚腔后移植于受体小鼠,从子代中筛选嵌合体小鼠,与野生型C57小鼠杂交后得到LRP16-Loxp转基因小鼠,再与Alb-Cre小鼠杂交后得到LRP16肝特异性基因敲除小鼠并进行鉴定。结果得到8株阳性ES细胞克隆,经显微注射后得到2只雄性嵌合体小鼠,与野生小鼠杂交后得到1只LRP16-Loxp转基因小鼠,与Alb-Cre小鼠杂交后再自交筛选出2只小鼠经鉴定为LRP16肝特异性基因敲除小鼠。结论成功建立LRP16肝特异性基因敲除小鼠模型,为研究LRP16基因与胰岛素抵抗的关系奠定基础。

载脂蛋白M基因敲除小鼠模型的构建和鉴定

人载脂蛋白M（ApoM）由Xu等[1]于1999年发现,主要存在于具有抗动脉粥样硬化作用的高密度脂蛋白（HDL）中[2].研究显示,瘦素、胰岛素、高血糖以及多种细胞因子可调节ApoM的表达[3-4],也可能与肥胖、糖尿病、肝癌、结肠癌的发生发展相关[5-6],但其作用机制尚不明确,其功能有待进一步研究.本研究旨在构建ApoM基因敲除小鼠模型并建立分型ApoM基因敲除小鼠的方法.

mSpag9肾脏特异性基因敲除小鼠模型的构建与鉴定

目的:为研究支架蛋白JLP在肾脏中的生理功能,建立小鼠精子相关抗原(mSpag9)肾脏特异性基因敲除小鼠模型,为研究该基因所发挥的重要生理功能提供材料和思路。方法:构建mSpag9基因重组载体,通过电转打靶转染胚胎干细胞(ES细胞),将筛选出的阳性ES细胞克隆,经显微注射至超排小鼠的囊胚腔后移植于受体小鼠,从子代筛选嵌合体小鼠,与携带flp位点C57/BL6N小鼠杂交后得到mSpag9flox/+基因敲除小鼠,自交筛选出mSpag9flox/flox小鼠,再与KSP-CreERT2小鼠杂交得到mSpag9flox/flox-Cre肾脏特异性基因敲除小鼠并进行鉴定,待小鼠成长至5周,使用Tamoxifen(10mg/mL葵花籽油溶解)腹腔注射(0.04mg/g)诱导Cre重组酶特异性表达于肾小管上皮细胞。结果:经PCR扫描后得到10株阳性ES细胞克隆,其中6株使用SouthernBlot鉴定;经显微注射后得到4只雄性、5只雌性嵌合体小鼠,与flp小鼠杂交后得到9只mSpag9flox/+基因敲除小鼠,将自交得到的mSpag9flox/flox小鼠与KSP-CreERT2小鼠交配筛选出mSpag9flox/+-Cre+3只小鼠,将其与mSpag9flox/flox小鼠回交得到基因型为mSpag9flox/flox-Cre+小鼠,即为mSpag9肾脏特异性基因敲除小鼠。结论:该模型利用Cre-Loxp系统实现基因mSpag9的基因打靶,Tamxifen诱导基因mSpag9实现该基因在肾小管上皮细胞上敲除,为进一步研究mSpag9基因及支架蛋白在肾脏生理病理进展中所发挥的作用提供工具。

支架蛋白JLP基因敲除小鼠的构建及其肾脏表型的初步观察

目的繁殖和鉴定支架蛋白JLP基因敲除小鼠,对其肾脏表型进行初步观察。方法将JLP基因敲除杂合小鼠进行配种繁殖,提取子代小鼠的组织DNA,用PCR技术检测小鼠的基因型,并用Western blot法验证基因敲除效果。通过PAS病理染色等观察肾脏微观结构。结果成功繁殖并获得子代小鼠,子代小鼠有3种基因型,包括纯合子(JLP+/+、JLP-/-)和杂合子(JLP+/-)。PCR检测基因型的方法方便且结果准确。结论笔者成功建立了JLP基因敲除小鼠模型,能够进一步探究发现JLP基因对生物体的作用及机制。

高脂喂养对载脂蛋白O基因敲除小鼠表型的影响

目的探究载脂蛋白O(ApoO)基因敲除促进高脂饮食诱导的肥胖及代谢紊乱表现。方法将ApoO基因敲除杂合小鼠进行配种繁殖,提取子代小鼠的组织DNA,用PCR技术检测小鼠的基因型。实时荧光定量PCR和Western blot检测ApoO基因敲除mRNA和蛋白表达水平。饲喂高脂饮食后,通过小鼠体型、摄食量、肝脏脂质组学等观察小鼠代谢相关表型变化。结果成功繁殖并获得子代小鼠,高脂喂养后发现纯合小鼠出现肥胖,肝脏脂肪变性更加严重,肝脏脂质组学提示肝内甘油三酯聚集,磷脂组分发生改变。结论ApoO基因敲除促进高脂饮食诱导的肥胖及代谢紊乱,可能为代谢综合征和心血管疾病的防治提供新的作用靶点。

Werner综合征小鼠模型在早衰与肿瘤研究中的应用

Werner综合征(Werner syndrome,WS)是一种罕见的人类常染色体隐性遗传疾病,一直以来该病作为研究人类早老综合征的典型病例而受到关注。Werner蛋白(WRN)是Werner综合征中突变的核蛋白,最近的生化及遗传学研究证明WRN在DNA复制、DNA损伤修复以及端粒的维持方面起着重要的作用。文章综述了Werner综合征的分子遗传学机理及端粒和WRN在Werner综合征发病中的重要作用。通过双敲除Wrn与端粒酶基因建立的小鼠模型忠实地再现了人类Werner综合征,这种Werner综合征小鼠模型因其同时具有早衰与肿瘤表型而在研究人类肿瘤及衰老的相关性中起到的独特作用。

人类趋化素样因子超家族2参与小鼠精子形成

目的:探究人类趋化素样因子超家族2(CKLF-like MARVEL transmembrane domain-containing protein 2,CMTM2)在小鼠精子生成过程中的作用。方法:构建CMTM2基因敲除小鼠模型,利用Northern、RT-PCR及Western印迹检测野生型、杂合子及纯合子小鼠的CMTM2表达水平,统计小鼠生育幼崽数量及生育率,采集并分析精子活动度、形态及睾丸组织切片,检验血清睾酮及促卵泡激素(follicle-stimulating hormone,FSH)水平。结果:CMTM2在小鼠生精中呈现准确的调控式高度表达,基因敲除的成年小鼠和野生型成年小鼠在体重上差异没有统计学意义。纯合子的小鼠睾丸体积及重量小于野生型小鼠睾丸,野生型小鼠与CMTM2敲除小鼠的睾丸长径比较,差异有统计学意义[(11.32±1.21)mm vs.(8.29±1.92)mm,P<0.05],睾丸重量比较,差异有统计学意义[(101.63±2.33)mg vs.(85.22±2.84)mg,P<0.05]。与野生型小鼠相比,杂合子精子数量明显减少,纯合子小鼠精子发生停滞。在精子形态学方面,与野生型小鼠相比,杂合子小鼠有更多圆形精子,而纯合子则因精子发育停滞,多为圆形精子细胞。睾酮和FSH在3组间差异无统计学意义。纯合子雄性小鼠由于精子发生停滞而不育,纯合子小鼠缺失生精上皮层。结论:CMTM2在生精过程中发挥着不可或缺的作用,其参与精子发生的潜在机制有待于进一步实验研究以证实。

NDUFA13失活在诱导小鼠自发性肝炎病理进程中的作用及机制

目的构建线粒体蛋白(NDUFA13)基因肝特异性敲除小鼠,探讨NDUFA13表达失活在小鼠自发性肝炎病理进程中的作用及可能机制。方法采用Cre/loxP转基因技术,将NDUFA13 flox基因编辑小鼠NDUFA13fl/fl与Alb-Cre转基因小鼠杂交,得到肝脏特异性NDUFA13杂合敲除(NDUFA13fl/-;Alb-Cre)小鼠。经PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳,对鼠尾与肝脏DNA基因进行分型鉴定。以同窝NDUFA13fl/fl小鼠为对照,将肝脏特异性NDUFA13fl/-小鼠作为研究对象,10只/组,分别在4周龄、2年龄时各处死5只,获取小鼠肝组织样本,通过HE染色分析肝组织病理变化,免疫组化分析NDUFA13、NF-κB/p65、NF-κB/p-p65及炎症小体NLRP3的表达,ROS染色试剂盒分析细胞总ROS及线粒体ROS水平;免疫组化与免疫荧光分析免疫细胞标志物CD45、MPO、F4/80以及炎症因子IL1β、IL33的表达情况。结果PCR鉴定结果显示成功建立肝特异性NDUFA13杂合敲除小鼠;HE染色显示4周龄与2年龄NDUFA13fl/-小鼠肝组织均损伤严重;免疫组化检测显示,4周龄与2年龄NDUFA13fl/-小鼠NDUFA13蛋白表达显著下调(P<0.05),NF-κB信号分子p65、p-p65(Ser536)及炎症小体NLRP3蛋白表达显著增加(P<0.05);ROS测定发现NDUFA13基因杂合敲除导致小鼠肝脏细胞总ROS、线粒体ROS水平均显著增加;免疫组化与免疫荧光结果显示,肝组织CD45、MPO、F4/80等炎症细胞标志物的聚集以及IL1β、IL33等炎症因子的分泌均明显增多(P<0.05)。结论NDUFA13蛋白表达失活可诱导小鼠自发性肝炎病理表型,其机制可能与活化的ROS/NF-κB/NLRP3信号通路相关。

肿瘤坏死因子α介导基因预测肺癌无复发生存的价值

在这项研究中，我们进行了高通量基因表达数据的荟萃分析，以确定肿瘤坏死因子α（TNF-α）介导基因在肺癌中的意义。我们首先调查了两个独立的 TNF-α/ TNFR KO 基因敲除小鼠模型的基因表达图谱。表皮生长因子受体信号通路是与 TNF-α介导的基因最为有关的顶部路径。在将 TNF-α介导的小鼠基因与其人类同源基因匹配后，我们比较了 TNF-α介导基因在人正常和肺部肿瘤组织表达模式的差异。基于上述研究，我们发现肺部肿瘤时 TNF-α介导基因失调，我们开发了能够有效预测肺癌无复发生存的预后评估基因签名，并创立了两个验证队列对其进行验证。重复取样检验表明，该基因签名评价预后的效力不是偶然的，多变量分析表明，该基因签名是独立于传统临床因素的评价预后的预测因子，有助于高复发风险肺癌患者的识别。

锌指蛋白ZBTB20是调控肝脏甲胎蛋白基因转录的关键抑制因子

甲胎蛋白(AFP)在胎肝中高表达,出生后不久就快速下调至很低水平。有关肝脏AFP基因出生后的转录抑制机制一直是未解之谜。AFP基因的增强子、抑制区域和启动子等顺式调控元件可能参与其转录抑制的调节,但有关的关键性转录抑制因子尚不明确。我们发现了一种新型锌指蛋白ZBTB20,为研究其体内的生理功能,我们利用条件打靶技术,建立了ZBTB20的组织特异性基因敲除小鼠模型,发现肝细胞特异性ZBTB20基因敲除小鼠出生后的肝脏AFP基因一直维持近乎胎肝的高水平表达,而其肝细胞处于正常的静息状态。生化分析显示,ZBTB20具有转录抑制活性,体外可有效抑制AFP启动子的转录活性;染色质免疫沉淀和EMSA实验结果显示ZBTB20体内和体外能直接结合AFP启动子。在小鼠肝脏的发育过程中,ZBTB20基因被渐进激活,与AFP基因的表达水平呈负相关,提示激活的ZBTB20参与了AFP基因的转录抑制。上述结果表明ZBTB20是调控AFP基因表达的关键转录因子,由此我们认为肝脏ZBTB20基因出生后的表达上调及其发挥的转录抑制作用是导致AFP基因出生后快速下调的主要原因。

王福俤教授和闵军霞教授团队发现巨噬细胞新型锌离子转运蛋白

近日，浙江大学王福悌团队与闵军霞团队合作在《美国科学院院报》（PNAS）杂志上在线发表了题为“The Metal Transporter Slc39a10 Regulates Susceptibility to Inflammatory Stimuli by Controlling Macrophage Survival＂的论文（http ：//www. pnas. org/content/114/49/12940, long）。该研究通过GEO数据库筛选及基因敲除小鼠模型，确认了金属离子转运蛋白SLC39A10（ZIP10）介导巨噬细胞锌离子摄取，并阐明了其在机体炎性状态下发挥作用的深层分子机制，为炎症及败血症等疾病的防治提供了新靶点。

癫痫的遗传学动物模型研究进展

近年来,在遗传性癫痫动物模型研究方面取得了很大进展,尤其是对基因敲除小鼠模型,癫痫的自发基因突变小鼠模型,果蝇属动物模型的研究取得了突飞猛进的进展,为癫痫研究提供了良好的实验基础。

先天性肾缺如及发育不全的分子机制研究进展

先天性肾缺如（renal agenesis，RA）及发育不全（renal dysplasia，RD）是先天性肾脏及尿路畸形（congenital anomalies of the kidney and urinary tract，CAKUT）中最常见、最严重的形式之一，部分患者可隐匿进展至终末期肾衰竭，故越来越多的研究者致力于其机制的研究。除物理及化学因素外，遗传因素在发病机制中的地位备受重视。近年来，通过对基因敲除小鼠模型及包括RA或RD畸形综合征的研究，研究者发现众多参与后肾发育调控网络的基因缺陷均可导致RA或RD。本文从人类肾脏胚胎发育的角度，结合文献，综述RA及RD的有关分子机制研究的进展。