诱骗受体DcR3的基因构建、表达及特异性鉴定

目的:构建适于原核表达的人诱骗受体DcR3基因,并进行重组蛋白的表达纯化及特异性鉴定。方法:查得人DcR3cDNA全序列,将其分段设计引物,通过重叠PCR获得DcR3基因。构建pET-22b(+)/DcR3表达载体,转化大肠杆菌Rosseta-gami,IPTG诱导表达,Ni柱纯化。采用ELISA进行特异性鉴定。结果:通过重叠PCR获得了编码正确氨基酸序列的目的基因。目的蛋白以包涵体的形式表达,表达量占菌体总蛋白的30%以上。纯化后,蛋白纯度达95%以上。ELISA结果表明所纯化的蛋白可与抗DcR3抗体发生特异结合。结论:诱骗受体DcR3基因的成功构建、表达及纯化,为进一步的功能研究奠定了基础。

一种导向性溶栓剂的基因构建及其在大肠杆菌中的表达

以针对人活化血小板表面糖蛋白ＧＭＰ１４０的单克隆抗体ＳＺ５１的单链抗体作为导向分子，以单链尿激酶３２ｋｄ变体（ｓｃｕＰＡ３２ｋ）作为效应分子，构建了一种新型的导向性溶栓剂。通过聚合酶链式反应（ＰＣＲ），分别从ＳＺ５１的Ｆａｂ片段基因中扩增出ＶＫ和ＶＨ区；从尿激酶原基因中扩增出ｓｃｕＰＡ３２ｋ基因。通过合适的ｌｉｎｋｅｒ及酶切位点，将ＶＫ，ＶＨ及ｓｃｕＰＡ３２ｋ基因相连接并装入表达载体ｐＥＴ５ａ中的ＮｄｅＩ位点，在大肠杆菌中经ＩＰＴＧ诱导表达了重组蛋白。ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔｔｉｎｇ检测到在８ｍｏｌ／Ｌ尿素存在下，该重组蛋白与抗尿激酶的多克隆抗体之间仍有弱的结合反应。表达产物经变复性处理和部分分离纯化后，在纤维蛋白平板上表现有较好的纤溶活性，且这种活性是通过激活纤维蛋白溶酶原为纤溶酶而实现的。重组蛋白纤溶活性的比活达到１７５００ＩＵ／ｍｇ，较好地保留了尿激酶的纤溶活性，重组蛋白的产率约每１００ｇ湿菌为１５ｍｇ。

重组人瘦素的基因构建、表达及活性鉴定

根据NCBI中公布的人瘦素cDNA序列，设计并合成了6个89bp左右的DNA小片段，经重叠延伸PCR扩增获得464bp的rhLep的完整基因片段。构建pET22b（＋）／rhLep表达载体，转化大肠杆菌BL21（DE3），IPTG诱导表达。目的蛋白以包涵体的形式表达，表达量占菌体总蛋白的50％以上。表达产物用Ni^2＋亲和层析柱纯化，SDS-PAGE结果表明，含6×His标签的目的蛋白的相对分子量约16kD。MTT比色法实验显示，当低剂量（10～30ng／mL）时，rhLep具有促进内皮细胞生长的作用；在高剂量（50-225ng／mL）时，rhLep具有杀伤人内皮细胞的活性。其最大杀伤率达到98．8％。吖啶橙荧光染色观察到高剂量rhLep对人内皮细胞有明显的凋亡作用。以上工作为进一步了解瘦素的体内体外生物活性奠定了基础。

重组人脂联素基因构建、表达、纯化及活性鉴定

根据脂联素cDNA序列设计并合成9条寡聚核苷酸片段,经重叠PCR技术获得重组人脂联素基因.构建pET-22b(+)/ADPN表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达.目的蛋白以包涵体的形式表达,表达量占菌体总蛋白的30%以上.表达产物通过Ni-NTA柱纯化,SDS-PAGE分析显示,其分子量约为30 ku,与预期结果一致.内皮细胞生长抑制实验证实,重组人脂联素生理浓度下具有抑制人内皮细胞生长的活性并呈时间依赖性.以上工作为进一步研究脂联素的生物学功能奠定了基础.

EGF-PE35KDEL重组毒素的基因构建及表达

目的 构建表达有特异细胞毒性融合蛋白的工程质粒。方法 利用PCR扩增出PE3 5KDEL基因片段 ,经酶切后插入EGF PET2 8A载体 ,并转化至BL2 1(DE3 )中。采用Westernblot对重组毒素进行鉴定。结果EGF PE3 5KDEL重组毒素占菌体总蛋白的 2 0 % ,分子量约为 410 0 0。结论 EGF PE3

抗PAF单链抗体的基因构建及蛋白质3D模建

构建抗PAF单链抗体的基因并通过计算机模建分析几种不同连接类型的单链抗体空间结构差异 .采用重叠延伸PCR方法扩增了VH和VL基因 ,形成抗PAF的VH Linker VL (ScFv)基因产物 ,并经菌落PCR和测序分析鉴定 ,通过Internet对其 3D结构进行了模建与分析 .研究结果表明 :PCR产物电泳可见一条与目的基因大小一致的片段 ,经菌落PCR和测序分析鉴定 ,抗PAF单链抗体的基因构建成功 ;VH和VL在单链抗体中的顺序对单链抗体

人源抗HER2单链抗体/轻链恒定区/鱼精蛋白截短体融合蛋白的基因构建、表达及活性鉴定

目的:构建人抗HER2单链抗体(ScFv)/人轻链恒定区(Ck)/鱼精蛋白截短体(tP)融合蛋白基因,在大肠杆菌中表达、纯化并分析该融合蛋白的活性.方法:设计引物扩增人抗HER2单链抗体e23sFv基因和轻链恒定区编码序列(Ck),连接成ScFv/Ck片段,人工合成tP序列,连接于ScFv/Ck末端,构建成ScFv/Ck/tP融合基因,将其克隆入原核表达载体pET32a后,在大肠杆菌BL21(DE3)LysS中诱导表达,表达产物经SDS-PAGE和Western Blot鉴定后,用Ni-NTA螯合层析介质纯化.细胞ELISA分析ScFv/Ck/tP融合蛋白抗原亲合活性,凝胶迁移实验检测ScFv/Ck/tP融合蛋白与DNA的结合活性.结果:成功构建了人抗HER2ScFv/Ck/tP融合基因,经IPTG诱导后在大肠杆菌中实现了可溶性表达.表达的ScFv/Ck/tP融合蛋白保持了与抗原的结合活性,同时具有结合DNA的能力.结论:ScFv与Ck,tP融合后,同时具有抗原和DNA结合活性,为该ScFv用于HER2阳性肿瘤的靶向基因治疗奠定了基础.

抗人脑胶质瘤重组免疫毒素SZ39(ScFv)-PE40的基因构建及表达

目的 构建抗人脑胶质瘤重组免疫毒素SZ39(ScFv) PE4 0并在大肠杆菌中表达。方法 从质粒pVC85中克隆出PE4 0基因 ,与抗胶质瘤单链抗体SZ39 ScFv基因进行拼接 ,构建出重组免疫毒素SZ39(ScFv) PE4 0基因 ,并将其克隆于表达载体pET2 0b(+) ,在大肠杆菌Bl2 1(DE3)pLysS中以IPTG诱导表达。结果 SDS PAGE分析显示表达产物主要以包涵体的形式存在 ,分子量为 6 8kD左右 ,与SZ39(ScFv) PE4 0的分子量理论推算值相符 ;Westernblot显示在 6 8kD处出现特异性显色印迹 ;凝胶灰度扫描显示其表达量占菌体总蛋白的 2 0 %。结论 重组免疫毒素SZ39(ScFv) PE4 0可经原核表达载体 ,pET2 0b(+)在大肠杆菌BL2 1(DE3)pLysS中以包涵体形式得到较高效率的表达。

一种新型葡激酶分子的设计基因构建表达纯化及性质研究

在葡激酶构效关系的研究过程中发现 ,葡激酶易形成二聚体 ,甚至多聚体 ,不利于葡激酶的临床应用。为了探究聚合体的形成机制以研制不易聚合的新型葡激酶分子 ,在葡激酶X射线晶体衍射结构模型的基础上 ,采用分子对接软件GRAMMV1 0 3,以高分辨率整体对接方式预测了葡激酶二聚体可能的结合区。结合区主要有两种可能的形成方式 ,通过强疏水相互作用及氢键结合。根据模型设计了旨在降低聚合能力的葡激酶突变体RGD -Sak ,将F1 1 1置换为D1 1 1 ,并且改变K1 0 9为R1 0 9,恰好使分子中形成RGD结构 ,使新型分子还可能具有抑制血小板聚集作用。利用定点突变及DNA重组技术 ,构建了RGD -Sak基因 ,并利用大肠杆菌原核表达系统进行了高效表达。RGD -Sak以包涵体形式存在 ,包涵体经洗涤 ,8mol/L尿素溶解 ,稀释复性 ,离子交换色谱一步分离得到电泳纯的RGD -Sak ,纯度达 95%以上 ,分子量与理论值相符 ,比活性 5× 1 0 4 HU/mg。RGD -Sak与纤溶酶形成的复合物催化纤溶酶原的Km、Kcat值分别为 1 2 40 μmol/L、 0 81s- 1 。RGD -Sak显示了很弱的聚合能力。此研究为研制防止二聚体形成的新型葡激酶分子打下了基础。

番茄LeNCED1基因5′-侧翼序列克隆及LeNCED1p:GUS融合基因构建

从番茄基因组中克隆LeNCED1基因5′-侧翼1456 bp调控序列,经生物信息学分析表明,LeNCED1基因上游调控序列中存在响应昼夜节律的顺式作用元件Circadian、光响应元件Box I、逆境胁迫响应元件(TC-rich repeats)、ABA响应元件ABRE等,构建了LeNCED1基因上游调控序列与报告基因GUS融合的植物双元表达载体pLeNCED1p:GUS。

转基因动物生物反应器的基因构建与表达

近年来,生物学和分子生物学研究领域的成就促进了转基因动物生物反应器的蓬勃发展。用转基因动物生物反应器生产药用蛋白是生物技术领域里的又一次革命,它以一个全新生产珍贵药用蛋白的模式区别于传统药物的生产。本文着重介绍转基因动物生物反应器的基因构建以及转基因动物组织特异性表达的最新进展。

谷胱甘肽过氧化物抗体酶ScFv的基因构建

特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株５Ｃ９所分泌的ＭｃＡｂ经化学修饰后，其抗体酶活性比兔肝谷胱甘肽过氧化物酶活性高２．６倍。在所建成的杂交瘤细胞株基础上，通过提取该细胞总ＲＮＡ，分离ｍＲＮＡ，反转录合成ｃＤＮＡ，以及ＶＨ和ＶＬ基因的ＰＣＲ扩增、组装，成功地构建了谷胱甘肽过氧化物抗体酶ＳｃＦｖ基因。电泳分析证明，ＶＨ和ＶＬ基因长度分别为３４０ｂｐ和３２５ｂｐ；所构建的ＳｃＦｖ基因长度约为７５０ｂｐ，并带有ＳｆｉⅠ和ＮｏｔⅠ切点，可用于ＳｃＦｖ的基因重组及其表达。

抗凝活性肽RGD226基因构建、表达、产物纯化及活性分析

通过PCR法 ,将来源于蛇毒蛋白质eristostatin中的一段含有RGD(Arg Gly Asp)序列的十三肽(SRVARGDWNDDYS)的基因 ,以一个无胰岛素活性但保留天然免疫原性的胰岛素原突变体(PJG4 0 1)基因为模板 ,置换其B2 8和A1位之间的连接肽基因 ,构建成了能展示RGD功能序列的人源化分子 (RGD2 2 6 )的基因 .通过该基因在大肠杆菌中的表达、产物分离纯化 ,得到高纯度RGD2 2 6 .该RGD肽对由ADP诱导的体外人血小板聚集的半抑制浓度IC50 为 2 2 3μmol L .其胰岛素免疫活性是PJG4 0 1的 15 1% ,提示其在一定程度上保留了胰岛素原的免疫原性 .其受体结合活性不到PJG4 0 1的 0 1% ,说明其胰岛素的生物活性基本丧失 .动物实验证实 ,RGD2 2

Glypican3 N端融合基因构建及鉴定

目的构建人磷酯酰肌醇蛋白聚糖3(glypican3,GPC3)N端融合基因。方法采用RT-PCR技术,从人肝癌细胞株HepG2 mRNA中扩增GPC3 N端基因片段,经双酶切后,T4DNA连接酶将此片段定向连接至质粒pcDNA 3.1,并转化大肠埃希菌DH5α,增菌培养后提取质粒并PCR扩增、酶切鉴定及序列测定。结果GPC3 N端基因片段正确插入质粒pcDNA 3.1,片段大小及序列正确。结论成功构建重组质粒pcDNA 3.1-GPC3 N。

邯郸市文化基因谱系构建及传承路径研究

伴随着我国城市发展由大拆大建转向存量更新,城市文化问题日益凸显,在城市更新过程中如何树立城市特色,延续城市文脉是新时代中国城镇化面临的极大挑战。为推进城市更新发展,筛选邯郸各个时期产生的文化基因,按其物质形态划分为显性与隐性,再对文化类型的功能价值进行划分,包括主体基因、附着基因和混合基因,并建构文化基因谱系图,提出传承路径,以实现地域特色的传承。希望促进邯郸城市更新过程中的多元文化基因传承,使其能够在历史传承中实现当代发展。

LGALS3BP 3’UTR荧光素酶报告基因载体构建及鉴定

目的构建LGALS3BP(lectin,galactoside-binding,soluble,3 binding protein,LGALS3BP)基因3’非编码区(3’-untranslated region,3’UTR)的野生型及突变型荧光素酶报告基因重组载体并进行鉴定,以备进一步研究miRNA对LGALS3BP基因的调控。方法Targetscan软件预测LGALS3BP 3’UTR上的miRNA结合位点;以人肝癌细胞系SMMC-7721基因组DNA为模板,进行PCR扩增,获得野生型LGALS3BP基因3’UTR片段,经双酶切将目的片段定向插入报告基因载体pGL3-Control中,将克隆好的重组载体转化大肠埃希菌DH5α感受态细胞进行扩增,采用菌落PCR及测序监定重组子。设计位点突变型LGALS3BP 3’UTR扩增引物,以构建的野生型LGALS3BP 3’UTR重组质粒为模板,采用重叠PCR及定点突变PCR技术进行扩增分别构建单独位点及双位点突变型重组荧光素酶报告基因载体。结果野生型LGALS3BP 3’UTR重组质粒经菌落PCR鉴定,可见871 bp的目的基因片段,大小与预期相符;测序结果表明,插入序列与LGALS3BP 3’UTR序列完全一致且插入方向正确。Targetscan软件预测到LGALS3BP 3’UTR区有两个感兴趣的miRNA结合位点。突变型LGALS3BP 3’UTR重组质粒测序鉴定结果表明,单独位点及双位点突变型重组质粒中均成功引入结合位点突变。结论成功构建LGALS3BP的3’UTR野生型(pGL3-LGAL-W-3’UTR)、两个单独位点突变型(pGL3-LGAL-M1-3’UTR和pGL3-LGAL-M2-3’UTR)及双位点突变型(pGL3-LGAL-M-3’UTR)重组荧光素酶报告基因载体,为后续研究miRNA对LGALS3BP基因的调控奠定基础。

DREB1A基因植物表达载体的构建

以 p Bch质粒为基础 ,构建了分别由 35 s启动子、 rd2 9A启动子调控的 DREB1A基因双子叶植物表达载体p BD35 s、p BD2 9A,其植物选择标记为新霉素磷酸转移酶基因 (N PT ) ,适用于双子叶植物的遗传转化。以 p CU质粒为基础 ,构建了分别由 E12启动子、 rd2 9A启动子调控的 DREB1A基因单子叶植物表达载体 p CDE12、p CD2 9A,其植物选择标记为乙酰 Co A转移酶基因 (bar) ,适用于单子叶植物的遗传转化。并分别通过三亲本杂交法和冻融法将重组质粒导入根癌农杆菌 L BA4 4 0 4中 ,为通过农杆菌介导法将

表达禽流感病毒核蛋白基因重组禽痘病毒的构建及其免疫保护性研究

从含有禽流感病毒A/Goose/Guangdong/1/96 (H5N1)核蛋白 (NP)基因的质粒pUCNP中切下NP基因片段 ,将其亚克隆到pSY5 38质粒 ,再将带有痘苗病毒启动子P11的LacZ基因也平端克隆到pSY5 38质粒 ,然后切下同时含有NP及LacZ基因的片段 ,再亚克隆到禽痘病毒载体pSY6 81,从而构建出表达核蛋白基因的重组禽痘病毒转移载体pSY(NP +LacZ)。应用脂质体介导的方法将转移载体转染已感染禽痘病毒S FPV 0 17的鸡胚成纤维细胞 ,在X gal存在的条件下 ,利用蓝白斑筛选、数轮蚀斑纯化以及PCR、Western blot鉴定 ,结果证明 ,获得了能高效表达AIVNP蛋白的重组禽痘病毒rFPV NP。SPF鸡体内的免疫保护试验结果表明 ,它能够诱导机体产生较高水平的NP特异性抗体 ,并对H5N1和H7N1这 2种亚型高致病力禽流感病毒的攻击提供一定的保护。