番茄EBF2基因的克隆、亚细胞定位与遗传转化

为研究番茄EBF2基因的功能,利用RT-PCR技术从番茄果实cDNA中扩增了全长EBF2基因,将其与绿色荧光蛋白(GFP)构建成融合表达载体,在烟草原生质体中进行瞬时表达。结果表明,该基因定位于细胞核内。将该基因定向克隆到植物表达载体pCambia1301,构建成由组成型启动子CaMV35S启动的植物表达载体pCambia1301-EBF2,通过农杆菌介导方法转化MicroTom番茄。经PCR及GUS组织染色检测,外源基因已整合到番茄基因组中。

鸭梨PPO与GFP融合基因的烟草转化及亚细胞定位观察

将鸭梨PPO基因与绿色萤光蛋白GFP基因相融合共同进行遗传转化的方式,对鸭梨多酚氧化酶开展细胞定位研究。通过克隆该酶基因除终止密码子TAA外长度为1 779bp的CDS序列,与绿色荧光蛋白基因重组构建了荧光表达载体pBI121-PPO-GFP,借助农杆菌转化烟草,转基因烟草叶片细胞经激光扫描共聚焦显微镜观察,绿色荧光蛋白荧光与叶绿体自发荧光相重合。结果表明鸭梨多酚氧化酶为叶绿体蛋白质。

华南象草PpCAD基因的亚细胞定位及其在转基因烟草中的异源表达

该研究根据已克隆的华南象草(Pennisetum purpureum cv.Huanan)肉桂醇脱氢酶(CAD)基因PpCAD的cDNA序列,构建亚细胞定位载体pAN580-PpCAD,用PEG介导法转化象草原生质体,以探究PpCAD蛋白在细胞内的定位;同时构建植物过表达载体pBA002-PpCAD,通过农杆菌介导法在烟草中异源表达,以研究PpCAD基因与植物木质素合成的关系。结果显示:(1)PpCAD定位在象草原生质体的细胞质内;(2)过表达载体pBA002-PpCAD转化烟草后获得27株转基因烟草,其中25株PCR鉴定为阳性;(3)半定量RT-PCR检测6株转基因烟草后发现,PpCAD基因在不同植株的表达量存在差异,通过Southern杂交检测后发现该差异与目的基因插入的拷贝数有关;(4)6株转基因烟草和野生型烟草表型上没有明显差异,除目的基因多拷贝插入的植株OEC6外,木质素含量有不同程度的提高,最高比野生型提高了56.50%。研究表明,PpCAD是一个细胞质蛋白,在烟草中过表达PpCAD能够提高植株木质素含量,表明PpCAD基因参与了植物的木质素合成,可用于象草的木质素调控研究。

半矮秆基因BnaA6.rga-ds的亚细胞定位和转基因甘蓝型油菜的鉴定

Bna A6.rga-ds是本研究室从甘蓝型油菜突变体ds-1中图位克隆获得的半矮秆基因,它编码一个功能获得型(gain of function)突变的DELLA蛋白,能够组成型抑制赤霉素信号的转导。蛋白质理化性质的预测显示,Bna A6.rga-ds及其野生型蛋白Bna A6.RGA均为酸性蛋白。将Bna A6.RGA与不同物种同源蛋白的氨基酸序列比对发现,其C端的保守性高于N段。蛋白质结构的预测显示α-螺旋和无规卷曲是其二级和三级结构的主要元件。系统进化分析表明,Bna A6.RGA与十字花科植物拟南芥、小盐芥和荠菜等的同源蛋白具有很高的相似性。BLAST分析表明甘蓝型油菜基因组中共包括4个拷贝的BnaRGA基因。亚细胞定位研究结果显示,Bna A6.RGA及Bna A6.rga-ds均定位于细胞核,它们可能参与下游基因的转录调控。通过农杆菌介导的方法将Bna A6.rga-ds转化甘蓝型油菜品种Westar,获得13株阳性转基因植株,出现明显矮化表型,表明Bna A6.rga-ds基因具有调控油菜株高的能力。

番茄EBF2基因的克隆、亚细胞定位与遗传转化

为研究番茄EBF2基因的功能，利用RT-PCR技术从番茄果实cDNA中扩增了全长EBF2基因，将其与绿色荧光蛋白（GFP）构建成融合表达载体，在烟草原生质体中进行瞬时表达。结果表明，该基因定位干细胞核内。

香蕉MuMADS1基因表达产物的亚细胞定位

MuMADS1是从香蕉果实cDNA文库中筛选分离到的一个MADS-box基因.通过生物信息学分析表明,该基因编码的蛋白可能作为转录因子定位于细胞核中,而且芯片分析表明:该基因在果实成熟早期表达上调,是乙烯的上游调控因子,可能与花的发育、果实发育及成熟相关.为进一步深入研究该基因功能,构建了以绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)为报告基因的融合植物表达载体pCAMBIA1304-MuMADS1.利用基因枪转化法将重组载体转入洋葱表皮细胞瞬时表达,荧光显微镜检测结果表明,该基因表达产物定位于细胞核中,符合转录因子特性.

核桃JrGA2ox基因的克隆、亚细胞定位及功能验证

【目的】GA2-oxidase(GA2ox)是赤霉素合成过程中起负调控作用的一种关键酶,能够催化有活性的赤霉素为无活性的赤霉素,从而对植物生长起到一定的抑制作用。本研究主要对核桃中赤霉素氧化酶基因JrGA2ox进行克隆及功能验证,有利于进一步探究核桃JrGA2ox基因在植物生长和发育过程中,尤其是在植物株高调控中的作用,从而助力于挖掘与利用核桃中更多的优质基因,培育出更多优良的核桃品种。【方法】采用PCR扩增技术,克隆获得核桃JrGA2ox基因的全长编码序列,进一步通过In-Fusion克隆技术构建具有强启动子的35S∷JrGA2ox∷GFP过表达载体;利用BLAST网络在线工具得到其他植物中的JrGA2ox同源氨基酸序列,并对其进行氨基酸同源序列比对和系统进化分析;其后,通过亚细胞定位揭示其发挥功能的场所,进一步利用农杆菌介导法将构建好的过表达载体转化到核桃体细胞胚中,获得JrGA2ox超表达的阳性转化植株,深入分析JrGA2ox基因的生物学特性。【结果】通过基因克隆,得到1条JrGA2ox开放阅读框,其全长为1 056 bp,共编码351个氨基酸,分子量为39.25 kDa。通过比对发现,该基因编码的蛋白序列含有保守2OG-FeII-Oxy蛋白结构域,具有GA2-氧化酶蛋白家族共同的结构特点,表明JrGA2ox属于GA2-氧化酶基因家族。氨基酸进化树比对分析结果显示,核桃JrGA2ox与毛白杨PtGA2ox聚为一个分支。且JrGA2ox蛋白与木本植物川桑MnGA2ox1、西洋梨PcGA2ox、桃PpGA2ox1及苹果MdGA2ox1蛋白序列同源性较高。烟草叶片表皮细胞亚细胞定位分析表明,JrGA2ox是定位于细胞核与细胞膜中的蛋白。对核桃体细胞胚进行基因遗传转化后经荧光检测及PCR验证表明,35S∷JrGA2ox∷GFP过表达载体被成功转入核桃体细胞胚中。阳性再生植株株高与对照苗相比具显著性差异,其平均株高为对照植株的1/2;且其株高与JrGA2ox基因表达量呈负相关。【结论】核桃JrGA2ox蛋白亚细胞定位于细胞核与细胞膜中。JrGA2ox基因调控核桃株高,主要起到负调节作用。阳性基因转化再生植株中JrGA2ox基因的表达量升高,并表现出明显的矮化特征。本研究结果可为进一步分析该基因在核桃生长发育过程中的作用提供技术参考,且为优良的矮化核桃品种选育奠定一定的基础。

野大麦CIPK基因的亚细胞定位

为明确野大麦CIPK基因在植物亚细胞水平上的定位情况,以已知细胞质膜定位的拟南芥AtCBL1基因和液泡膜定位的AtCBL3基因作为参照,构建了这两个基因分别与红色荧光蛋白基因(RFP)融合的植物表达载体(参照载体),以及野大麦CIPK基因与绿色荧光蛋白基因(GFP)融合的植物表达载体(目标载体),利用基因枪转化法将参照载体和目标载体共转化洋葱上表皮细胞,瞬时表达后利用激光共聚焦显微镜进行共定位分析。结果表明,该基因主要定位于细胞膜和细胞核,为进一步深入分析该基因的功能提供了重要依据。

香蕉MuMADS2基因表达产物的亚细胞定位

对已获得的香蕉MuMADS2基因进行生物信息学和芯片分析表明,该基因编码的蛋白可能作为转录因子定位于细胞核中,是乙烯上游的调控因子,参与调控香蕉果实的成熟过程。为进一步研究该基因功能,构建香蕉MuMADS2基因与绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein,GFP)基因融合的植物表达载体pCAMBIA1302-MuMADS2,再利用基因枪转化法将其转入洋葱表皮细胞进行亚细胞定位观察。结果表明:该基因表达产物定位于细胞核中,符合转录因子特性。

马铃薯StHb1蛋白的亚细胞定位

为了研究马铃薯StHb1蛋白的亚细胞定位情况,采用RT-PCR技术克隆到马铃薯StHb1基因cDNA序列,并成功构建了StHb1基因与绿色荧光蛋白基因的融合表达载体pBI121-StHb1-GFP.利用农杆菌介导法将重组载体转化洋葱内表皮细胞,通过荧光显微镜观察融合蛋白的瞬时表达以确定StHb1蛋白在细胞内的分布.结果表明StHb1蛋白主要分布于细胞核中.

番茄愈伤组织的诱导与遗传转化体系的建立

番茄是植物研究领域常用的模式植物之一,番茄高效稳定的遗传转化体系是研究番茄基因生物学功能的基础,但常规番茄遗传转化耗时过长。以番茄愈伤组织为侵染对象,最终获得转基因番茄愈伤组织,可极大地缩短获得番茄转基因材料的时间。本文以番茄Micro-Tom(Solanum lycopersicum cv. Micro-Tom)为实验材料,探索番茄愈伤诱导条件,建立标准的番茄愈伤组织遗传转化体系。结果表明,胚根为外植体、激素配比2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-Dichlorophenoxyacetic acid, 2,4-D)1 mg/L+6-苄氨基腺嘌呤(6-Benzylaminopurine, 6-BA)1 mg/L、蔗糖浓度30 g/L、光照强度3 000 lx为最佳诱导条件。标准番茄愈伤遗传转化体系包括愈伤组织培养、悬浮细胞建立、农杆菌侵染、共培养、抗性愈伤筛选、核酸鉴定等。该实验结果能够为以番茄为研究对象的分子机理研究及其所涉及的免疫沉淀、高通量测序、亚细胞定位等实验提供科研实验材料和方法参考。

油桐叶肉细胞原生质体分离及瞬时转化体系的建立

【目的】探索油桐叶肉细胞原生质体分离的最适条件,建立油桐原生质体的遗传转化体系,使在油桐体内研究自身基因的功能成为可能。【方法】以油桐成熟叶片和组培苗幼叶为材料,通过酶解法成功分离得到油桐叶肉细胞的原生质体并确定最适分离条件。在此基础上,以获得的原生质体为受体系统,建立PEG介导的油桐原生质体基因转化方法。【结果】原生质体分离结果表明,酶解时间对原生质体产量和活性的影响最大,其次是纤维素酶浓度,而离析酶浓度和甘露醇浓度对原生质体产量和活性的影响较小。以成熟叶片为材料分离原生质体的最适条件为纤维素酶浓度1.5%、离析酶浓度1%、甘露醇浓度0.6 mol·L-1、酶解时间12 h,以组培苗幼叶为材料分离原生质体的最适条件为纤维素酶浓度2%、离析酶浓度1%、甘露醇浓度0.7 mol·L-1、酶解时间6 h。为了建立油桐原生质体的瞬时转化体系,通过PEG介导法将拟南芥MGT6基因导入到油桐原生质体中,结果发现MGT6蛋白定位于原生质体质膜,与之前报道的研究结果一致,这表明本研究建立的油桐原生质体转化方法可成功将外源基因导入油桐原生质体并使其表达。【结论】建立油桐成熟叶片和组培苗幼叶叶肉细胞原生质体的高效分离方法,综合考虑取材的便利性和对后续原生质体培养的影响,建议以组培苗幼叶为材料分离原生质体,分离条件为纤维素酶浓度2%、离析酶浓度1%、甘露醇浓度0.7 mol·L-1、酶解时间6 h。在分离得到油桐叶肉细胞原生质体的基础上,本研究建立的PEG介导的原生质体遗传转化方法能以油桐叶肉细胞原生质体为受体,高效地将外源基因导入其中并使外源基因表达。本研究结果不仅可促进油桐基础研究的发展,在通过细胞融合和基因工程手段进行油桐种质创新方面也具有重要意义。

利用植物悬浮培养细胞进行蛋白质快速定位分析的方法

稳定遗传表达分析是一种植物中常用的整体解析基因的方式。有多种转化方式可供选择,也可根据所需要的获得的转基因植物材料选择受体材料。但是由于稳定遗传转化周期较长且大部分材料不适合于进行荧光观察,所以在一些基因的研究中逐渐被瞬时表达分析系统。虽然瞬时表达分析用时短,但是转化效率受到多方面的限制,转化材料无法保存。目前由于植物悬浮培养细胞材料均一,增殖迅速并且可以满足大批量研究需求逐渐成为植物研究中的热点材料。以此同时,在亚细胞定位方面,悬浮培养细胞还是良好的应用材料。采用农杆菌介导法进行植物悬浮培养细胞的转化中方法较为成熟,但是获得纯净的转基因细胞系的转化周期较长。在本研究中针对上述问题我们建立了一种转化时间短,转化效率高的植物悬浮培养细胞稳定遗传转化体系。同时将这个体系应用到基因的亚细胞定位当中进行蛋白质快速定位分析。

‘红满堂’苹果MbbZIP43基因的克隆与功能研究

【目的】为探究碱性亮氨酸拉链(bZIP)转录因子在‘红满堂’苹果花青素代谢中的调控作用。【方法】从‘红满堂’苹果克隆得到一个bZIP基因,分析了其基因及编码蛋白序列特性,利用洋葱表皮细胞瞬时转化确定其编码蛋白亚细胞定位,利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)研究了该基因在不同成熟时期‘红满堂’果实中的表达情况,基于烟草叶片、苹果叶片以及苹果果实瞬时转化研究了其对花青素积累和花青素合成相关结构基因表达的调控作用。【结果】该基因不含内含子,与MdbZIP43(XP_008393381.1)相似度最高,故命名为MbbZIP43。其编码序列长为522 bp,可编码由173 aa组成、含有bZIP_plant_GBF1结构域、定位于细胞核的亲水蛋白。RT-qPCR分析结果显示,随着果实成熟,MbbZIP43在‘红满堂’果实中的表达水平呈“先升后降”的变化趋势,在花后11周的果实中表达量最高。相关性分析显示MbbZIP43基因表达量与总黄酮和花青素含量正相关。瞬时过表达该基因的烟草叶片、苹果叶片和果皮中花青素含量分别提高了17.42%、25.66%和48.99%,过表达MbbZIP43的苹果叶片中花青素合成结构基因CHI、F3'H、DFR和UFGT分别提高了2.27倍、1.84倍、2.39倍和2.89倍;过表达MbbZIP43的苹果果皮中CHI、F3'H、DFR和UFGT分别提高了1.79倍、1.70倍、1.35倍和1.51倍,说明MbbZIP43可以通过上调这些结构基因的表达正调控苹果花青素合成。【结论】MbbZIP43可通过激活花青素合成相关结构基因CHI和UFGT等的表达进而促进花青素的积累。

大豆GmMYB48基因克隆、生物信息学分析及其参与大豆胞囊线虫病抗性功能分析

MYB转录因子在植物生长发育过程中执行重要调控功能。以大豆胞囊线虫3号生理小种(SCN 3)胁迫下大豆抗病品种“东农L-10”和感病品种“黑农37”转录组数据为基础,筛选出MYB家族差异表达基因GmMYB48,克隆GmMYB48基因并进行生物信息学、亚细胞定位、基因表达模式分析及过表达大豆毛状根。结果表明,GmMYB48基因编码蛋白为碱性蛋白,与拟南芥存在共线性关系,在植物中分布广泛;靶基因预测分析发现GmMYB48基因参与大豆对盐、干旱、金属盐离子等逆境胁迫反应;启动子元件分析显示,该基因存在多个环境胁迫响应相关WUN-motif、MYB等启动子元件;烟草叶片瞬时表达表明GmMYB48基因定位于细胞核中;GmMYB48基因转录响应大豆胞囊线虫胁迫,在抗病材料根部转录水平较高。通过发根农杆菌介导的遗传转化获得GmMYB48基因过表达大豆毛状根,过表达毛状根较野生型毛状根中单位面积内线虫数目明显减少,从表型鉴定中鉴定GmMYB48基因参与大豆对胞囊线虫3号生理小种的抗性反应。研究初步探究GmMYB48基因在抗大豆胞囊线虫中的功能,为进一步研究抗大豆胞囊线虫病机制奠定基础。

苹果异戊烯基转移酶基因家族(MdIPTs)的克隆与MdIPT5a功能分析

【目的】克隆苹果(Malus domestica Borkh.)异戊烯基转移酶(isopentenyltransferase,IPT)基因家族MdIPTs,分析MdIPT5a的生理功能,为深入研究MdIPTs在苹果细胞分裂素生物合成途径中的作用和基因的遗传转化提供理论依据。【方法】以‘富士’苹果为试材,利用RACE和苹果基因组信息克隆MdIPTs;利用洋葱表皮和拟南芥原生质体的瞬时表达研究MdIPT5a的亚细胞定位;通过农杆菌介导法遗传转化‘W38’烟草(Nicotiana tabacum cv.Wisconsin 38)过量表达MdIPT5a,RT-PCR鉴定转基因烟草。【结果】克隆了10个MdIPTs的cDNA序列,其中7个编码细胞分裂素生物合成主要途径中的腺苷-IPTs,具有N端的保守结构域GxxGxGK[S,T]序列,分别位于苹果第13、16、3、11、13、16、6号染色体上,命名为MdIPT1a、MdIPT1b、MdIPT3a、MdIPT3b、MdIPT5a、MdIPT5b和MdIPT7a,均无内含子,编码284—370个氨基酸。MdIPT5a-GFP融合蛋白定位于细胞质中,但不定位于质体内。过量表达MdIPT5a的转基因烟草组培苗生根困难、叶片和不定芽增多。【结论】苹果中腺苷-异戊烯基转移酶基因具有成对高度同源现象,与苹果17条染色体起源于9条始祖染色体的同源起源学说相一致,MdIPT5a具有催化合成细胞分裂素的功能。

盐地碱蓬DREB同源基因SsDREB的功能研究

Ss DREB是从盐地碱蓬克隆获得的一个DREB2类转录因子,其表达受高盐和干旱诱导,而对ABA和低温处理反应不明显。本研究将Ss DREB与绿色荧光蛋白(GFP)基因构建融合表达载体并在洋葱表皮细胞中进行瞬时表达,结果表明SsDREB编码蛋白定位在细胞核中;酵母转录激活实验证明,Ss DREB能特异性结合DRE顺式作用元件,并激活下游报告基因的表达;采用农杆菌介导法将Ss DREB基因在35S启动子的驱动下转入烟草中,获得的转基因植株对干旱和盐胁迫抗性均显著提高;为研究Ss DREB过量表达提高转基因烟草抗旱、耐盐能力的分子机制,选取烟草中与提高质膜稳定性、消除活性氧和渗透平衡相关的8个逆境胁迫相关基因,以烟草α-tublin基因做为内参,利用半定量RT-PCR方法分析在正常生长条件下这8个基因在转基因烟草和对照烟草中的表达情况,实验结果表明这8个基因都受外源Ss DREB基因的调控,其中6个基因在转基因烟草中的表达量显著高于非转基因植株。

茎瘤芥BjMYB1两个转录本的克隆与遗传转化研究

本研究根据茎瘤芥转录组测序筛选获得了一个MYB基因片段.通过RACE的方法,克隆得到了两条长度分别为975bp和864bp的全长序列,分析发现可能为茎瘤芥MYB基因的两种不同选择性拼接形式,并命名为BjMYB1-3和BjMYB1-4.对BjMYB1-3和BjMYB1-4做组织表达分析,发现这两个转录本在茎中特异表达.针对BjMYB1-3和BjMYB1-4的亚细胞定位分析,显示BjMYB1-4定位于细胞核,BjMYB1-3部分定位于细胞核.构建BjMYB1-3和BjMYB1-4的超表达载体转化拟南芥,结果显示相比于野生型拟南芥,BjMYB1-3超表达转基因株系生长状态更好,而BjMYB1-4超表达转基因株系没什么明显变化,说明BjMYB1-3在植株的生长发育过程中起着一定作用.

一个与ABA信号通路相关未知基因AB的亚细胞定位研究

本研究通过构建一个与脱落酸(ABA)信号传导途径相关的未知基因AB和绿色荧光蛋白(GFP)编码基因的重组质粒,利用基因枪技术将该重组质粒成功转入洋葱表皮细胞,观察并确定了该基因编码蛋白细胞核和细胞质的亚细胞定位,为进一步研究该未知基因的生物学功能及其分子机制提供了思路.

紫花苜蓿DExD/H box RNA解旋酶基因的克隆与分析

基于紫花苜蓿(Medicago sativa L.)盐胁迫抑制消减杂交文库中的一条EST序列,使用RACE技术克隆得到一条1678bp的cDNA序列。核酸序列分析表明该cDNA序列包含一个1281bp的最大开放阅读框,编码426个氨基酸,与拟南芥(Arabidopsis thaliana)RNA解旋酶RH15和RH56的氨基酸序列相似性在90%以上,将该基因命名为MsRH(GenBank序列号:JX508648)。对此基因编码蛋白进行结构域预测表明其含有明显的DEXDc和HELICc结构域,预测其为DExD/H box RNA解旋酶。洋葱(Allium cepa)表皮细胞亚细胞定位分析表明MsRH定位于细胞核。为进一步研究此基因的功能,构建了MsRH基因的超表达载体pBI-MsRH,使用农杆菌介导法转化烟草(Nicotiana tobacum),筛选得到5株具有卡那霉素抗性再生烟草植株。PCR和RT-PCR检测结果表明MsRH基因成功插入烟草基因组中并表达。使用250mM NaCl处理7d后,转基因烟草中脯氨酸含量低于野生型烟草,而丙二醛和相对电导率则高于野生型烟草。初步试验结果表明转MsRH基因烟草对盐敏感性升高。