水稻瘤矮病毒S11基因沉默抑制子的原核表达及抗血清制备

以采自广东省水稻瘤矮病的典型病株为材料,通过RT-PCR法扩增和克隆了水稻瘤矮病毒(Rice gall dwarf virus,RGDV)S11组分核苷酸序列全长。序列分析结果表明,RGDV广东分离物S11(登录号EF532326)核苷酸序列全长1168bp,含有一个1068bp的开放阅读框,编码一条355个氨基酸的多肽,推测分子量约40kD,与泰国分离物基因结构基本一致,其核苷酸与氨基酸序列相似性分别为94.3%和98.8%。将广东分离物S11基因克隆至pBV221温敏表达载体上,在大肠杆菌DH5α中实现了高效表达。以诱导蛋白为抗原免疫家兔获得了抗血清。利用ELISA法测定抗血清的效价为1∶4096,Western blot分析结果表明,抗血清能与S11蛋白发生特异血清学反应。这可为进一步研究S11蛋白的结构和功能,揭示其抑制基因沉默的作用机制提供参考。

病毒基因沉默抑制子及其作用机制

基因沉默或RNA沉默是植物、真菌以及无脊椎动物抵御病毒侵染的重要机制,为了应对这种机制,病毒编码RNA沉默抑制子抑制宿主的基因沉默,抵抗由基因沉默介导的宿主对病毒的抗性.病毒编码的RNA沉默抑制子,又被称为病毒基因沉默抑制子,广泛存在于各种植物RNA病毒和DNA病毒以及部分动物病毒中.近年来,针对病毒基因沉默抑制子作用机制的研究表明,病毒基因沉默抑制子通过与宿主基因沉默通路中的RNA或者关键蛋白分子相互作用,发挥抑制宿主对病毒的抗性以及干扰宿主正常的基因表达调控的功能.由于植物基因沉默通路的复杂性,病毒基因沉默抑制子的作用机制也是复杂而多样的.

基因沉默抑制子HC-Pro表达载体的构建

RNA沉默广泛存在于植物等大多数真核生物中,能够防御外源基因的入侵和调控基因表达等.然而,基因沉默抑制子HC-Pro蛋白的具体功能的研究并不十分清楚.本文重点介绍了基因沉默抑制子HC-Pro的表达载体pBI121-HC-Pro的构建及HC-Pro基因在烟草(Nicotiana benthamiana)中的稳定表达.并利用半定量RT-PCR技术检测了目的基因HC-Pro的表达,检测结果表明我们获得了HC-Pro基因稳定表达的转基因烟草株系,为进一步深入研究基因沉默抑制子HC-Pro的功能奠定了实验基础.

植物病毒沉默抑制子P25的原核表达及纯化

通过体外DNA重组技术将P25基因连接在pET28a(+)载体上,构建成重组质粒。经PCR扩增、酶切鉴定及DNA序列分析,融合的P25基因序列正确。将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行异丙基-βD硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,经过亲和层析得到纯品目的蛋白P25。

植物病毒混合侵染研究进展

混合侵染是病毒为害作物时存在的一种普遍现象,给农业生产带来严重威胁,并常造成重大的经济损失。目前,已报道了多种病毒混合侵染的相关研究。本文综述了近年来对植物病毒混合侵染现象以及内在机制的研究现状,从基因沉默抑制子、小RNA、进化博弈等方面探讨了影响植物病毒混合侵染的因素,以期为病毒病害的有效防控提供依据。

农杆菌介导的pCB302-3载体在本氏烟中瞬时表达条件优化

以GFP为报告基因构建植物表达载体pCB302-3-GFP,采用农杆菌叶片注射法对其在本氏烟叶片中瞬时表达条件进行优化。分析基因沉默抑制子p19、菌液不同浓度以及侵染时间对GFP荧光强度的影响,结果显示,当农杆菌菌液D600为0.8-1.0并与含有p19基因的载体共注射条件下,农杆菌注射3-5d后本氏烟草叶片表现出很强的绿色荧光,实现了GFP在本氏烟草中的高效瞬时表达。

三种葡萄病毒的RT-PCR检测和系统进化分析

【目的】为了研究不同葡萄病毒病快速检测方法和四川分离株系统进化,【方法】比较3种葡萄总RNA提取方法,还优化了葡萄病毒病的RT-PCR检测方法。分别克隆了3种病毒四川分离株的部分基因组区域,并开展了系统进化分析。【结果】结果表明,改进硅胶颗粒吸附法快速从葡萄枝条的韧皮组织中提取了总RNA,并以葡萄18SRNA为内参基因,RT-PCR分别成功扩增出3种病毒的目的片段。把16个地理起源的GLRaV-2分离株的外壳蛋白基因(Coat protein,CP)分成5个系统进化组。而7个地理起源的GVB分离株CP同源性为79.1%～98.7%。此外,5个GVA四川分离株分别位于系统进化树的4个聚类群。【结论】GLRaV-2、GVB和GVA不同地理起源的分离株在核酸水平上具有变异性,其中GVA四川分离株之间具有显著的遗传差异,可能包括4种株系。

植物中RNA沉默机制的研究进展

近年来,人们对植物中RNA沉默机制的的认识日渐清晰,小RNAs在其中发挥重要作用.文章综述了植物中RNA沉默的机制、RNA沉默的主要途径及其在防御外源DNA序列入侵过程中的主要功能.并简要介绍了由DNA病毒编码的基因沉默抑制子在对抗宿主沉默反应的作用.文章最后阐述了对RNA沉默进行深入研究的必要性,对需要研究的问题进行了分析,为抗病毒作物育种提供了有力依据.

葡萄卷叶伴随3型病毒和葡萄A病毒的多重检测及其系统进化分析

葡萄卷叶伴随3型病毒(Grapevine leafroll associated virus-3,GLRaV-3)和葡萄A病毒(Grapevine virus A,GVA)常常复合侵染部分主栽欧美杂交葡萄品种。以半定量RT-PCR与qRT-PCR方法研究了‘希姆劳特’葡萄(Vitis vinifera L.×V.labrusca L.‘Himrod’)中不同组织内病毒的相对积累量,结果表明叶脉和韧皮部内的病毒相对积累量显著高于其他组织。以成熟枝条韧皮部组织的cDNA为模板,优化了RT-PCR多重扩增体系,可以同时扩增待测样本中两种病毒的目标基因。从一株复合感染GLRaV-3与GVA的‘藤稔’葡萄(Vitis vinifera L.×V.labrusca L.‘Fujiminori’)中,分别克隆了GLRaV-3外壳蛋白(coat protein,CP)基因全长序列和GVA部分基因组区域序列,后者包括CP基因的部分序列与病毒RNA沉默抑制子(viral suppressor of RNA silencing,VSR)基因全长序列。病毒核酸同源性分析与系统进化研究表明,不同GLRaV-3分离物的CP高度保守;而‘藤稔’葡萄的GVA分离物包含多种变异株,具有准种病毒的特点。